ARNm plasma niveaux d'expression de BRCA1 et TS en tant que biomarqueurs prédictifs potentiels pour la chimiothérapie dans cancer

gastrique niveaux de BRCA1 et TS en tant que biomarqueurs prédictifs potentiels pour la chimiothérapie dans le cancer gastrique
Objectif
chimiothérapie personnalisée de Abstract expression de l'ARNm plasma basé sur prédictive biomarqueurs peuvent maximiser l'efficacité. Cependant, le tissu tumoral obtenu au moment du diagnostic initial ne tiendra pas compte des altérations génétiques observées au moment de la progression de la maladie. Nous avons examiné si les taux d'ARNm de plasma peut être un substitut pour les niveaux de tumeur dans la prédiction de la chimiosensibilité.
Méthodes
En 150 patients atteints de cancer gastrique, les taux d'ARNm de BRCA1 et TS ont été évalués dans le plasma et appariés tissu tumoral. Le U-test de Mann-Whitney a été utilisé pour comparer les niveaux d'expression d'ARNm entre des échantillons de tumeurs présentant in vitro
sensibilité ou de résistance au docétaxel et pemetrexed. Tous les tests statistiques étaient bilatéraux: Résultats
Il y avait une corrélation significative entre les niveaux de BRCA1 plasma et d'ARNm de la tumeur (rho = 0,696, P < 0,001). Et TS (rho = 0,620, P < 0,001). niveaux de BRCA1 dans le plasma (docetaxel sensible: 1,25; docétaxel résistant: 0,50, P
< 0,001) et la tumeur (docetaxel sensible: 8,81; docétaxel résistant: 4,88, P
< 0,001) étaient positivement associé à la sensibilité du docétaxel. niveaux TS dans le plasma (pemetrexed sensible: 0,90; pemetrexed résistant: 1,82, P
< 0,001) et de la tumeur (pemetrexed sensible: 6,56; pemetrexed résistant: 16,69, P
< 0,001) ont été négativement associé à la sensibilité pemetrexed.
ARNm plasma les niveaux d'expression des conclusions correspondent à celles de la tumeur et peuvent avoir un rôle prometteur en tant que biomarqueurs prédictifs potentiels pour la chimiothérapie.
Mots-clés
plasma ARNm cancer gastrique Chimiosensibilité Predictive biomarqueur HDRA Présentation
Le régime de chimiothérapie standard de première ligne pour le cancer de l'estomac localement avancé ou métastatique est le cisplatine ou l'oxaliplatine combiné avec d'autres médicaments, y compris le docétaxel et le pemetrexed [1], [2]. Cependant, la survie médiane reste maigre - environ un an. Aucune approche standard pour le traitement de deuxième ligne existe, bien que le docétaxel a montré une certaine activité [3]. la chimiothérapie personnalisée basée sur l'expression de l'ARNm de biomarqueurs prédictifs pourrait aider à maximiser l'efficacité du traitement et de prolonger la survie chez ces patients [3] - [8].
gène de susceptibilité au cancer du sein 1 (BRCA1), une composante essentielle de multiples dégâts de réparation de l'ADN les voies et les voies impliquées dans la réponse cellulaire aux dommages des microtubules, est considéré comme un modulateur différentiel de survie avec le cisplatine et taxanes. Des études précliniques et cliniques ont rapporté que le niveau de la tumeur BRCA1 est associée avec le cisplatine et la chimiosensibilité des taxanes. Tumeur avec une forte expression de BRCA1 est-800 à plus de 1000 fois sensibles au docétaxel, mais 10-1000 fois résistant au cisplatine [4]. Nous avons déjà observé que les niveaux d'ARNm de BRCA1 dans les épanchements ont été négativement associés à la sensibilité au platine, mais positivement associés à la sensibilité du docétaxel chez les patients atteints de cancer gastrique [5]. Ces résultats ont été validés chez les patients recevant gastriques deuxième ligne docétaxel: survie médiane était de 9,5 mois chez ceux avec les niveaux de BRCA1 bas dans la tumeur primaire, 19,1 chez ceux ayant des niveaux intermédiaires, et 25,8 mois chez ceux avec des niveaux élevés (P = 0,006
) [3]. Le pemetrexed est un nouveau type de quinazoline folate analogue hydrosoluble, agit comme une synthase directe et spécifique thymidylate (TS) inhibiteur. Faible expression de la thymidylate synthase (TS) a été signalé à être associée à la réponse au traitement à base de pemetrexed dans le cancer du poumon [7], [8].
