Os níveis de expressão de mRNA de plasma de BRCA1 e TS como potenciais biomarcadores preditivos de quimioterapia no câncer gástrico

Os níveis de expressão de mRNA de plasma de BRCA1 e TS como potenciais biomarcadores preditivos de quimioterapia no cancro gástrico
personalizado Resumo Objetivo
quimioterapia com base em biomarcadores preditivos pode maximizar a eficácia. No entanto, o tecido tumoral obtido no momento do diagnóstico inicial não vai reflectir alterações genéticas observados no momento da progressão da doença. Examinamos se os níveis de mRNA de plasma pode ser um substituto para níveis de tumor na previsão quimio-sensibilidade.
Métodos Online em 150 pacientes com câncer gástrico, os níveis de mRNA de BRCA1 e TS foram avaliados no plasma e emparelhado tecido tumoral. O U-teste de Mann-Whitney foi utilizado para comparar os níveis de expressão de mRNA entre amostras de tumores que exibem in vitro
sensibilidade ou resistência a docetaxel e pemetrexed. Todos os testes estatísticos foram bilaterais

Resultados Foram encontradas correlações significativas entre os níveis plasmáticos e de mRNA tumor de BRCA1 (rho = 0,696, P < 0,001). E TS (rho = 0,620, P < 0,001). níveis BRCA1 em plasma (sensível ao docetaxel: 1,25; docetaxel resistente: 0,50, P Art < 0,001) e tumor (docetaxel sensível: 8,81; docetaxel resistente: 4,88, P Art < 0,001) foram positivamente associada com sensibilidade docetaxel. níveis de TS no plasma (sensível pemetrexed-: 0,90; pemetrexed resistente: 1,82, P Art < 0,001) e tumor (pemetrexed e minúsculas: 6,56; pemetrexed resistente: 16,69, P Art < 0,001) foram negativamente associado com sensibilidade pemetrexed.
Conclusões
níveis de expressão de mRNA Plasma espelhar os do tumor e pode ter um papel promissor como potenciais biomarcadores preditivos de quimioterapia.
Palavras-chave
Plasma mRNA gástrica câncer Chemosensitivity Predictive biomarcador HDRA Introdução
O regime de quimioterapia de primeira linha padrão para câncer gástrico localmente avançado ou metastático é cisplatina ou oxaliplatina combinado com outras drogas, incluindo docetaxel e pemetrexed [1], [2]. No entanto, a sobrevida mediana permanece escassa - cerca de um ano. Não existe uma abordagem padrão para a terapia de segunda linha existe, embora docetaxel tem mostrado alguma atividade [3]. quimioterapia personalizada baseada na expressão do mRNA de biomarcadores preditivos poderia ajudar a maximizar a eficácia do tratamento e prolongar a sobrevivência nestes doentes [3] - [8].
gene de suscetibilidade ao câncer de mama 1 (BRCA1), um componente essencial em múltiplos de reparação de danos ao DNA e vias vias envolvidas em respostas celulares ao dano dos microtúbulos, é considerado como sendo um modulador diferencial de sobrevivência com a cisplatina e taxanos. Estudos pré-clínicos e clínicos reportaram que o nível de BRCA1 de tumores está associado com a cisplatina e taxanos quimiossensibilidade. Tumor com elevada expressão de BRCA1 é 800 para mais do que 1000 vezes sensíveis ao docetaxel, mas 10-1000 vezes resistentes à cisplatina [4]. Temos anteriormente observado que os níveis de mRNA BRCA1 em efusões foram negativamente associado com sensibilidade de platina, mas positivamente associada com a sensibilidade docetaxel em pacientes com câncer gástrico [5]. Estes resultados foram validados em pacientes que receberam gástricas de segunda linha docetaxel: sobrevida mediana foi de 9,5 meses em que aqueles com níveis baixos de BRCA1 em tumor primário, 19,1 naqueles com níveis intermediários e de 25,8 meses nos doentes com níveis elevados (P = 0,006
) [3]. O pemetrexed é um novo tipo de análogo quinazolina folato solúvel em água, age como um inibidor da timidilato-sintase directo e específico (TS). Baixa expressão da timidilato-sintase (TS) foi avaliado para ser associada com a resposta à terapia baseada em pemetrexed no cancro do pulmão [7], [8]. O tecido tumoral
é a principal fonte de exame biomarcador no presente. No entanto, o tecido tumoral pode às vezes ser insuficiente para análise da expressão gênica. Além disso, o tecido tumoral obtido no momento do diagnóstico inicial pode não reflectir alterações genéticas observados no momento da progressão da doença [9], desde metastáticos e tumores primários do mesmo paciente pode variar a níveis genómicas, epigenética e transcriptomic [9] - [ ,,,0],13]. Além disso, a quimioterapia inicial em si pode alterar os níveis de expressão de genes [14], [15]. Circulantes ácidos nucleicos isentos de células tumorais poderia, assim, ser uma ferramenta útil, não invasivo para controlar alterações durante o curso do tratamento [10], obviando a necessidade de um re-biópsia