Plasma-mRNA-Expression von BRCA1 und TS als potentielle prädiktive Biomarker für die Chemotherapie bei Magen cancer

Plasma mRNA Expression von BRCA1 und TS als potentielle prädiktive Biomarker für die Chemotherapie bei Magenkrebs
Zusammenfassung
Ziel | Personalized Chemotherapie basierend auf prädiktiven Biomarker können die Wirksamkeit zu maximieren. Jedoch zum Zeitpunkt der Erstdiagnose erhaltenen Tumorgewebe nicht zur Zeit der Krankheitsprogression beobachtet genetischen Veränderungen zu reflektieren. Wir untersuchten, ob Plasma-mRNA-Spiegel bei der Vorhersage Chemosensitivität ein Surrogat für die Tumorspiegel sein kann.
Methoden
150 Magenkrebs-Patienten, mRNA-Spiegel von BRCA1 und TS wurden im Plasma bewertet und Tumorgewebe gepaart. Der Mann-Whitney-U-Test wurde verwendet, um mRNA-Expressionsniveaus zwischen Tumorproben zeigen in vitro
Empfindlichkeit oder Resistenz gegen Docetaxel und Pemetrexed vergleichen. Alle statistischen Tests wurden zweiseitig
Ergebnisse
signifikante Korrelationen zwischen Plasma und Tumor-mRNA-Spiegel von BRCA1 (rho = 0,696, P < 0,001) waren. Und TS (rho = 0,620, P < 0,001). BRCA1-Spiegel im Plasma (Docetaxel sensitiv: 1,25; Docetaxel-resistenten: 0.50, P
< 0,001) und Tumor (Docetaxel sensitiv: 8,81; Docetaxel-resistant: 4,88, P
< 0,001) waren positiv mit Docetaxel Empfindlichkeit verbunden. TS-Spiegel im Plasma (Pemetrexed sensitiv: 0,90; Pemetrexed-beständig: 1.82, P
< 0,001) und Tumor (Pemetrexed sensitiv: 6,56; Pemetrexed-resistant: 16.69, P
< 0,001) waren negativ im Zusammenhang mit Pemetrexed Empfindlichkeit.
Schlussfolgerungen
Plasma-mRNA-Expression Ebenen die in der Tumor Spiegel und eine vielversprechende Rolle als potentielle prädiktive Biomarker für die Chemotherapie haben können.
Schlüsselwörter Plasma mRNA Magenkrebs Chemosensitivity Predictive Biomarker HDRA Einführung
Die Standard-First-Line-Chemotherapie für lokal fortgeschrittenem oder metastasiertem Magenkrebs ist Cisplatin oder Oxaliplatin Kombination mit anderen Drogen, einschließlich Docetaxel und Pemetrexed [1], [2]. Allerdings mediane Überlebenszeit bleibt dürftig - etwa ein Jahr. Kein Standardansatz für die Second-Line-Therapie existiert, obwohl Docetaxel eine gewisse Aktivität gezeigt hat [3]. Personalisierte Chemotherapie auf der Basis der mRNA-Expression von prädiktiven Biomarkern könnte dazu beitragen, die Wirksamkeit der Behandlung und verlängern das Überleben bei diesen Patienten [3] zu maximieren -. [8] Brustkrebs Suszeptibilitätsgens 1 (BRCA1), eine wesentliche Komponente in mehreren DNA-Schäden zu reparieren
Wege und Pfade in zellulären Reaktionen auf Mikrotubuli Schäden beteiligt sind, wird als ein Differential-Modulator des Überlebens mit Cisplatin und Taxanen zu sein. Präklinische und klinische Studien haben berichtet, dass BRCA1 Niveau der Tumor mit Cisplatin und Taxanen Chemosensitivität verbunden ist. Tumor mit hoher Expression von BRCA1 800 zu mehr als 1000-fach empfindlicher auf Docetaxel, aber 10-1000-fach resistent gegen Cisplatin [4]. Wir haben bereits festgestellt, dass BRCA1-mRNA-Spiegel in Ergüssen negativ mit Platin Empfindlichkeit assoziiert waren aber positiv mit Docetaxel Empfindlichkeit bei Patienten mit Magenkrebs assoziiert [5]. Diese Ergebnisse wurden in Magenpatienten validiert Empfang Second-Line-Docetaxel: mediane Überlebenszeit 9,5 Monate bei Patienten mit niedrigem BRCA1 Ebenen in Primärtumor war, 19.1 in denen mit Zwischenstufen und 25,8 Monate bei Patienten mit einem hohen Grad (P
= 0,006 ) [3]. Pemetrexed ist eine neue Art von wasserlöslichen chinazolin Folsäure-Analogon, wirkt als eine unmittelbare und spezifische Thymidylat-Synthase (TS) Inhibitor. Niedrige Expression von Thymidylat-Synthase (TS) wurde berichtet, dass mit dem Ansprechen auf Pemetrexed-basierte Therapie bei Lungenkrebs [7], [8].