Tissu tumoral est la principale source pour l'examen de biomarqueurs à l'heure actuelle. Cependant, le tissu tumoral peut parfois être insuffisant pour l'analyse de l'expression génique. De plus, le tissu tumoral obtenu au moment du diagnostic initial peut ne pas refléter des altérations génétiques observées au moment de la progression de la maladie [9], étant donné que métastatiques et primaires des tumeurs chez le même patient peut varier au niveau génomique, épigénétiques et transcriptomiques [9] - [ ,,,0],13]. En outre, la chimiothérapie initiale peut se modifier les niveaux d'expression des gènes [14], [15]. Circulantes tumorales acides nucléiques acellulaires pourraient donc être un outil utile, non invasif pour le suivi des changements au cours du traitement [10], ce qui évite la nécessité d'une nouvelle biopsie au moment de déterminer le meilleur traitement. En outre, il peut être un substitut utile lorsque seule une petite quantité de tissu tumoral est disponible. Notre expérience dans le cancer du poumon a démontré que le récepteur du facteur de croissance épidermique (EGFR) des mutations dans le sérum pourrait être un bon marqueur prédictif pour les patients atteints de cancer du poumon et recevant des inhibiteurs de EGFR tyrosine kinase [16]. En outre, le plasma TS ARNm peut être détectée de manière non invasive dans le sang avant la chirurgie et le niveau de plasma TS d'expression avait un grand potentiel en tant que biomarqueurs prédictifs de sensibilité raltitrexed dans le cancer gastrique [17]. À ce jour, cependant, on sait peu sur l'utilisation potentielle de l'ARNm de plasma pour prédire la chimiosensibilité du docétaxel et de pemetrexed. En outre, bien que l'ARN libéré dans la circulation est stable [10], [18], avec des méthodes actuellement disponibles, seule une petite quantité d'ARNm peut être obtenu à partir du plasma ou du sérum, ce qui limite à la fois l'efficacité de l'extraction de l'ARNm et la consistance des dosages d'ARNm [10].
Dans la présente étude, nous avons adopté une méthode pratique et commode pour la détection de l'ARNm de plasma, basée sur la purification de l'ARN et RT-PCR quantitative (qRT-PCR), et utilisé cette méthode pour déterminer si les niveaux d'ARNm de plasma peut être un substitut pour les niveaux de tumeur dans la prédiction de la chimiosensibilité -. la première fois dans une étude pilote de 40 patients, puis dans une cohorte de 150 patients Matériaux et méthodes
patients
de Octobre 2010 à Juillet 2011, 150 fraîchement -removed tumeurs gastriques et des échantillons de sang appariés provenant des mêmes patients ont été obtenus auprès du Département d'oncologie et de chirurgie générale, Hôpital Drum Tower, Nanjing, en Chine. Tous les patients ont reçu aucune chimiothérapie avant la chirurgie. Les tumeurs et des échantillons de sang frais gastrique ont été maintenus à 4 ° C et envoyé au laboratoire dans les 15 minutes suivant le prélèvement.
L'étude a été approuvée par le Comité d'éthique institutionnelle de l'hôpital Tour du Tambour affilié à la faculté de médecine de l'Université de Nanjing, et le consentement éclairé a été fourni par tous les patients. Toutes les expériences sur les animaux ont été effectuées en conformité avec le Comité de coordination chinois sur le Règlement recherche sur le cancer pour le bien-être des animaux et la loi sur la protection des animaux. Toutes les analyses, y compris les tests de sensibilité aux médicaments, l'expression des gènes d'analyse et animales expériences, ont été réalisées par différents chercheurs agissant individuellement sans connaissance des résultats des autres analyses.
