Plazma mRNA razinu ekspresije BRCA1 i TS kao potencijalne prediktivni biomarkera za kemoterapije kod raka želuca

Plazma mRNA razinu ekspresije BRCA1 i TS kao potencijalne prediktivni biomarkera za kemoterapiju u rak želuca
apstraktne pregled Cilj
personalizirane kemoterapije temeljene na prediktivni biomarkera može povećati efikasnost. Međutim, tkivo tumora dobivene u vrijeme inicijalne dijagnoze ne bi utjecali genetičkih promjena promatrane za vrijeme progresije bolesti. Mi smo ispitali je li plazma razine mRNA može biti nadomjestak za razine tumora u predviđanju kemijske osjetljivosti.
Metode
U 150 bolesnika s rakom želuca, razina mRNA BRCA1 i TS su određene u plazmi i upareni tumorskog tkiva. Mann-Whitney U-test je korišten za usporedbu razina ekspresije mRNA između uzoraka tumora koji pokazuju in vitro
osjetljivosti ili otpornost na docetaksela i pemetreksed. Svi statistički testovi bili obostrani pregled Rezultati
bilo značajne korelacije između plazme i tumor mRNA razinama BRCA1 (p = 0,696, P < 0,001). I TS (p = 0,620, P < 0,001). Razine u plazmi BRCA1 (docetaxel osjetljiv: 1,25, docetaksel otporan: 0,50, P pregled < 0,001) i tumora (docetaksel osjetljiv: 8,81, docetaksel otporan: 4.88, P pregled i 0,001) su pozitivno povezana s osjetljivošću docetaksela. TS razine u plazmi (pemetreksed osjetljiv: 0,90, pemetreksed otporan: 1.82, P pregled < 0,001) i tumora (pemetreksed osjetljiv: 6,56; pemetreksed otporan: 16.69, P pregled i 0,001) su negativno povezana s pemetreksed osjetljivosti.
zaključke
Plazma mRNA razine ekspresije ogledalo onih u tumor, a može imati obećavajuću ulogu kao potencijalne prediktivni biomarkera za kemoterapiju. pregled Ključne riječi pregled Plazma mRNA rak želuca kemijske osjetljivosti Prediktivni biomarker HDRA Uvod
standardne prve linije kemoterapija za lokalno uznapredovalim ili metastatskim karcinomom želuca cisplatin ili oksaliplatina u kombinaciji s drugim lijekovima, uključujući i docetaksela i pemetrekseda [1], [2]. Međutim, medijan preživljenja ostaje mršav - oko godinu dana. Ne standardni pristup za druge linije terapije postoji, iako docetaksel pokazalo neku aktivnost [3]. Personalizirana kemoterapiju baziranu na ekspresiju mRNA prediktivnih biomarkera može pomoći kako bi se povećala učinkovitost liječenja i produžiti preživljavanje u tih bolesnika [3] - [8].
Gen raka dojke osjetljivosti 1 (BRCA1), bitna komponenta u višestrukom popravka oštećenja DNA putevi i putevi koji su uključeni u staničnog odgovora na oštećenja mikrotubula, smatra se da je diferencijalni modulator preživljavanja s cisplatinom i taksana. Pretkliničkih i kliničkih studija pokazalo da BRCA1 razina tumora povezana s cisplatinom i taksana kemijske osjetljivosti. Tumor visokom ekspresijom BRCA1 je 800 za više od 1000 puta osjetljiviji na docetaksela, a 10-1000 puta rezistentni na cisplatin [4]. Mi smo ranije primijetili da razina BRCA1 mRNA u izljeva su negativno povezane s osjetljivošću platine, ali pozitivno je povezano s osjetljivošću docetaksela u bolesnika s rakom želuca [5]. Ovi rezultati su potvrđene u želučanim bolesnika koji su primali druge linije docetaksel: medijan preživljenja bio je 9,5 mjeseci u onih s niskim razinama BRCA1 u primarnom tumoru, 19.1 u one sa srednjim razinama, kao i 25,8 mjeseci u onih s visokim razinama (P = 0.006 pregled ) [3]. Pemetreksed je nova vrsta vodotopivog kinazolina folata analoga, djeluje kao izravna i specifična timidilat sintaze (TS) inhibitora. Niska izraz timidilat sintaze (TS) je izvijestila da je povezan s odgovor na pemetreksed-based terapije raka pluća [7], [8]. Pregled tumorskog tkiva je glavni izvor za marker ispita u sadašnjosti. Međutim, tumorsko tkivo