Tumorgewebe ist die wichtigste Quelle für die Biomarker-Prüfung zur Zeit in Verbindung gebracht werden. Doch manchmal Tumorgewebe kann zur Genexpressionsanalyse unzureichend sein. Darüber hinaus kann nicht reflektieren zum Zeitpunkt der Erstdiagnose erhaltenen Tumorgewebe genetische Veränderungen bei der Progression der Erkrankung beobachtet, [9], da metastatic und primären Tumoren des gleichen Patienten zu genomischen, epigenetischen und transkriptomischen Niveaus variieren kann [9] - [ ,,,0],13]. Außerdem, initial Chemotherapie kann selbst Genexpressionsniveaus [14], [15] zu verändern. Zirkulierende Tumorzellfreien Nukleinsäuren könnten somit ein nützliches, nicht-invasive Werkzeug zum Verfolgen von Änderungen während des Verlaufs der Behandlung sein [10], so dass kein Bedarf für eine erneute Biopsie bei der die beste Behandlung zu bestimmen. Darüber hinaus kann es zu einem nützlichen Surrogat sein, wenn nur eine kleine Menge von Tumorgewebe zur Verfügung steht. Unsere bisherigen Erfahrungen bei Lungenkrebs gezeigt, dass epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptor (EGFR) Mutationen im Serum ein guter prädiktiver Marker für Lungenkrebs-Patienten-Hemmer erhalten EGFR-Tyrosinkinase sein könnte [16]. Darüber hinaus kann Plasma TS mRNA vor der Operation erfasst nicht-invasiv im Blut und das Expressionsniveau von Plasma-TS hatte ein großes Potenzial als prädiktiver Biomarker für Raltitrexed Empfindlichkeit bei Magenkrebs [17]. Bis heute ist jedoch wenig über die mögliche Verwendung von Plasma-mRNA bekannt für Chemosensitivität von Docetaxel und Pemetrexed vorherzusagen. Darüber hinaus, obwohl RNA in die Zirkulation freigesetzt stabil [10], [18], mit den derzeit verfügbaren Methoden, nur eine geringe Menge von mRNA kann aus Plasma oder Serum erhalten werden, die sowohl die Wirksamkeit der mRNA-Extraktion und die Konsistenz von mRNA Assays begrenzt [10]. In der vorliegenden Studie
verabschiedeten wir eine praktische und bequeme Methode zur Detektion Plasma mRNA, auf Basis der RNA-Reinigung und quantitativen RT-PCR (qRT-PCR), und verwendet, um dieses Verfahren, ob der Plasma-mRNA zu untersuchen einen Ersatz für die Tumorniveaus sein Chemosensitivität bei der Vorhersage -. zunächst in einer Pilotstudie von 40 Patienten und dann in einer Gesamtkohorte von 150 Patienten
Materialien und Methoden
Patienten
von Oktober 2010 bis Juli 2011 150 frisch -removed Magentumoren und gepaart Blutproben von den gleichen Patienten wurden aus der Abteilung für Onkologie und Allgemeinchirurgie, Drum Tower Hospital, Nanjing, China erhalten. Alle Patienten haben keine Chemotherapie vor der Operation erhalten. Die frische Magentumoren und Blutproben wurden bei 4 ° C gehalten und innerhalb von 15 Minuten nach der Entnahme an das Labor geschickt. Die Studie
wurde vom Institutional Review Board Ethik des Drum Tower Krankenhaus genehmigt angeschlossen an der Medizinischen Fakultät der Universität Nanjing, und eine schriftliche Einverständniserklärung wurde von allen Patienten zur Verfügung gestellt. Alle Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit dem chinesischen Koordinierungsausschuss für die Krebsforschung Ordnung für das Wohlergehen der Tiere und dem Tierschutzgesetz durchgeführt. Alle Analysen, einschließlich Medikamentenempfindlichkeitstests, die Genexpressionsanalyse und Tierversuche wurden von verschiedenen Forschern durchgeführt einzeln ohne Kenntnis der Ergebnisse der anderen Analysen handeln.