Conception de l'étude
Nous avons d'abord réalisé une étude pilote dans 40 les patients (figure 1A). Pour chaque échantillon de la tumeur, la sensibilité au docétaxel et pemetrexed a été examiné in vitro
par dosage de la réponse aux médicaments de histoculture (HDRA) [19] et in vivo
par xénogreffes dans les modèles immunodéficients de souris [20] (fichier supplémentaire 1: Figure S1 , AB disponible en ligne). En outre, les deux xénogreffes de souris et d'échantillons originaux des tumeurs fraîches ont été fixés au formol et inclus dans la paraffine (FFPE) pour l'analyse de l'expression de BRCA1 et ARNm de la TS. BRCA1 et l'expression TS a également été analysé dans les échantillons de sang par paires. Figure 1 Diagramme montrant la disposition et les expériences des patients réalisée. Etude pilote chez 40 patients (A) et la cohorte total de 150 patients atteints de cancer gastrique (B).
Sur la base des résultats de l'étude pilote, nous avons entrepris de valider nos résultats dans la cohorte totale de 150 patients atteints de cancer gastrique (figure 1B ). Dans cette cohorte, les mêmes procédures ont été réalisées, à l'exception de l'essai in vivo
de chimiosensibilité. Les niveaux d'ARNm dans le plasma et les tissus tumoraux FFPE de BRCA1 et TS ont été évalués et le U-test de Mann-Whitney a été utilisé pour comparer les niveaux d'expression d'ARNm entre des échantillons de tumeurs présentant in vitro
sensibilité ou de résistance au docétaxel et le pemetrexed.
pour des détails complets de toutes les méthodes, voir les fichiers supplémentaires 1, disponible en ligne.
In vitro
chimiosensibilité dans l'étude pilote et les tissus tumoraux frais de la cohorte totale ont été envoyés au laboratoire de 4 ° C Hanks équilibrée une solution saline contenant 1% de pénicilline /streptomycine. Les échantillons ont été lavés avec une solution saline équilibrée de Hanks et deux fois hachés en petits morceaux d'environ 10 mg qui ont ensuite été placées sur les surfaces de collagène préparées en microplaques de 24 puits. Les plaques ont été mises en incubation pendant 7 jours à 37 ° C en présence de médicaments dissous avec du RPMI 1640 contenant 20% de sérum de veau foetal et maintenues dans une atmosphère humidifiée contenant 95% d'air-5% de CO 2. Les concentrations de médicaments ont été de 100 ug /ml pour le docétaxel [21] et 400 ug /ml pour le pemetrexed [7]. procédures HDRA ont été réalisées tel que rapporté par Furukawa et ses collègues [19] avec de légères modifications. Le taux d'inhibition a été calculé en utilisant la formule suivante: Taux d'inhibition (en%) = (1-T /C) x 100, où T est l'absorbance moyenne de traiter la tumeur /poids et C est l'absorbance moyenne de la tumeur de contrôle /poids. Tous les échantillons ont été classés en groupes sensibles et résistantes à l'aide de la méthode
valeur minimale de P tel que modifié par Lausen et Schumacher [22].
In vivo
chimiosensibilité dans l'étude pilote
Chaque tumeur chirurgicale fraîchement enlevée tissu a été découpé en morceaux de 3 × 3 × 3 mm 3, qui ont été transplantés dans les 30 minutes à 9-18 souris immunodéficientes athymiques, appelé un "panel". Dans chaque panneau, lorsque la tumeur a atteint une taille de 50-100 mm 3, les souris avec xénogreffes ont été randomisés pour recevoir le docétaxel 15 mg /kg /j, ip ou pemetrexed 20 mg /kg /j, ip ou pas traitement (contrôle). les volumes des tumeurs individuelles (V) ont été calculées par la formule: «V = (longueur x largeur x largeur) /2" et comparé aux valeurs au début du traitement pour obtenir le volume relatif de la tumeur. Les valeurs médianes traités-au contrôle du volume relatif de la tumeur ont été qualifiées de "taux d'inhibition in vivo
" et ont été utilisés pour évaluer la sensibilité au docétaxel ou à pemetrexed.