može s vremena na vrijeme biti nedovoljna za genske ekspresije analizu. Štoviše, tkivo tumora dobivene u vrijeme početne dijagnoze ne moraju odražavati genetske promjene uočene u vrijeme progresije bolesti [9], budući da metastatskih i primarnih tumora iz istog pacijenta može varirati u genomske, epigenetičkim i transkriptomskih razine [9] - [ ,,,0],13]. Osim toga, početno kemoterapija može sam mijenjati razine ekspresije gena [14], [15]. Cirkulirajući tumorskih stanica bez nukleinske kiseline može tako biti korisna, neinvazivna alat za promjene praćenje tijekom liječenja [10], otklanjajući potrebu za ponovnom biopsija u trenutku odrediti najbolji tretman. Osim toga, to može biti korisna surogat kada je samo mala količina tumorskog tkiva je dostupna. Naše prethodno iskustvo u pluća pokazala je da receptor epidermalnog faktora rasta (EGFR), mutacije u serumu može biti dobar prediktivni marker za bolesnika s karcinomom pluća koji primaju inhibitore EGFR tirozin kinaze [16]. Osim toga, u plazmi TS mRNA se može detektirati neinvazivno u krvi prije operacije, a razina ekspresije plazmi TS imao veliki potencijal kao biomarkera za predviđanje osjetljivosti raltitrekseda u želučanom raka [17]. Do danas, međutim, malo se zna o potencijalnom upotrebom plazme mRNA za predviđanje kemosenzitivnost docetaksela i pemetreksed. Osim toga, iako RNA ispušta u promet stabilna [10], [18] s trenutno dostupnim postupcima, samo male količine mRNA mogu se dobiti iz plazme ili seruma, što ograničava oboje i učinkovitost ekstrakcije mRNA i cjelovitosti mRNA ispitivanja [10].
u ovom istraživanju, usvojili smo praktičan i prikladan način za otkrivanje plazma mRNA, na temelju pročišćavanje RNA i kvantitativne RT-PCR (QRT-PCR), a koristi ovu metodu ispitati da li plazma razine mRNA mogu biti zamjena za razine tumorskih u predviđanju kemijske osjetljivosti. - prva u pilot studiji 40 pacijenata, a zatim u ukupnom skupini od 150 bolesnika
Materijali i metode pregled Pacijenti
od listopada 2010. do srpnja 2011., 150 svježe -removed želučanih tumora i upareni uzorci krvi iz istih bolesnika dobiveni su iz Odjela za onkologiju i opće kirurgije, Drum Tower bolnice, Nanjing, Kina. Svi pacijenti nisu dobili nikakvu kemoterapiju prije operacije. Svježi želučanih tumora i uzorci krvi su držane na 4 ° C i poslati u laboratorij u roku od 15 minuta od uzimanja.
Istraživanje je prihvaćeno od strane institucionalne etiku pregled odbora Drum Tower bolnice povezane s Medicinskog fakulteta Sveučilišta Nanjing, i pismeni informirani pristanak dao je sve pacijente. Svi pokusi na životinjama su izvedena u skladu s kineskom Koordinacijskog odbora za istraživanje raka Pravilnika za dobrobit životinja i Zakona o zaštiti životinja. Sve analize, uključujući i testiranje osjetljivosti na lijekove, analiza i životinjskim pokusima ekspresije gena, provedene su različite istražitelji djeluju samostalno, bez znanja o rezultatima drugih analiza. Pregled, dizajn studija pregled Mi smo prvi put provela pilot istraživanje u 40 pacijenata (Slika 1A). Za svaki uzorak tumora, osjetljivost na docetaksela i pemetrekseda ispitana je in vitro pregled testom histoculture droge odgovora (HDRA) [19] i in vivo
prema ksenografta u modelima imunodeficijentni mišem [20] (dodatni file 1: Slika S1 , AB dostupan on-line). Osim toga, oba miš stranih tijela i originalni uzorci svježe tumor u formalinu-fiksna i parafin uklopljenih (FFPE) za analizu BRCA1 i izražavanja TS mRNA. BRCA1 i TS ekspresija također analizirana u Spareni uzorci krvi. Slika 1 dijagram toka koji pokazuje sklonost pacijenta i eksperimente izvodi. Pilot studija u 40 pacijenata (A) i ukupnoj skupini od 150 bolesnika s rakom želuca (B).
