ARNm de plasma los niveles de expresión de los genes BRCA1 y TS como potenciales biomarcadores predictivos de la quimioterapia en el cáncer gástrico

ARNm de plasma los niveles de expresión de los genes BRCA1 y TS como potenciales biomarcadores predictivos de la quimioterapia en el cáncer gástrico
Resumen Objetivo
personalizada quimioterapia basados ​​en biomarcadores predictivos puede maximizar la eficacia. Sin embargo, el tejido tumoral obtenido en el momento del diagnóstico inicial no reflejará alteraciones genéticas observadas en el momento de la progresión de la enfermedad. Hemos examinado si los niveles de mRNA de plasma pueden ser un sustituto de los niveles tumorales en la predicción de la quimiosensibilidad.
Métodos Hoteles en 150 pacientes con cáncer gástrico, los niveles de mRNA de los genes BRCA1 y TS fueron evaluados en plasma y tejido tumoral emparejados. Se utilizó la prueba U de Mann-Whitney para comparar los niveles de expresión de mRNA entre muestras tumorales in vitro que muestran
sensibilidad o resistencia a docetaxel y pemetrexed. Todas las pruebas estadísticas fueron de dos caras: Resultados de la
Se encontraron correlaciones significativas entre los niveles plasmáticos y de mRNA de los genes BRCA1 tumor (rho = 0,696, P < 0,001). Y TS (rho = 0,620, P < 0,001). BRCA1 niveles en plasma (docetaxel sensible: 1,25; docetaxel resistente: 0,50, P Hotel < 0,001) y el tumor (docetaxel sensible: 8,81; docetaxel resistente: 4,88, P Hotel < 0,001) fueron positivamente asociada con la sensibilidad docetaxel. los niveles de TS en el plasma (pemetrexed sensible: 0,90;-pemetrexed resistentes: 1,82, P Hotel < 0,001) y el tumor (pemetrexed sensible: 6,56; pemetrexed resistente: 16.69, P Hotel < 0,001) fueron negativamente asociada con la sensibilidad de pemetrexed.
Conclusiones
ARNm plasma los niveles de expresión reflejar las del tumor y pueden tener un papel prometedor como potenciales biomarcadores predictivos para la quimioterapia.
Palabras clave
plasma ARNm cáncer gástrico quimiosensibilidad predictivo biomarcador HDRA Introducción Francia El régimen de quimioterapia estándar de primera línea para el cáncer gástrico localmente avanzado o metastásico es cisplatino u oxaliplatino en combinación con otros fármacos, incluyendo docetaxel y pemetrexed [1], [2]. Sin embargo, la supervivencia media sigue siendo exigua - alrededor de un año. No existe un método estándar para la terapia de segunda línea, aunque docetaxel ha mostrado cierta actividad [3]. la quimioterapia personalizada basada en la expresión de ARNm de los biomarcadores predictivos podría ayudar a maximizar la eficacia del tratamiento y prolongar la supervivencia en estos pacientes [3] - [8].
gen de susceptibilidad al cáncer de mama 1 (BRCA1), un componente esencial en la reparación del daño múltiple de ADN caminos y vías implicadas en la respuesta celular al daño de los microtúbulos, se considera que es un modulador diferencial de la supervivencia con cisplatino y taxanos. Los estudios preclínicos y clínicos han informado de que el nivel de BRCA1 tumor está asociado con cisplatino y taxanos quimiosensibilidad. Tumor con alta expresión de BRCA1 es-800-a más de 1000 veces sensible a docetaxel, pero 10-1000 veces resistente al cisplatino [4]. Hemos observado anteriormente que los niveles de ARNm de BRCA1 en los derrames se asociaron negativamente con la sensibilidad al platino, pero asociados positivamente con la sensibilidad docetaxel en pacientes con cáncer gástrico [5]. Estos resultados fueron validados en pacientes gástricos que recibieron docetaxel segunda línea: la mediana de supervivencia fue de 9,5 meses en aquellos con niveles más bajos en BRCA1 tumor primario, 19.1 en aquellos con niveles intermedios y 25,8 meses en aquellos con niveles más altos (P = 0,006
) [3]. El pemetrexed es un nuevo tipo de análogo de ácido fólico quinazolina soluble en agua, actúa como un inhibidor de la timidilato sintasa directa y específica (TS). Bajo la expresión de la timidilato sintasa (TS) ha sido informado de que se asocia con la respuesta a la terapia basada en pemetrexed en cáncer de pulmón [7], [8].