no momento de determinar o melhor tratamento. Além disso, ele pode ser um substituto útil quando apenas uma pequena quantidade de tecido de tumor disponível. A nossa experiência anterior no cancro do pulmão demonstrou que do receptor do factor de crescimento epidérmico (EGFR) mutações no soro poderia ser um bom marcador preditivo para pacientes com câncer de pulmão tratados com inibidores da tirosina-cinase EGFR [16]. Além disso, plasma TS mRNA pode ser detectada de forma não invasiva no sangue antes da cirurgia e do nível de plasma TS expressão tinha um grande potencial como biomarcadores preditivos de sensibilidade raltitrexed no câncer gástrico [17]. Até à data, no entanto, pouco se sabe sobre o uso potencial de mRNA plasma para a previsão de quimio-sensibilidade de docetaxel e pemetrexed. Além disso, embora o ARN libertado em circulação é estável [10], [18], com os métodos actualmente disponíveis, apenas uma pequena quantidade de ARNm pode ser obtido a partir de plasma ou soro, o que limita tanto a eficácia de extracção de ARNm e a consistência de ensaios de ARNm [10].
no presente estudo, nós adoptado um método prático e conveniente para a detecção de ARNm de plasma, baseado na purificação de ARN e RT-PCR quantitativo (qRT-PCR), e usado este método para se examinar os níveis de mRNA de plasma pode ser um substituto para níveis de tumor na previsão de quimio-sensibilidade -. pela primeira vez em um estudo piloto com 40 pacientes e, em seguida, em uma coorte de 150 pacientes
Materiais e métodos
pacientes
de outubro de 2010 a julho de 2011, 150 recém- -removed tumores gástricos e amostras de sangue emparelhados dos mesmos pacientes foram obtidos do Departamento de Oncologia e Cirurgia Geral, Drum Tower Hospital, Nanjing, China. Todos os pacientes não receberam nenhuma quimioterapia antes da cirurgia. A tumores e amostras de sangue fresco gástrica foram mantidos a 4 ° C e enviadas para o laboratório dentro de 15 minutos após a colheita.
O estudo foi aprovado pelo Institutional Review Board Ética da Drum Tower Hospital filiado à Faculdade de Medicina da Universidade de Nanjing, e consentimento informado por escrito foi fornecido por todos os pacientes. Todos os experimentos com animais foram realizados de acordo com a Comissão de Coordenação chinesa sobre os Regulamentos de investigação do cancro para o Bem-Estar dos Animais ea Lei de Proteção Animal. Todas as análises, incluindo o teste de sensibilidade às drogas, análise e animais experimentos de expressão gênica, foram realizadas por diferentes investigadores a título individual, sem o conhecimento dos resultados das outras análises.
Estudo projeto
Nós primeiro realizado um estudo piloto em 40 pacientes (Figura 1A). Para cada amostra de tumor, sensibilidade à docetaxel e pemetrexed foi examinada in vitro
pelo ensaio de resposta à droga histocultura (HDRA) [19] e in vivo
por xenotransplantes em modelos de ratos imunodeficientes [20] (arquivo adicionais 1: Figura S1 , AB disponível on-line). Além disso, ambos os xenoenxertos de ratinho e as amostras de tumor frescas originais foram fixados em formalina e (FFPE) para a análise da expressão de ARNm de BRCA1 e TS embebidos em parafina. BRCA1 e expressão de TS também foi analisada em amostras de sangue emparelhados. Figura 1 Fluxograma mostrando disposição e experiências paciente executada. estudo piloto em 40 pacientes (A) e coorte total de 150 pacientes com câncer gástrico (B).
Com base nas conclusões do estudo-piloto, que se comprometeu a validar nossas descobertas na coorte total de 150 pacientes com câncer gástrico (Figura 1B ). Nesta coorte, os mesmos procedimentos foram realizados, com a excepção de o teste in vivo
de quimiossensibilidade. Os níveis de mRNA no plasma e tecidos tumorais FFPE de BRCA1 e TS foram avaliadas e o teste U de Mann-Whitney foi utilizado para comparar os níveis de expressão de mRNA entre amostras de tumores que exibem in vitro
sensibilidade ou resistência a docetaxel e pemetrexed.
para obter detalhes completos de toda a metodologia, ver arquivo adicionais 1, disponível online.
In vitro
quimio-sensibilidade no estudo piloto e toda a coorte