Na temelju nalaza pilot studije, poduzeli smo potvrdili naše rezultate u ukupnoj skupini od 150 bolesnika s rakom želuca (Slika 1B ). U ovoj skupini, isti postupci su bili provedeni s iznimkom ispitivanja in vivo pregled za kemijske osjetljivosti. Razine mRNA u plazmi i FFPE tumorskog tkiva u BRCA1 i TS ocijenjeni i Mann-Whitney U-test je korišten za usporedbu razina ekspresije mRNA između uzoraka tumora koji pokazuju in vitro
osjetljivosti ili otpornost na docetaksela i pemetreksed. Pregled za potpune detalje svih metodologije, pogledajte dodatne datoteke 1, dostupan na internetu. pregled, in vitro
kemijske osjetljivosti u pilot studiji, a ukupna kohorta pregled svježeg tumorskog tkiva su poslani u laboratorij u 4 ° C Hanks 'uravnoteženi otopina soli sa 1% penicilina /streptomicina. Uzorci se isperu sa Hanksovoj balansiranoj otopini soli dvaput, isjeckane su u male komadiće od oko 10 mg koji je tada bila stavljena na pripremljene kolagenskim površinama u 24-jažica. Ploče su inkubirane tijekom 7 dana na 37 ° C, u prisutnosti lijeka otopljenog u RPMI 1640 mediju koji sadrži 20% fetalnog telećeg seruma i čuva u vlažnoj atmosferi koja sadrži 95% zraka-5% CO 2. Koncentracije lijekova su 100 ug /ml za docetaksel [21] i 400 ug /ml za pemetreksed [7]. HDRA postupci su kako je izvijestio Furukawa i suradnici [19] uz male modifikacije. Brzina inhibicije je izračunata pomoću sljedeće formule: Brzina inhibicije (%) = (1-T /C) x 100, gdje T je srednja apsorpcija tretiranog tumora /težina i C je srednja apsorbancija kontrola tumora /težine. Svi uzorci su svrstane u osjetljivim i rezistentnim skupine koriste minimalno P metodu pregled vrijednost korigirane Lausen i Schumacher [22]. Pregled In vivo pregled kemijske osjetljivosti u pilot istraživanju
Svaki svježe uklonjeni kirurškim tumora tkivo je rezan u komade 3 × 3 × 3 mm 3 koje su transplantirane u roku od 30 minuta do 9-18 atimičnih imunodeficijentnih miševa, koja se zove "ploču". U svakoj ploči, kada je tumor rastao do veličine od 50-100 mm 3, miševi s ksenografta su randomizirani na liječenje docetakselom 15 mg /kg /d, ip ili Pemetreksed 20 mg /kg /d, ip ili ne tretman (kontrola). Pojedinačni volumeni tumora (V) se izračunava formulom: "V = (duljina x širina x širina) /2" i uspoređene s vrijednostima na početku tretmana bi se dobio relativni volumena tumora. Medijan tretirane-u-kontrole vrijednosti volumena relativne tumora su nazvane "stopa inhibicije in vivo pregled", a korišteni su za procjenu osjetljivosti na docetaksela ili pemetreksed.