Tejido tumoral es la principal fuente para el examen de biomarcadores en la actualidad. Sin embargo, el tejido tumoral puede ser a veces insuficiente para el análisis de la expresión génica. Por otra parte, el tejido tumoral obtenido en el momento del diagnóstico inicial puede no reflejar alteraciones genéticas observadas en el momento de la progresión de la enfermedad [9], ya que metastáticos y primarios tumores del mismo paciente puede variar en niveles genómicas, epigenéticos y transcriptomic [9] - [ ,,,0],13]. Además, la quimioterapia inicial puede en sí alterar los niveles de expresión de genes [14], [15]. Circulantes ácidos nucleicos libres de células tumorales podrían por lo tanto ser una herramienta útil, no invasivo para el seguimiento de los cambios durante el curso del tratamiento [10], obviando la necesidad de una re-biopsia en el momento de determinar el mejor tratamiento. Además, puede ser un sustituto útil cuando sólo una pequeña cantidad de tejido tumoral disponible. Nuestra experiencia anterior en el cáncer de pulmón demostró que los receptores de factor de crecimiento epidérmico (EGFR) mutaciones en el suero podría ser un buen marcador predictivo para pacientes con cáncer de pulmón que reciben inhibidores de tirosina quinasa de EGFR [16]. Además, TS mRNA plasma se puede detectar de manera no invasiva en la sangre antes de la cirugía y el nivel de expresión de plasma TS tenido un gran potencial como biomarcadores predictivos de la sensibilidad raltitrexed en el cáncer gástrico [17]. Hasta la fecha, sin embargo, poco se sabe sobre el uso potencial de ARNm de plasma para la predicción de la quimiosensibilidad de docetaxel y pemetrexed. Además, aunque ARN liberado en circulación es estable [10], [18], con los métodos actualmente disponibles, sólo una pequeña cantidad de ARNm se puede obtener a partir de plasma o suero, lo que limita tanto la eficacia de la extracción de ARNm y la consistencia de los ensayos de ARNm [10].
en el presente estudio, se adoptó un método práctico y conveniente para la detección de ARNm de plasma, basado en la purificación del ARN y RT-PCR cuantitativa (QRT-PCR), y se utiliza este método para examinar si los niveles de mRNA de plasma puede ser un sustituto de los niveles tumorales en la predicción de la quimiosensibilidad -. por primera vez en un estudio piloto de 40 pacientes y luego en una cohorte total de 150 pacientes
Materiales y métodos pacientes

entre octubre de 2010 julio de 2011, 150 recién -removed tumores gástricos y muestras de sangre pareadas de los mismos pacientes se obtuvieron del Departamento de Oncología y Cirugía general, hospital Torre del tambor de Nanjing, china. Todos los pacientes no han recibido cualquier quimioterapia antes de la cirugía. La fresca tumores gástricos y las muestras de sangre se mantuvieron a 4 ° C y se envía al laboratorio dentro de los 15 minutos de la colección. Francia El estudio fue aprobado por la Junta de Revisión Institucional de Ética del Hospital Torre del Tambor afiliado a la Facultad de Medicina de la Universidad de Nanjing, y el consentimiento informado por escrito fue proporcionado por todos los pacientes. Todos los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con el Comité de Coordinación de China sobre el Reglamento de la investigación del cáncer para el bienestar de los animales y la Ley de Protección de Animales. Todos los análisis y las pruebas de sensibilidad a los fármacos, análisis y experimentos de expresión génica en animales, se llevaron a cabo por diferentes investigadores que actúan de forma individual sin conocimiento de los resultados de los otros análisis.
Estudio de diseño
primer lugar hemos realizado un estudio piloto en 40 pacientes (Figura 1A). Para cada muestra de tumor, la sensibilidad a docetaxel y pemetrexed se examinó in vitro fotos: por ensayo de respuesta a los fármacos histocultivo (HDRA) [19] e in vivo fotos: por xenoinjertos en modelos de ratones inmunodeficientes [20] (archivo adicional 1: Figura S1 , disponible en línea AB). Además, tanto los xenoinjertos de ratón y las muestras de tumores frescos originales fueron fijados con formalina y embebido en parafina (FFPE) para el análisis de BRCA1 y expresión TS mRNA. BRCA1 y TS expresión también se analizó en las muestras de sangre pareadas. Figura 1 Diagrama de flujo que muestra la disposición y experimentos paciente realiza. estudio piloto en 40 pacientes (A) y la cohorte total de 150 pacientes con cáncer gástrico (B).