tecidos tumorais frescas foram enviadas para o laboratório em 4 ° C Hanks equilibrada solução de sal com 1% de penicilina /estreptomicina. As amostras foram lavadas com solução salina equilibrada de Hanks 'e duas vezes picado em pedaços pequenos de cerca de 10 mg, que foram então colocados sobre superfícies de colagénio preparada em 24 microplacas. As placas foram incubadas durante 7 dias a 37 ° C na presença de fármacos dissolvidos com meio RPMI 1640 contendo soro de vitelo fetal a 20% e mantidas numa atmosfera humidificada contendo 95% de ar-5% de CO 2. As concentrações de droga foram de 100 ug /ml para o docetaxel [21], e 400 ug /ml para o pemetrexed [7]. HDRA procedimentos foram realizados tal como relatados por Furukawa e colaboradores [19], com ligeiras modificações. A taxa de inibição foi calculada utilizando a seguinte fórmula: Taxa de inibição (%) = (1-T /C) x 100, em que T é a absorvância média de tumor tratado /peso e C é a absorvância média dos tumores de controlo /peso. Todas as amostras foram classificadas em grupos sensíveis e resistentes, utilizando o método
valor mínimo P, modificado pelo Lausen e Schumacher [22].
In vivo
quimio-sensibilidade no estudo piloto
Cada tumor cirúrgica recém-removido tecido foi cortado em pedaços de 3 x 3 x 3 milímetros 3, que foram transplantadas dentro de 30 minutos a 9-18 ratinhos imunodeficientes atímicos, denominado um "painel". Em cada painel, quando o tumor cresceu até um tamanho de 50-100 mm 3, ratinhos com xenoenxertos foram distribuídos aleatoriamente para tratamento com docetaxel 15 mg /kg /d, IP ou pemetrexed 20 mg /kg /d, IP ou nenhuma tratamento (controlo). Os volumes tumorais individuais (V) foram calculadas pela fórmula "V = (comprimento x largura x largura) /2" e comparados com os valores no início do tratamento para se obter o volume relativo do tumor. Medianos valores tratados-a-controle de volume de tumor relativamente foram chamadas de "taxa de inibição in vivo
" e foram utilizados para avaliar a sensibilidade ao docetaxel ou pemetrexed. Expressão de mRNA
no estudo piloto e toda a coorte of Two mililitros de sangue foram recolhidas em tubos de EDTA antes da cirurgia, foi mantida a 4 ° C e enviadas para o laboratório no prazo de 15 minutos. O ARN total a partir de plasma foi extraído com Trizol LS e clorofórmio, e purificou-se com o ARN PureLink Mini Kit (Ambion, Carlsbad, CA, EUA). O ARN total a partir de tecidos tumorais FFPE foi extraído de acordo com um processo patenteado (Patente Europeia número EP1945764-B1). Após extracção de ARN e a purificação, M-MLV Transcriptase Reversa Kit (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA) foi utilizado para gerar ADNc de Q-PCR para detectar a expressão de β-actina (ACTB - utilizado como controle endógeno) e os genes examinados . Cada lote de reacção incluído um controlo positivo de comercial de pulmão humano e ARN do fígado (Stratagene, La Jolla, CA, EUA) como calibradores e controlos negativos sem ARN e transcriptase inversa. Molde de ADNc foi amplificado com os iniciadores e sondas específicas usando Taqman Universal Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA). quantificações de expressão génica relativos foram calculados de acordo com o método comparativo Ct. Os resultados finais foram determinados pela expressão de mRNA fórmula level = 2 - △△ Ct [6], [23] e foram analisados ​​com o software Stratagene
Reprodutibilidade e estabilidade do ensaio de expressão genética em plasma
. a reprodutibilidade do ensaio de expressão do gene foi testado simultaneamente com dois métodos. Para o primeiro método, amostras de sangue de cinco pacientes foram coletadas a partir do primeiro dia do quinto dia anterior à cirurgia, ao mesmo tempo cada dia. Durante este período, os pacientes receberam nem quimioterapia nem tratamento especial. Os níveis de expressão de genes (alta /intermediários vs baixo) foram determinados para cada amostra, e a percentagem de resultados idênticos foi calculada para cada paciente. Para o segundo método, o sangue foi colhido uma vez por um período adicional de dez pacientes, e cada amostra foi dividida em cinco aliquotas. Os níveis de expressão de genes (alta /intermediários vs baixo) foram determinados para cada alíquota, e a percentagem de resultados idênticos foi calculada para cada paciente. A taxa de reprodutibilidade foi definido como a média de todas as 15 percentagens (5 pacientes a partir de um método e de 10 pacientes de dois método).
De modo a testar a estabilidade das amostras de sangue, alíquotas de plasma diferentes da mesma amostra foram preparadas sob condições distintas. As alíquotas foram incubadas à temperatura ambiente ou em gelo durante 30 min, 1 h, 1,5 h ou 2 h. qRT-PCR foi então realizada, e os valores ΔCt matérias de gene diferente foram comparados com o protocolo padrão (ΔCt = Ct gene-Ct ACTB) analisa
. Statistical of the Mann-Whitney U- teste eo teste de Kruskal-Wallis foram usados ​​para testar as associações entre os níveis de mRNA e características clínicas e entre a sensibilidade para cada agente quimioterapêutico e características clínicas. O teste de correlação de Spearman para avaliar a correlação entre in vivo e in vitro