MRNA u pilot studija i ukupnog kohorte
Dvije mililitara krvi se prikupljaju u EDTA epruvete prije operacije, koja se čuva na 4 ° C i poslati u laboratorij u roku od 15 minuta. Ukupna RNA iz plazme je ekstrahirana Trizol LS i kloroformom i pročišćavaju sa PureLink RNA Mini Kit (Ambion, Carlsbad, CA, USA). Ukupna RNA iz FFPE tumorskog tkiva se ekstrahira u skladu s našim vlastitim postupak (European patent broj EP1945764 B1-). Nakon ekstrakcije RNA i pročišćavanja, M-MLV reverzne transkriptaze Kit (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) je korišten za generiranje cDNA za P-PCR za otkrivanje ekspresije P-aktin (ACTB - koristi se kao endogeni kontrola) i geni ispituje , Svaka grupa reakcije uključuju pozitivnu kontrolu iz komercijalnih ljudska pluća i RNA jetre (Stratagene, La Jolla, CA, USA) kao kalibratora i negativne kontrole bez RNA i reverzne transkriptaze. Predložak cDNA je sa specifičnim početnica i proba koriste Taqman Univerzalni Master Mix (tnom City, CA, USA). Relativni ekspresije gena kvantifikacijama su izračunate prema usporednom Ct metode. Konačni rezultati su određena izrazom formule mRNA razina = 2 - △△ st [6], [23], a analizirani su s Stratagene softver pregled, pouzdanosti i stabilnosti testu ekspresije gena u plazmi Netlogu. reproducibilnost testa ekspresije gena je testira istovremeno s dva načina. Za prvu metodu, uzorci krvi pet pacijenata su sakupljeni od prvog dana do petog dana prije operacije u isto vrijeme svaki dan. Tijekom tog razdoblja, bolesnici primili ni kemoterapiju niti poseban tretman. Razine ekspresije gena (visoka /srednji vs nizak) određene su za svaki uzorak, a postotak identičnih rezultata izračunat je za svakog pacijenta. Za drugu metodu uzeta je krv po jednom od daljnjih deset bolesnika, a svaki je uzorak podijeljen je u pet cijelih brojeva. Razine ekspresije gena (visoka /srednji vs nizak) su određena za svaku alikvota, a postotak identičnih rezultata izračunat je za svakog pacijenta. Stopa obnovljivost je definirana kao prosjeka svih 15 postotaka (5 pacijenata iz metodom jednog i 10 bolesnika s metodom dva).
Kako bi se testirala stabilnosti uzoraka krvi, različite plazma alikvot od istog uzorka dobiveni su na temelju različiti uvjeti. Alikvoti su inkubirani na sobnoj temperaturi ili na ledu tijekom 30 min, 1 h, 1,5 h i 2 h. QRT-PCR je nakon toga provedena, a sirovo ΔCt vrijednosti različitih gena su u usporedbi sa standardnim protokolima (ΔCt = Ct Gene-CT ACTB). pregled Statistički analizira pregled Mann-Whitney U- test i Kruskal-Wallis test je korišten za testiranje asocijacija između razine mRNA te kliničkih osobina, a između osjetljivosti na svaki kemoterapijski agens i kliničkih karakteristika. Spearman rank korelacija test korišten je za procjenu korelacije između in vivo pregled i in vitro
stopa inhibicije i između plazme i tumor ekspresije mRNA razinama. Mann-Whitney U-test je korišten za usporedbu razina ekspresije mRNA između uzoraka tumora koji pokazuju in vitro
osjetljivosti ili otpornost na docetaksela i pemetreksed. Prijemnik karakteristike (ROC) krivulje su konstruirane za procjenu osjetljivosti, specifičnosti i odgovarajuća područja ispod krivulje (AUC) sa svojim 95% intervala pouzdanosti (CIS). Istraživali smo optimiziranu cut-off vrijednosti za predviđanje povećavanjem zbroj osjetljivosti i specifičnosti, te umanjuje ukupnu pogrešku (kvadratni korijen iz zbroja [1 Sensitivity] 2 + [1 specifi grad] 2) i smanjenjem udaljenosti od cut-off vrijednosti u gornjem lijevom uglu ROC krivulje [24]. Svi statistički testovi bili obostrani, a značajnost postavljena je na P Netlogu < 0.05 (dvostrani). Sve analize su izvedene korištenjem SPSS, verzija 16,0.

• Uloga osi CCL22-CCR4 u metastaza želučanih stanica raka u omental mliječno spots
• Prognostički učinci razine 25-hidroksivitamina D u želučanom cancer