Sobre la base de los resultados del estudio piloto, se realizó para validar nuestros resultados en la cohorte total de 150 pacientes con cáncer gástrico (Figura 1B ). En esta cohorte, los mismos procedimientos se llevaron a cabo, con la excepción de la prueba in vivo
de quimiosensibilidad. Los niveles de mRNA en el plasma y en los tejidos tumorales FFPE de los genes BRCA1 y TS se evaluaron y se utilizó la prueba U de Mann-Whitney para comparar los niveles de expresión de mRNA entre muestras tumorales in vitro que muestran
sensibilidad o resistencia a docetaxel y pemetrexed.
para detalles completos de toda la metodología, véase la disposición 1, disponible en línea.
vitro
quimiosensibilidad en el estudio piloto y la cohorte total
tejidos tumorales frescas fueron enviadas al laboratorio en 4 ° C Hanks en equilibrada solución de sal con 1% de penicilina /estreptomicina. Las muestras se lavaron con solución salina equilibrada de Hanks dos veces y picado en trozos pequeños de aproximadamente 10 mg, que luego fueron colocados en superficies de colágeno preparados en microplacas de 24 pocillos. Las placas se incubaron durante 7 días a 37 ° C en presencia de los fármacos disueltos con RPMI suero de ternera 1640 medio que contiene 20% fetal y se mantuvieron en una atmósfera humidificada que contiene 95% de aire 5% de CO 2. Las concentraciones de fármacos fueron 100 g /ml de docetaxel [21], y 400 mg /ml para pemetrexed [7]. Se llevaron a cabo procedimientos HDRA según lo informado por Furukawa et al [19], con ligeras modificaciones. La tasa de inhibición se calculó usando la siguiente fórmula: Tasa de inhibición (%) = (1-T /C) x 100, donde T es la absorbancia media de tratados tumor /peso y C es la absorbancia media de tumor de control /peso. Todas las muestras se clasificaron en grupos sensibles y resistentes utilizando el método
valor mínimo de P modificado por Lausen y Schumacher [22].
En vivo
quimiosensibilidad en el estudio piloto
Cada quirúrgica del tumor recién retirado tejido se cortó en piezas de 3 x 3 x 3 mm 3, que fueron trasplantados dentro de los 30 minutos a 9-18 ratones inmunodeficientes atímicos, denominado un "panel". En cada panel, cuando el tumor creció hasta un tamaño de 50 a 100 mm 3, los ratones con xenoinjertos fueron aleatorizados para el tratamiento con docetaxel 15 mg /kg /d, ip o pemetrexed 20 mg /kg /d, ip o ningún tratamiento (control). volúmenes de los tumores individuales (V) se calcularon por la fórmula "V = (longitud x anchura x anchura) /2" y en comparación con los valores al inicio del tratamiento para obtener el volumen relativo del tumor. Los valores medianos tratados con-a de control de volumen relativo del tumor se denominaron "tasa de inhibición in vivo
" y se utilizaron para evaluar la sensibilidad a docetaxel o pemetrexed.