Designstudie kaufen Wir zunächst eine Pilotstudie in 40 durchgeführt Patienten (1A). Abbildung S1: Für jede Tumorprobe, Empfindlichkeit gegenüber Docetaxel und Pemetrexed wurde 1 in vitro und Videos Gewebekultur Arzneimittelreaktion Test (HDRA) [19] und in vivo und Videos Xenotransplantate in immundefizienten Maus-Modellen [20] (zusätzliche Datei geprüft , AB online verfügbar). Darüber hinaus sind sowohl die Maus-Xenotransplantaten und die ursprünglichen frischen Tumorproben wurden in Formalin fixierten und in Paraffin eingebetteten (FFPE) für die Analyse der BRCA1 und TS-mRNA-Expression. BRCA1 und TS-Expression wurde auch in den paarigen Blutproben analysiert. Abbildung 1 Ablaufdiagramm Patienten Disposition und Experimente zeigen, durchgeführt. Pilotstudie bei 40 Patienten (A) und die gesamte Kohorte von 150 Patienten mit Magenkrebs (B).
Basierend auf den Ergebnissen der Pilotstudie, unternahmen wir unsere Ergebnisse in der gesamten Kohorte von 150 Patienten mit Magenkrebs (Abbildung 1B zu validieren ). In dieser Kohorte wurden die gleichen Verfahren durchgeführt, mit Ausnahme der in vivo
Prüfung von Chemosensitivität. Die mRNA-Spiegel in Plasma und FFPE Tumorgeweben von BRCA1 und TS wurden bewertet und die Mann-Whitney U-Test wurde verwendet, mRNA-Expressionsniveaus zwischen Tumorproben zu vergleichen, zeigen in vitro
Empfindlichkeit oder Resistenz gegen Docetaxel und Pemetrexed.
Für vollständige Details aller Methodik finden Sie unter Weitere Datei 1, online verfügbar.
in vitro
Chemosensitivität in der Pilotstudie und die frische Tumorgewebe
Gesamtkohorte wurden in 4 ° C Hanks 'ausgeglichene an das Labor geschickt Salzlösung mit 1% Penicillin /Streptomycin. Die Proben wurden mit Hanks 'ausgeglichener Salzlösung zweimal und gehackt in kleine Stücke von etwa 10 mg gewaschen, die dann in auf vorbereiteten Kollagen Oberflächen platziert wurden 24-Well-Mikroplatten. Die Platten wurden für 7 Tage bei 37 ° C in Gegenwart von gelöstem Arzneimittel mit RPMI 1640-Medium mit 20% fötalem Kälberserum inkubiert und in einer befeuchteten Atmosphäre gehalten 95% Luft-5% CO enthält 2. Konzentrationen der Wirkstoffe wurden 100 &mgr; g /ml für Docetaxel [21] und 400 ug /ml für Pemetrexed [7]. HDRA Verfahren wurden von Furukawa und Kollegen wie berichtet durchgeführt [19] mit leichten Modifikationen. Hemmungsrate (%) = (1-T /C) x 100, wobei T die Absorption des behandelten Tumors /Gewicht bedeuten und C ist die mittlere Absorption von Tumorkontrolle /Gewicht: Die Hemmungsrate wurde unter Verwendung der folgenden Formel berechnet. mit dem minimalen P
Wertmethode Alle Proben wurden in empfindliche und resistente Gruppen eingeteilt, wie durch Lausen und Schumacher modifiziert [22].
In vivo
Chemosensitivität in der Pilotstudie
Jede frisch entferntem chirurgische Tumor Gewebe in Stücke von 3 × 3 × 3 mm geschnitten wurde 3, die innerhalb von 30 Minuten bis 18.09 athymischen immundefizienten Mäuse transplantiert wurden, bezeichnet als ein "Panel". In jedem Feld, wenn der Tumor auf eine Größe von 50 bis 100 mm wuchs 3, Mäuse mit Xenotransplantaten randomisiert einer Behandlung wurden mit Docetaxel 15 mg /kg /d, ip oder Pemetrexed 20 mg /kg /d, ip oder nein Behandlung (Kontrolle). Einzelne Tumorvolumina (V) wurden durch die Formel "V = (Länge × Breite × Breite) /2" berechnet, und im Vergleich zu den Werten zu Beginn der Behandlung die relative Tumorvolumen zu erhalten. Median behandelt zu kontrollierenden Werte der relativen Tumorvolumen wurden als "Hemmungsrate in vivo
" und wurden verwendet, Empfindlichkeit gegen Docetaxel oder Pemetrexed zu beurteilen.