expression de l'ARNm dans l'étude pilote et la cohorte totale
Deux millilitres de sang ont été prélevés dans des tubes EDTA avant la chirurgie, conservés à 4 ° C et envoyé au laboratoire dans un délai de 15 minutes. L'ARN total du plasma a été extrait avec TRIzol LS et du chloroforme et purifié avec le kit PureLink ARN Mini (Ambion, Carlsbad, CA, USA). L'ARN total provenant des tissus de tumeur FFPE a été extrait conformément à un procédé breveté (brevet européen EP1945764-B1). Après extraction de l'ARN et de purification, M-MLV transcriptase Kit inverse (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) a été utilisé pour générer des ADNc pour Q-PCR pour détecter l'expression de la β-actine (ACTB - utilisé comme contrôle endogène) et les gènes examinés . Chaque lot de réaction comprenait un contrôle positif du poumon humain commercial et de l'ARN du foie (Stratagene, La Jolla, CA, USA) comme calibrateurs et les contrôles négatifs sans l'ARN et la transcriptase inverse. Modèle ADNc a été amplifié avec des amorces et des sondes spécifiques à l'aide de Taqman Universal Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Par rapport quantifications d'expression génique ont été calculées selon la méthode comparative CT. Les résultats finaux ont été déterminées par l'expression de l'ARNm de formule level = 2 - Ct △△ [6], [23] et ont été analysées avec le logiciel Stratagene de reproductibilité et de stabilité de l'analyse d'expression génique dans le plasma
. la reproductibilité de l'analyse d'expression génique a été testé simultanément avec deux méthodes. Pour la première méthode, des échantillons de sang provenant de cinq patients ont été recueillis à partir du premier jour au cinquième jour avant la chirurgie à la même heure chaque jour. Pendant cette période, les patients ont reçu ni chimiothérapie ni traitement spécial. les niveaux d'expression génique (haut /bas) par rapport intermédiaires ont été déterminées pour chaque échantillon, et le pourcentage des résultats identiques ont été calculés pour chaque patient. Pour la seconde méthode, le sang est aspiré à partir de chaque fois une période supplémentaire de dix patients, et chaque échantillon a été divisé en cinq parties aliquotes. les niveaux d'expression génique (haut /bas) par rapport intermédiaires ont été déterminées pour chaque fraction aliquote, et le pourcentage des résultats identiques ont été calculés pour chaque patient. Le taux de reproductibilité a été définie comme étant la moyenne de l'ensemble des 15 pourcentages (5 patients de méthode un et 10 patients de méthode en deux).
Afin de tester la stabilité des échantillons de sang, différentes aliquotes plasmatiques du même échantillon ont été préparées sous des conditions distinctes. Des aliquotes ont été mises en incubation à température ambiante ou sur de la glace pendant 30 min, 1 h, 1,5 h et 2 h. qRT-PCR a ensuite été réalisée, et les valeurs de ACt brutes du gène différent ont été comparés avec le protocole standard (ACt = Ct Gène-Ct ACTB) Analyses statistiques de. The Mann-Whitney U- test et le test de Kruskal-Wallis ont été utilisés pour tester les associations entre les niveaux d'ARNm et les caractéristiques cliniques et entre la sensibilité à chaque agent chimiothérapeutique et les caractéristiques cliniques. Le test de corrélation de rang de Spearman a été utilisé pour évaluer la corrélation entre in vivo et in vitro

taux d'inhibition et entre les concentrations plasmatiques et la tumeur expression de l'ARNm. Le U-test de Mann-Whitney a été utilisé pour comparer les niveaux d'expression d'ARNm entre des échantillons de tumeurs présentant in vitro
sensibilité ou de résistance au docétaxel et pemetrexed. Récepteur caractéristiques d'exploitation (ROC) courbes ont été construits pour évaluer la sensibilité, la spécificité et les zones respectives sous les courbes (AUCs) avec leurs intervalles de confiance à 95% (IC). Nous avons étudié la valeur de coupure optimisé pour la prédiction en maximisant la somme de la sensibilité et de la spécificité et de minimiser l'erreur globale (racine carrée de la somme [1-sensibilité] 2 + [ville 1-spécifi] 2) , et en minimisant la distance de la valeur de coupure vers le coin supérieur gauche de la courbe ROC [24]. Tous les tests statistiques étaient bilatéraux, et la signification a été fixé à P
< 0,05 (recto-verso). Toutes les analyses ont été effectuées en utilisant SPSS, la version 16.0
. Résultats de Caractéristiques de tous les patients sont présentés dans le tableau 1. La majorité des patients étaient des hommes (73,3%), et l'histologie prédominante était adénocarcinome. Quatre-vingt-quatre (62,7%) patients avaient une maladie de stade III. métastases ganglionnaires étaient présentes dans 115 (76,7%) patients.Table 1 Caractéristiques des patients
Caractéristique
étude pilote
totale cohorte *
N = 40

N = 150
N (%)
N (%)
âge, année, la médiane (plage)
63 (40-83)
64 (29-84)
Sexe Homme
31 (77,5)
110 (73,3)
9 (22,5) Femme
40 (26,7)
site de tumeur
estomac distal
12 (30,0)
57 (34,0)
estomac proximal
19 (47,5)
62 (41,3)
estomac entier
9 (22,5)
37 (24,7)
Stage
I
4 (10,0)
17 (11,3)
II
9 (22,5)
34 (22,7)
III
25 (62,5)
94 (62,7)
IV
2 (5.0)
5 (3.3)
Le grade histologique 1
0
3 (2,0) 2
8 (20,0)
31 (20,7) 3
22 (55,0)
71 (47,3)
mixte 1-2
0
2 (1.3)
mixte 2-3
10 (25,0)
43 (28,7)
métastases ganglionnaires
Non
9 (22,5)
35 (23,3)
Oui
31 (77,5)
115 (76,7)
* la cohorte totale est composée de 40 patients d'origine inclus dans l'étude pilote, plus un supplément de 110 patients.