la expresión del ARNm en el estudio piloto y la cohorte total sobre Two mililitros de sangre se recogieron en tubos de EDTA antes de la cirugía, se mantuvieron a 4 ° C y se envían al laboratorio dentro de los 15 minutos. El ARN total de plasma se extrajo con TRIzol LS y cloroformo, y se purificó con el kit de PureLink RNA Mini (Ambion, Carlsbad, CA, EE.UU.). El ARN total de los tejidos tumorales FFPE se extrajo de acuerdo con un procedimiento específico (número de patente EP1945764-B1 Europea). Después de la extracción de ARN y la purificación, M-MLV Reverse Transcriptase Kit (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.) se utilizó para generar ADNc para Q-PCR para detectar la expresión de β-actina (ACTB - utilizado como control endógeno) y los genes examinados . Cada lote de reacción incluyó un control positivo de pulmón humano comercial y ARN de hígado (Stratagene, La Jolla, CA, EE.UU.) como calibradores y controles negativos sin ARN y transcriptasa inversa. Molde de cDNA se amplificó con los cebadores y sondas específicas utilizando TaqMan Universal Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA, EE.UU.). Cuantificaciones relativos de expresión génica se calcularon de acuerdo con el método comparativo Ct. Los resultados finales se determinaron mediante la expresión de mRNA nivel fórmula = 2 - △△ Ct [6], [23] y se analizaron con el software Stratagene
reproducibilidad y estabilidad del ensayo de expresión génica en el plasma
. la reproducibilidad del ensayo de expresión génica se ensayó simultáneamente con dos métodos. Para el primer método, se recogieron muestras de sangre de cinco pacientes de la primera día al quinto día antes de la cirugía a la misma hora cada día. Durante este periodo, los pacientes recibieron quimioterapia ni tampoco un tratamiento especial. niveles de expresión génica (alta /baja intermedios vs) se determinaron para cada muestra, y el porcentaje de resultados idénticos se calculó para cada paciente. Para el segundo método, se extrajo sangre una vez cada uno desde un diez pacientes adicionales, y cada muestra se dividió en cinco alícuotas. niveles de expresión génica (alta /baja intermedios vs) se determinaron para cada alícuota, y el porcentaje de resultados idénticos se calculó para cada paciente. La tasa de reproducibilidad se definió como el promedio de los 15 porcentajes (5 pacientes de un método de y 10 pacientes de método de dos).
El fin de probar la estabilidad de las muestras de sangre, diferentes alícuotas de plasma de la misma muestra se prepararon bajo condiciones distintas. Las alícuotas se incubaron a temperatura ambiente o en hielo durante 30 min, 1 h, 1,5 h o 2 h. a continuación, QRT-PCR se realizó, y los valores de Ct primas de genes diferentes se compararon con el protocolo estándar (Ct = Ct gen-Ct ACTB) analiza.
estadístico Francia El U de Mann-Whitney y la prueba de Kruskal-Wallis se utilizaron para evaluar asociaciones entre los niveles de ARNm y las características clínicas y entre la sensibilidad a cada agente quimioterapéutico y las características clínicas. Se utilizó la prueba de correlación de Spearman para evaluar la correlación entre la in vivo e in vitro

tasas de inhibición y entre los niveles plasmáticos y de expresión de mRNA de tumor. Se utilizó la prueba U de Mann-Whitney para comparar los niveles de expresión de mRNA entre muestras tumorales in vitro que muestran
sensibilidad o resistencia a docetaxel y pemetrexed. Características de funcionamiento del receptor (ROC) se construyeron para evaluar la sensibilidad, especificidad, y las respectivas áreas bajo las curvas (AUCs) con sus intervalos de confianza del 95% (IC). Hemos investigado el valor de corte optimizado para la predicción mediante la maximización de la suma de sensibilidad y especificidad y reducir al mínimo el error total (raíz cuadrada de la suma [1-sensibilidad] 2 + [ciudad 1-específi] 2) y reduciendo al mínimo la distancia del punto de corte de la esquina superior izquierda de la curva ROC [24]. Todas las pruebas estadísticas fueron de dos caras, y la significación se fijó en p Hotel < 0,05 (dos caras). Todos los análisis se realizaron con SPSS, versión 16.0.
Resultados
Características de todos los pacientes se muestran en la Tabla 1. La mayoría de los pacientes eran varones (73,3%), y la histología predominante fue el adenocarcinoma. Noventa y cuatro (62,7%) pacientes tenían enfermedad en estadio III. metástasis en los ganglios linfáticos estaban presentes en 115 (76,7%) patients.Table 1 Características de los pacientes
Característica
Estudio piloto
total de la cohorte *
N = 40

N = 150
N (%)
N (%)
Edad, años, mediana (rango)
63 (40-83)
64 (29-84) Sexo seguro
Hombre
31 (77,5)
110 (73,3)
9 (22,5) Mujer
40 (26,7)
La localización tumoral
distal del estómago página 12 (30,0)
57 (34,0)
proximal del estómago página 19 (47,5)
62 (41.3): perfil del estómago entero página 9 (22.5)
37 (24,7)
Etapa I

4 (10,0)
17 (11,3)
II página 9 (22,5)
34 (22,7)
III
25 (62,5)
94 (62,7)
IV página 2 (5.0) página 5 (3.3)
El grado histológico
1

• El papel de los ejes CCL22-CCR4 en la metástasis de células de cáncer gástrico en lechosa omental spots
• efectos pronósticos de los niveles de 25-hidroxivitamina D en cancer