MRNA-Expression in der Pilotstudie und der Gesamtkohorte
Zwei Milliliter Blut wurden in EDTA-Röhrchen vor der Operation, gehalten bei 4 ° C und an das Labor innerhalb von 15 Minuten gesammelt. Gesamt-RNA aus Plasma wurde mit TRIzol LS und Chloroform extrahiert und gereinigt, mit dem Pure RNA Mini Kit (Ambion, Carlsbad, CA, USA). Gesamt-RNA aus FFPE Tumorgewebe wurde in Übereinstimmung mit einem proprietären Verfahren (Europäische Patentnummer EP1945764-B1) extrahiert. Nach RNA Extraktion und Reinigung, M-MLV Reverse Transcriptase Kits (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) wurde verwendet, um cDNA zu erzeugen, für die Q-PCR die Expression von β-Actin zu detektieren (ACTB - verwendet als endogene Kontrolle) und die Gene untersucht, . Jede Charge der Reaktions enthielt eine positive Kontrolle aus handelsüblichen menschlichen Lunge und Leber-RNA (Stratagene, La Jolla, CA, USA) als Kalibratoren und negative Kontrollen ohne RNA und reverser Transkriptase. Template cDNA wurde mit spezifischen Primern und Sonden amplifiziert unter Verwendung von TaqMan Universal-Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Relative Genexpression Quantifizierungen wurden gemäß dem Vergleichs Ct-Methode berechnet. Die endgültigen Ergebnisse wurden durch die Formel-mRNA-Expression bestimmt level = 2 - △△ Ct [6], [23] und wurden mit dem Stratagene-Software analysiert
Reproduzierbarkeit und Stabilität der Genexpression Test im Plasma
. die Reproduzierbarkeit des Genexpressionsassay wurde gleichzeitig mit zwei Verfahren getestet. Für das erste Verfahren, Blutproben von fünf Patienten wurden ab dem ersten Tag der fünften Tag vor der Operation zur gleichen Zeit jeden Tag gesammelt. Während dieser Zeit erhielten die Patienten weder eine Chemotherapie noch eine besondere Behandlung. Genexpressionsniveaus (hoch /Zwischen vs low) wurden für jede Probe bestimmt, und der Prozentsatz der identischen Ergebnissen wurde für jeden Patienten berechnet. Für das zweite Verfahren, Blut wurde jeweils einmal von weiteren zehn Patienten gezogen, und jede Probe wurde in fünf Aliquots aufgeteilt. Genexpressionsniveaus (hoch /niedrig Zwischen vs) wurden jedem Aliquot bestimmt, und der Prozentsatz der identischen Ergebnissen wurde für jeden Patienten berechnet. Die Reproduzierbarkeit Rate als der Durchschnitt aller 15 Prozent (5 Patienten von Verfahren ein und 10 Patienten, die an Verfahren zwei) definiert wurde.
Um die Stabilität der Blutproben, unterschiedliche Plasma-Aliquots der gleichen Probe zu testen, wurden hergestellt unter unterschiedliche Bedingungen. Aliquots wurden für 30 min, 1 h bei Raumtemperatur oder auf Eis inkubiert, 1,5 h oder 2 h. qRT-PCR wurde dann durchgeführt, und rohe ACt Werte verschiedener Gen wurden verglichen mit dem Standardprotokoll (ACt = Ct Gen-Ct ACTB).
Statistische Analysen
Der Mann-Whitney-U- Test und der Kruskal-Wallis-Test wurden Test Assoziationen zwischen mRNA-Spiegel und klinischen Eigenschaften und zwischen Empfindlichkeit gegenüber jedem chemotherapeutische Mittel und klinischen Eigenschaften verwendet. Der Spearman-Rangkorrelationstest wurde verwendet, um die Korrelation zwischen in vivo und in vitro

Hemmung Raten und zwischen Plasma und Tumor-mRNA Expression zu bewerten. Der Mann-Whitney-U-Test wurde verwendet, um mRNA-Expressionsniveaus zwischen Tumorproben zeigen in vitro
Empfindlichkeit oder Resistenz gegen Docetaxel und Pemetrexed vergleichen. Receiver operating characteristics (ROC) -Kurven wurden Empfindlichkeit zu beurteilen konstruiert, Spezifität und entsprechenden Flächen unter den Kurven (AUC) mit ihren 95% Konfidenzintervallen (CI). Wir untersuchten die optimierte Cut-off-Wert für die Vorhersage durch die Summe der Sensitivität und Spezifität zu maximieren und die Minimierung der Gesamtfehler (Quadratwurzel aus der Summe [1-Empfindlichkeit] 2 + [1 spezifi Stadt] 2) und durch den Abstand des Cut-off-Wert auf der linken oberen Ecke der ROC-Kurve minimiert werden [24]. Alle statistischen Tests wurden zweiseitig, und Signifikanz wurde bei P <
gesetzt; 0,05 (zweiseitig). Alle Analysen wurden unter Verwendung von SPSS, Version 16.0.