la reproductibilité de la détection de l'ARNm de plasma était de 92% pour BRCA1 et 89% TS. Les niveaux d'expression de l'ARNm sont stables après la température ambiante ou l'incubation de la glace pendant 30 min, 1h, 1,5 h et 2 h (fichier supplémentaire 1: Figure S2, disponible en ligne). Sensibilité
étude pilote au docétaxel et pemetrexed a été avec succès évalué dans les 40 échantillons de tumeurs fraîches par HDRA. Onze panneaux de souris immunodéficientes (9-18 souris par panneau, 148 souris au total) avec des xénogreffes humaines dérivées ont été établies avec succès de tous les 40 échantillons chirurgicaux pour l'analyse in vivo
de sensibilité. Le test de corrélation de rang de Spearman a montré une corrélation significative entre in vitro et in vivo

taux d'inhibition pour le docétaxel (rho = 0,900, P
< 0,001) et pemetrexed (rho = 0,836, P
<0,001) (fichier supplémentaire 1: Figure S3, AB, disponible en ligne)
niveaux BRCA1 ARNm ont été évalués avec succès dans tous les échantillons 40 tumorales, dans 32 échantillons de sang appariés, et en 10 panneaux de modèles de souris, tandis que les niveaux TS ARNm. ont été évaluées avec succès dans tous les échantillons de tumeur 40, les 40 échantillons de sang et de 9 panneaux de modèles de souris. Le test de corrélation de rang de Spearman a montré une corrélation entre les niveaux de BRCA1 plasma et d'ARNm de la tumeur (rho = 0,647, P
< 0,001) et entre les concentrations plasmatiques et tumorales de TS (rho = 0,615, P
< 0,001) (fichier supplémentaire 1: Figure S4, AB, disponible en ligne). Les taux plasmatiques et BRCA1 tumorale sont en corrélation avec une sensibilité de docétaxel (rho = 0,492, P
= 0,004 et rho = 0,527, P
< 0,001, respectivement), et les deux niveaux de TS plasmatiques et de la tumeur en corrélation avec la résistance de pemetrexed ( rho = -0,627, P
< 0,001 et rho = -0,443, P = 0,004
, respectivement, Spearman test de corrélation de rang) (fichier additionnel 1: Figure S5, AD, disponible en ligne). niveaux BRCA1 ARNm étaient plus élevés dans le docétaxel sensible que dans les modèles de souris les docétaxel résistant (11,26 vs 2,63; P
< 0,001), tandis que les niveaux de TS étaient plus élevés dans le pemetrexed-résistant que chez les souris de pemetrexed sensibles ( 3,34 vs 7,27; P = 0,013
, Mann-Whitney U-test) (fichier supplémentaire 1: cohorte totale de Figure S6, AB, accessible en ligne)
BRCA1 et d'expression ARNm de la TS a été évaluée avec succès dans la tumeur. les tissus de tous les 150 patients. Le taux de détection dans le plasma était de 82,00% pour BRCA1 et 90,67% pour les TS. Les niveaux d'ARNm de moyennes dans le plasma et la tumeur sont présentés dans les fichiers supplémentaires 1: Tableau S1, disponible en ligne. Il n'y avait pas d'association significative entre les caractéristiques cliniques et les niveaux de BRCA1 ou TS d'expression de l'ARNm (P > 0,05).