taxas de inibição e entre os níveis plasmáticos e expressão de mRNA tumor. O U-teste de Mann-Whitney foi utilizado para comparar os níveis de expressão de mRNA entre amostras de tumores que exibem in vitro
sensibilidade ou resistência a docetaxel e pemetrexed. Receptor características operacionais (ROC) foram construídas para avaliar a sensibilidade, especificidade e respectivas áreas sob as curvas (AUCs) com seus intervalos de confiança de 95% (IC). Investigamos o valor de corte otimizado para previsão, maximizando a soma de sensibilidade e especificidade e minimizando o erro global (raiz quadrada da soma [1-sensibilidade] 2 + [cidade 1-específi] 2) e minimizando a distância do valor de corte para o canto superior esquerdo da curva ROC [24]. Todos os testes estatísticos foram em frente e verso, e significância foi estabelecido em P Art < 0,05 (frente e verso). Todas as análises foram realizadas usando SPSS, versão 16.0.

Resultados Características de todos os pacientes são apresentados na Tabela 1. A maioria dos pacientes eram do sexo masculino (73,3%), e a histologia predominante foi o adenocarcinoma. Noventa e quatro (62,7%) pacientes apresentavam doença estágio III da doença. metástases linfáticas, estavam presentes em 115 (76,7%) patients.Table 1 Características dos pacientes
estudo Característica Pilot
total de coorte *
N = 40

N = 150
N (%)
N (%)
Idade, anos, mediana (intervalo)
63 (40-83)
64 (29-84)
Sexo Masculino

31 (77,5)
110 (73,3)
9 (22,5) Feminino
40 (26,7)
O sítio do tumor
estômago distal
12 (30,0)
57 (34,0)
estômago proximal
19 (47,5)
62 (41,3)
estômago inteiro de 9 (22,5)
37 (24,7)
Stage
I
4 (10,0)
17 (11,3)
II
9 (22,5)
34 (22,7)
III
25 (62,5)
94 (62,7)
IV
2 (5.0)
5 (3.3)
grau histológico
1

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