Ergebnisse
Merkmale der Patienten sind in Tabelle 1 Die Mehrzahl der Patienten gezeigt Männchen waren (73,3%), und die vorherrschende Histologie war Adenokarzinom. Vierundneunzig (62,7%) Patienten hatten Stadium III. Lymphknotenmetastasen waren in 115 (76,7%) patients.Table 1 Patientencharakteristika
Charakteristika
Pilotstudie
Gesamtkohorte *
N = 40

N = 150
N (%)
N (%)
Alter, yr, Median (Bereich) 63
(40-83)
64 (29-84)
Sex
Male
31 (77,5)
110 (73,3)
Female
9 (22,5)
40 (26,7)
Tumorstelle
Distal Magen
12 (30.0) 57
(34,0)
proximale Magen
19 (47,5) 62 (41,3) auf
ganzen Magen
9 (22.5)
37 (24,7)
Bühne
I
4 (10,0)
17 (11,3)
II
9 (22,5)
34 (22,7)
III
25 (62,5) 94
(62,7)
IV
2 (5.0)
5 (3.3)
Grading
1 0
3 (2.0) 2
8 (20,0)
31 (20,7)
3
22 (55,0)
71 (47,3)
Mixed 1-2
0
2 (1.3)
Mixed 2-3
10 (25,0)
43 (28,7)
Lymphknotenmetastase
No
9 (22,5)
35 (23,3)
Ja
31 (77,5)
115 (76,7)
* die Gesamtkohorte der ursprünglichen 40 Patienten in der Pilotstudie plus weitere 110 Patienten eingeschlossen bestand.
die Reproduzierbarkeit der Plasma mRNA-Nachweis betrug 92% für BRCA1 und 89% für TS. Die mRNA-Expressionsniveaus waren stabil nach Raumtemperatur oder Eis Inkubation für 30 min, 1 h, 1,5 h und 2 h (Weitere Datei 1: Abbildung S2, online verfügbar).
Pilotstudie
Empfindlichkeit auf Docetaxel und Pemetrexed war erfolgreich in den 40 frischen Tumorproben von HDRA beurteilt. Elf Tafeln von immundefizienten Mäusen (9-18 Mäuse pro Platte, 148 Mäuse insgesamt) mit Menschen stamm Xenotransplantate wurden von allen 40 chirurgischen Proben für in vivo
Analyse der Sensitivität erfolgreich etabliert. Der Spearman-Rangkorrelationstest eine signifikante Korrelation zwischen in vitro und in vivo

Hemmung Raten für Docetaxel (rho = 0,900, P
< 0,001) zeigte, und Pemetrexed (rho = 0,836, P <
0,001) (zusätzliche Datei: 1; Abbildung S3, AB, online verfügbar)
BRCA1-mRNA-Spiegel in allen 40 Tumorproben erfolgreich beurteilt wurden, in 32 gepaart Blutproben und in 10 Platten von Mausmodellen, während TS-mRNA-Spiegel. wurden in allen 40 Tumorproben, die alle 40 Blutproben, und in neun Panels von Mausmodellen erfolgreich beurteilt. Der Spearman-Rangkorrelationstest zeigte eine Korrelation zwischen Plasma und Tumor-mRNA-Spiegel von BRCA1 (rho = 0,647, P
< 0,001) und zwischen Plasma und Tumor-Niveaus von TS (rho = 0,615, P
< 0,001) (Zusätzliche Datei 1: Abbildung S4, AB, online verfügbar). Beide Plasma und Tumor-BRCA1-Spiegel wurden mit Docetaxel Empfindlichkeit korreliert (rho = 0,492, P = 0,004 und
rho = 0,527, P
< 0,001), und beide Plasma und Tumor TS Ebenen mit Pemetrexed Resistenz korrelierte ( rho = -0,627, P
< 0,001 und rho = -0,443, P
= 0,004 bzw. Spearman Rangkorrelationstest) (Zusätzliche Datei 1: Abbildung S5, AD, online verfügbar). BRCA1-mRNA-Spiegel waren in der Docetaxel-empfindlich als in den Docetaxel-resistenten Mausmodellen (11,26 vs 2,63; P
< 0,001), während die TS-Spiegel waren höher in der Pemetrexed-beständiger als in der Pemetrexed empfindlichen Mäusen ( 3,34 vs 7,27; P
= 0,013, Mann-Whitney-U-Test) (Zusätzliche Datei 1: Abbildung S6, AB, online verfügbar)
Gesamtkohorte
BRCA1 und TS-mRNA-Expression erfolgreich in Tumor beurteilt. Gewebe aus allen 150 Patienten. Die Erkennungsrate im Plasma waren 82,00% für BRCA1 und 90,67% für TS. Tabelle S1, online verfügbar: Die mittleren mRNA-Spiegel im Plasma und Tumor sind in den weiteren Datei 1 gezeigt. Es gab keinen signifikanten Zusammenhang zwischen klinischen Charakteristika und die mRNA Expression von BRCA1 oder TS (P > 0,05).