Il y avait une corrélation positive entre les niveaux de BRCA1 plasma et d'ARNm de la tumeur (rho = 0.696, P
<0,001) et TS (rho = 0,620, P
< 0,001, Spearman essai de corrélation de rang) (Figure 2A-B). Aucune différence dans les caractéristiques de base ont été observées en fonction des niveaux d'ARNm de plasma, les niveaux d'ARNm de la tumeur, ou dans chimiosensibilité in vitro
. La figure 2 Corrélation entre le plasma et l'ARNm de tumeur niveaux de (A) et (B BRCA1 TS) chez 150 patients atteints de cancer gastrique expression. Il y avait une corrélation significative entre le plasma et les ARNm de tumeur niveaux des deux gènes d'expression (P
< 0,001, respectivement)
niveaux de BRCA1 dans le plasma (docetaxel sensible:. 1.25; docétaxel résistant: 0,50, P
< 0,001) et la tumeur (docetaxel sensible: 8,81; docétaxel résistant: 4,88, P
< 0,001) ont été positivement associés à la sensibilité du docétaxel. les niveaux de BRCA1 dans le plasma et la tumeur étaient plus élevés dans le docetaxel sensible que dans le groupe -Résistant docétaxel. niveaux TS dans le plasma (pemetrexed sensible: 0,90; pemetrexed résistant: 1,82, P
< 0,001) et de la tumeur (pemetrexed sensible: 6,56; pemetrexed résistant: 16,69, P
< 0,001) ont été négativement associé à la sensibilité pemetrexed. les niveaux de TS et de la tumeur dans le plasma étaient plus faibles dans le pemetrexed sensible que dans le groupe de pemetrexed résistant. (Figure 3A-D, de Mann-Whitney U-test). Dans la figure 3 chimiosensibilité in vitro associées à des taux plasmatiques et l'expression de la tumeur de BRCA1and TS chez 150 patients atteints de cancer gastrique. les niveaux de BRCA1 dans le plasma (A) et de la tumeur (B) étaient plus élevés dans le docetaxel sensible que dans le groupe -Résistant docétaxel. les niveaux de TS dans le plasma (C) et la tumeur (D) sont plus faibles dans le pemetrexed sensible que dans le groupe de pemetrexed résistant. Les lignes à l'intérieur des boîtes désignées les médianes. Les moustaches de boîtes à moustaches. La sensibilité SE, 95% CI pour prédire la chimiosensibilité a varié de 63% à 71% pour le plasma et de 70% à 78% pour l'ARNm de la tumeur. La spécificité a varié de 78% à 90% pour le plasma et 79% pour l'ARNm de la tumeur (Tableau 2, Figure 4) .Tableau 2 Sensibilité et spécificité des niveaux d'expression de plasma et le gène de la tumeur pour la prédiction de la chimiosensibilité
expression génique

agents chimiothérapeutiques
N
optimal coupure
Sensibilité
Spécificité
AUC (95% CI)
le BRCA1
P
plasma
123
0,76
63%
90% de Docetaxel
0,77 (0,67 à 0,87)
<0,001
TS
pemetrexed
136
1.01
71%
78%
0,78 (0,69 à 0,87)
< 0,001
Tumor
BRCA1
123
6,09
70%
79% de Docetaxel
0,75 (0,66 à 0,84)
< 0,001
TS
pemetrexed
136
8,08
78% de 79%
0,83 (de 0,76 à 0,90)
< 0,001
Figure 4 courbes ROC montrant la sensibilité et la spécificité du plasma et du gène de la tumeur expression dans la prédiction de la chimiosensibilité . (A) BRCA1 et le docétaxel (n = 123); (B) TS et pemetrexed (n = 136) Discussion de
. Dans la présente étude, les niveaux d'ARNm de BRCA1 et TS dans le plasma ont été corrélés avec les niveaux dans le tissu tumoral FFPE appariés. BRCA1 et TS ARNm niveaux dans le plasma et la tumeur ont été associés à la chimiosensibilité in vitro
du cancer gastrique fraîchement explantées. En outre, les taux d'ARNm de plasma ont montré une sensibilité et une spécificité importante pour prédire la chimiosensibilité. Pris ensemble, ces résultats indiquent que le plasma ARNm reflète l'ARNm de la tumeur et peut se révéler un outil utile pour prédire la chimiosensibilité.