Eine positive Korrelation zwischen Plasma und Tumor-mRNA-Spiegel von BRCA1 (rho Es gab = 0,696, P <
; 0,001) und TS (rho = 0,620, P
< 0,001, Spearman-Rangkorrelationstest) (2A-B). Keine Unterschiede in der Baseline-Charakteristika wurden nach Plasma-mRNA-Spiegel, Tumor-mRNA-Spiegel beobachtet wird, oder in vitro
Chemosensitivität. Figur 2 Korrelationen zwischen Plasma und Tumor-mRNA-Expressionsniveaus von (A) BRCA1 und (B) TS in 150 Patienten mit Magenkrebs. Es gab eine signifikante Korrelation zwischen Plasma und Tumor-mRNA-Expressionsniveaus beider Gene (P
< 0,001)
BRCA1-Spiegel im Plasma (Docetaxel empfindliche:. 1,25; Docetaxel-resistenten: 0,50, P
< 0,001) und Tumor (Docetaxel sensitiv: 8,81; Docetaxel-resistant: 4,88, P
< 0,001) wurden mit Docetaxel Empfindlichkeit positiv assoziiert. BRCA1-Spiegel im Plasma und Tumor waren höher in der Docetaxel-empfindlicher als in der Docetaxel-resistenten Gruppe. TS-Spiegel im Plasma (Pemetrexed sensitiv: 0,90; Pemetrexed-beständig: 1.82, P
< 0,001) und Tumor (Pemetrexed sensitiv: 6,56; Pemetrexed-resistant: 16.69, P
< 0,001) waren negativ mit Pemetrexed Empfindlichkeit verbunden. TS-Spiegel im Plasma und Tumor niedriger waren in der Pemetrexed empfindlicher als in der Pemetrexed-resistente Gruppe. (3A-D, Mann-Whitney U-Test). 3 In-vitro-Chemosensitivität im Zusammenhang mit Plasma und Tumorexpressionsniveaus von BRCA1and TS in 150 Magenkrebs-Patienten. BRCA1-Spiegel im Plasma (A) und Tumor (B) waren höher in der Docetaxel-empfindlicher als in der Docetaxel-resistenten Gruppe. TS-Spiegel im Plasma (C) und Tumor (D) niedriger waren in der Pemetrexed-empfindlich als in der Pemetrexed beständigen Gruppe. Die Leitungen in den Boxen bezeichnet die Mediane. Die Whisker von Box-Plots. SE, 95% CI
Empfindlichkeit in der Vorhersage Chemosensitivität lag im Bereich von 63% bis 71% für Plasma und von 70% bis 78% für die Tumor-mRNA. Spezifität lag im Bereich von 78% bis 90% für Plasma und 79% für die Tumor-mRNA (Tabelle 2, Abbildung 4) .Tabelle 2 Sensitivität und Spezifität von Plasma und Tumor-Genexpressionsniveaus zur Vorhersage von Chemosensitivität
Genexpression

Chemotherapeutika
N
Optimal cut-off
Empfindlichkeit
Spezifität
AUC (95% CI)

P
Plasma
BRCA1
Docetaxel
123
0,76
63%
90%
0,77 (0,67-0,87)
< 0,001
TS
Pemetrexed
136
1,01
71%
78%
0,78 (0,69-0,87)
< 0,001
Tumor
BRCA1
Docetaxel
123
6,09
70%
79%
0,75 (0,66-0,84)
< 0,001
TS
Pemetrexed
136
8,08
78%
79%
0,83 (0,76-0,90)
< 0,001
4 ROC-Kurven die Sensitivität und Spezifität von Plasma und Tumor-Gen-Expression zeigt, in der Vorhersage Chemosensitivität . (A) BRCA1 und Docetaxel (n = 123); (B) TS und Pemetrexed (n = 136).
Diskussion
In der vorliegenden Studie, BRCA1 und TS-mRNA-Spiegel im Plasma wurden mit Ebenen in gepaart FFPE Tumorgewebe korreliert. BRCA1 und TS-mRNA-Spiegel in beiden Plasma und Tumor wurden mit in vitro
Chemosensitivität von frisch explantiert Magenkrebs in Verbindung gebracht. Darüber hinaus zeigte Plasma-mRNA-Spiegel erhebliche Sensitivität und Spezifität in Chemosensitivität der Vorhersage. Zusammengenommen legen diese Ergebnisse zeigen, dass Plasma-mRNA-Tumor-mRNA-Spiegel und kann ein nützliches Werkzeug für die Vorhersage Chemosensitivität beweisen.
Die Methode, die wir festgestellt Plasma mRNA nachzuweisen, auf Basis der RNA-Anreicherung durch Reinigungssäule, ermöglicht eine genauere, empfindliche und reproduzierbare Erkennung , einfachere Handhabung und schnellere Ergebnisse [10], [25], ist es möglich, für die Routinegenexpressionsanalyse in der täglichen klinischen Praxis [25] zu machen. Die Kontamination von mRNA durch Nicht-Tumorquellen, wie aktivierten Lymphozyten, stromalen Zellen oder zirkulierende Tumorzellen, kann nicht ausgeschlossen werden [26] jedoch aus [10], [27] und kann teilweise erklären, warum die Korrelation zwischen Plasma und Tumor Ausdruck war weniger als perfekt.
Außerdem Tumor Heterogenität als auch für eine gewisse Variabilität ausmachen. Spezifität lag im Bereich von 78% bis 90% für die Plasma während 79% für Tumor. Je weniger perfekte Spezifität in Tumor sein kann gut aufgrund der Heterogenität des Tumorgewebes selbst, die für die Vorhersage Empfindlichkeit gegenüber der Verwendung von Plasma mRNA weitere Unterstützung verleiht.
Jüngste Studien der zellfreien mRNA-Expression von mehreren Genen untersucht haben, einschließlich TS [28], β-Catenin [29], hTERT [26], [30], [31], CK19 [32], [33], MUC1 [34], CXCR4 [35], Bmi-1 [35 ], Her-2 [36] und DKK1 [24] haben diese Studien zur Frühdiagnose über die Verwendung von zellfreien mRNA konzentriert, Tumor-Staging und Krankheitsüberwachung. Im Gegensatz zu dem bestem Wissen und Gewissen, die vorliegende Studie ist die erste, die potentielle Rolle von Plasma-mRNA für die Vorhersage von Docetaxel und Pemetrexed Chemosensitivität von soliden Tumoren zu untersuchen. Unsere Ergebnisse deuten auf eine vielversprechende Rolle für Plasma-mRNA-Expression als prädiktiver Biomarker in Magenkrebs und liefern Hinweise auf die Verwendung von Plasma in mRNA ohne die Notwendigkeit einer Chemotherapie bei Patienten Auswahl für die Wieder Biopsie zum Zeitpunkt der Krankheitsprogression. Darüber hinaus kann die Plasma mRNA beweisen auch nützlich für die Überwachung von Patienten in der neoadjuvanten oder adjuvanten Therapie behandelt werden. Der Behandlungsplan für diese Patienten konnten nach ihrer mRNA Chemosensitivitätsprofil erzeugt werden. Zum Beispiel kann Magenkrebs-Patienten mit geringen Mengen an Plasma TS mRNA mit Pemetrexed-basierten Chemotherapie behandelt werden, während diejenigen mit einer hohen Plasma-BRCA1 von einer Behandlung mit Docetaxel profitieren könnten.
Dennoch sollten wir beachten, dass unsere Studie haben einige Einschränkungen. Die aktuelle Studie basiert auf Patienten, die therapienaiven sind. Durch das Sammeln ihrer Plasma vor der Operation und Tumoren direkt nach der Operation konnten wir zeigten die Plasma-mRNA-Wert für Patienten, die Überwachung in der neoadjuvanten oder adjuvanten Therapie behandelt werden. Dann Chemotherapie die Nachweisempfindlichkeit und den Wert der Aufnahme von mRNA zirkulierenden von frühen Metastasen vor allem für Patienten reserviert zweite Zeile ist noch unklar. Jetzt führen wir auch eine weitere Studie bei Patienten mit Metastasen und kann keine Operation erhalten oder zweite Chemotherapie erhalten. Wir werden die neuesten Ergebnisse in der nahen Zukunft haben, die den Inhalt oben genannten enthalten.