La méthode que nous avons établi pour détecter l'ARNm de plasma, basée sur l'ARN enrichissement par colonne de purification, permet une détection plus précise, sensible et reproductible , une manipulation plus facile et des résultats plus rapides [10], [25], ce qui rend possible pour la routine d'analyse de l'expression des gènes dans la pratique clinique quotidienne [25]. Cependant, la contamination de l'ARNm par des sources non-tumorales, telles que les lymphocytes activés, des cellules stromales ou les cellules tumorales circulantes, ne peut pas être exclu [10], [26], [27] et peut expliquer en partie pourquoi la corrélation entre le plasma et la tumeur expression était moins que parfait.
de plus, l'hétérogénéité de la tumeur peut expliquer une certaine variabilité aussi bien. La spécificité a varié de 78% à 90% pour le plasma et 79% pour les tumeurs. La spécificité moins parfaite dans la tumeur peut bien être due à l'hétérogénéité du tissu tumoral lui-même, ce qui donne un soutien supplémentaire à l'utilisation de l'ARNm de plasma pour prédire la sensibilité.
Des études récentes ont examiné l'expression de l'ARNm sans cellules de plusieurs gènes, y compris TS [28], β-caténine [29], hTERT [26], [30], [31], CK19 [32], [33], MUC1 [34], CXCR4 [35], Bmi-1 [35 ], Her-2 [36] et DKK1 [24], ces études ont mis l'accent sur l'utilisation de l'ARNm sans cellule pour le diagnostic précoce, la mise en scène de la tumeur et la surveillance des maladies. En revanche, au mieux de notre connaissance, la présente étude est la première à examiner le rôle potentiel de plasma ARNm pour prédire le docétaxel et la chimiosensibilité pemetrexed des tumeurs solides. Nos résultats suggèrent un rôle prometteur pour l'expression de l'ARNm de plasma en tant que biomarqueur prédictif du cancer gastrique et fournissent des preuves de l'utilisation d'un plasma dans la sélection de l'ARNm de chimiothérapie chez les patients sans qu'il soit nécessaire de ré-biopsie au moment de la progression de la maladie. En outre, l'ARNm de plasma peut également se révéler utile pour le suivi des patients en cours de traitement dans le cadre de néoadjuvante ou adjuvante. Le plan de traitement pour ces patients pourrait être généré en fonction de leur profil d'ARNm de chimiosensibilité. Par exemple, les patients atteints de cancer gastrique avec de faibles niveaux de plasma TS ARNm peuvent être traités avec une chimiothérapie à base de pemetrexed, tandis que ceux avec des niveaux élevés de BRCA1 de plasma pourraient bénéficier d'un traitement par le docétaxel.
Néanmoins, il faut noter que notre étude peut avoir certaines limites. L'étude actuelle est basée sur les patients, qui sont la thérapie naïve. En recueillant leur plasma avant la chirurgie et les tumeurs juste après la chirurgie, nous avons pu démontrer la valeur de l'ARNm de plasma pour le suivi des patients en cours de traitement dans le cadre de néoadjuvante ou adjuvante. Ensuite, la sensibilité de détection et de la valeur de ramasser circulation ARNm de début des métastases en particulier pour les patients réservant la deuxième ligne de chimiothérapie est encore peu clair. Maintenant, nous menons également une étude plus approfondie sur les patients avec des métastases et ne peut pas recevoir une chirurgie ou pour recevoir la deuxième ligne de chimiothérapie. Nous aurons les derniers résultats dans un avenir proche qui contiendra le contenu mentionné ci-dessus.