Fazit
Abschließend Plasma mRNA Expression von BRCA1 und TS konnten die in der Tumorspiegel und eine vielversprechende Rolle als Potenzial haben kann prädiktiver Biomarker für Docetaxel und peretrexed bei Magenkrebs. Diese Ergebnisse sind vorläufig und nur suggestiv an dieser Stelle, und jeder dieser gepaart Biomarker-Chemotherapie Hypothesen muss validiert werden, bevor in der Routine der täglichen klinischen Praxis verwendet wird. Eine klinische Studie wird derzeit entwickelt, um zu werden, die Rolle der Anpassung der Behandlung zur Validierung auf der Basis der Plasma-mRNA-Expression der Gene BRCA1 und TS.
Zusätzliche Datei
Hinweise
Jie Shen, Jia Wei trugen gleichermaßen zu dieser Arbeit.
Erklärungen
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse aus dem National Natural Science Foundation of China (Grants No. 81401969, 81300339) unterstützt, der Major international (Regional) Verbundprojekt von China (Erteilungsnummer 81220108023 ) und Top Six Talents Projekt in der Provinz Jiangsu (Grant No 2011ws005). Arbeit im Labor Dr. Rosells wird zum Teil durch einen Zuschuss von der Stiftung La Caixa finanziert.
Rolle der Finanzierungsquelle
die Finanzierungsquellen hatten keine Rolle im Studiendesign, Datensammlung, Datenanalyse, Datenauswertung, oder Schreiben von der Bericht | Elektronische Zusatzmaterial
12967_2014_355_MOESM1_ESM.doc Weitere Datei. 1: Ergänzende Methoden. Tabelle S1. Bedeutet mRNA-Spiegel in Plasma und Tumor. Abbildung S1. Original-Tumor und gepaart Maus Xenotransplantate. (A) Die Morphologie der als Adenokarzinom diagnostiziert ursprünglichen Tumor mit Teilschleimhautzellkarzinom. (B) Gepaart Xenotransplantate in immundefizienten Mäusen, bestätigt durch Hämatoxylin-Eosin-Färbung. Es gab keine signifikanten morphologischen Unterschiede zwischen dem ursprünglichen Tumorprobe und die paarigen Xenotransplantaten in den Mausmodellen. Abbildung S2. Validierung der Stabilität der Plasma mRNA. Plasma-mRNA-Spiegel aller Gene stabil waren nach verschiedenen Bedingungen unterzogen wird. Abbildung S3. Korrelationen zwischen den in vitro und in vivo

Hemmung Raten für (A) Docetaxel und (B) Pemetrexed in der Pilotstudie. Abbildung S4. Korrelation zwischen Plasma und Tumor-mRNA-Expression von (A) BRCA1 (n = 32) und (B) TS (n = 40) in der Pilotstudie. Abbildung S5. Die Korrelationen zwischen mRNA Expression und in vitro
Chemosensitivität in der Pilotstudie. (A) Tumor BRCA1 und Docetaxel Empfindlichkeit; (B) Plasma BRCA1 und Docetaxel Empfindlichkeit; (C) Tumor TS und Pemetrexed Empfindlichkeit; und (D) Plasma-TS und Pemetrexed Empfindlichkeit. Abbildung S6. mRNA Expression und in vivo
Chemosensitivität. Verwendung eines Tumorhemmung cut-off von 50%, wurden Mausmodelle unterteilt in (A) docetaxel empfindliche und Docetaxel-resistenten Untergruppen und (B) Pemetrexed-sensitiv und Pemetrexed festen Untergruppen. BRCA1-mRNA-Spiegel (Punkte) waren höher im Docetaxel empfindlichen Gruppe als in der Docetaxel-resistenten Gruppe (P
< 0,001) und TS Ebenen (Punkte) waren höher im Pemetrexed beständigen Gruppe als in der pemetrexed- empfindliche Gruppe (P
= 0,013). (DOC 666 KB) Autoren 'Original vorgelegt Dateien für Bilder
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Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden Interesse haben.
Beiträge der Autoren
JS, JW, WXG und BRL die Forschung entwickelt und schrieb die Zeitung. JS, HW, LXY, ZZZ, LX und CC geführt, um die Forschung. YTD, XPQ und JW analysierten Daten. TB und RR bearbeitet Papier. Alle Autoren gelesen und genehmigt haben das endgültige Manuskript.

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