Conclusion
En conclusion, les niveaux de BRCA1 et TS plasma ARNm expression pourraient refléter celles de la tumeur et peut-être un rôle prometteur en tant que potentiel biomarqueurs prédictifs pour le docétaxel et peretrexed dans le cancer gastrique. Ces résultats sont préliminaires et ne suggère à ce stade, et chacune de ces hypothèses de biomarqueurs-chimiothérapie appariés doit être validé avant d'être utilisé dans la pratique clinique quotidienne de routine. Un essai clinique est en cours de conception afin de valider le rôle de personnaliser le traitement en fonction de l'expression de l'ARNm de plasma de BRCA1 et TS. Fichier
supplémentaires
Remarques
Jie Shen, Jia Wei a contribué également à ce travail. Remerciements de
Déclarations
Ce travail a été soutenu par des subventions de la national science Foundation naturelles de Chine (subventions No. 81401969, 81300339), le major international (régional) projet commun de recherche de la Chine (Grant No. 81220108023 ), et Top Six talents projet de la province du Jiangsu (Grant No. 2011ws005). Les travaux dans le laboratoire du Dr Rosell est financé en partie par une subvention de la Fondation La Caixa.
Rôle de la source
Les sources de financement de financement n'a joué aucun rôle dans la conception de l'étude, la collecte de données, analyse des données, l'interprétation des données, ou l'écriture de le rapport de matériel supplémentaire électronique
12967_2014_355_MOESM1_ESM.doc fichier 1 supplémentaires:. Méthodes supplémentaires. Tableau S1. Les concentrations moyennes d'ARNm dans le plasma et la tumeur. La figure S1. tumeur d'origine et de xénogreffes de souris appariés. (A) La morphologie de la tumeur d'origine diagnostiqué comme ayant un cancer adénocarcinome des cellules muqueuses partielle. (B) xénogreffes chez des souris immunodéficientes appariés, confirmées par hématoxyline-éosine. Il n'y avait pas de différences morphologiques importantes entre l'échantillon de tumeur d'origine et les xénogreffes par paires dans les modèles de souris. La figure S2. Vérification de la stabilité de l'ARNm du plasma. les taux d'ARNm du plasma de tous les gènes ont été stables après avoir été soumises à diverses conditions. La figure S3. Les corrélations entre in vitro et in vivo

taux d'inhibition de (A) docétaxel et (B) pemetrexed dans l'étude pilote. Figure S4. Corrélation entre le plasma et l'ARNm de la tumeur expression de (A), BRCA1 (n = 32) et (B) TS (n = 40) dans l'étude pilote. La figure S5. Les corrélations entre les niveaux d'expression d'ARNm et de chimiosensibilité in vitro
dans l'étude pilote. (A) BRCA1 de la tumeur et de la sensibilité du docétaxel; (B) BRCA1 de plasma et de la sensibilité du docétaxel; (C) TS de la tumeur et la sensibilité pemetrexed; et (D) TS plasmatique et de la sensibilité pemetrexed. Figure S6. expression de l'ARNm niveaux et in vivo
chimiosensibilité. L'utilisation d'une inhibition de la tumeur de coupure de 50%, des modèles de souris ont été divisés en sous-groupes (A) de docétaxel-sensibles et docétaxel résistant et (B) sous-groupes pemetrexed-sensibles et pemetrexed résistant. les niveaux BRCA1 ARNm (points) étaient plus élevés dans le groupe docétaxel sensible que dans le groupe de docétaxel résistant (P
< 0,001), et les niveaux de TS (points) étaient plus élevés dans le groupe pemetrexed résistant que dans le pemetrexed- groupe sensible (P
= 0,013). (DOC 666 KB) Auteurs de fichiers originaux soumis pour les images
Voici les liens vers les auteurs originaux soumis fichiers pour les images. de fichier d'origine pour la figure 1 12967_2014_355_MOESM3_ESM.gif Auteurs 12967_2014_355_MOESM2_ESM.gif Auteurs fichier d'origine pour de fichier d'origine pour la figure 3 12967_2014_355_MOESM5_ESM.gif Auteurs 'Figure 2 12967_2014_355_MOESM4_ESM.gif Auteurs fichier d'origine pour la figure 4 intérêt concurrence
Les auteurs déclarent qu'ils avoir aucun intérêt en compétition. les contributions de
Auteurs
JS, JW, WXG et BRL conçu la recherche et a écrit le papier. JS, HW, LXY, ZZZ, LX et CC effectué la recherche. YTD, XPQ et JW analysé les données. TB et RR édités papier. Tous les auteurs ont lu et approuvé le manuscrit final.

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