Estabelecimento e caracterização de um modelo de metástases de cancro gástrico humano em ratinhos nus

Estabelecimento e caracterização de um modelo de metástase do câncer gástrico humano em ratinhos nu da arte abstracta
Fundo
Um modelo de rato de metástase de câncer gástrico humano é uma das ferramentas mais importantes para o estudo dos mecanismos biológicos do câncer gástrico humano subjacente metástase. Neste trabalho, foi estabelecido um modelo do rato do cancro gástrico metastático humano em ratinhos nus que tem uma maior taxa de formação de tumores e metástases do que os modelos existentes.
Métodos
Para gerar o modelo do rato do cancro gástrico metastático humano, fresco tecidos tumorais de pacientes que foram submetidos a cirurgia para câncer gástrico foram implantadas subcutaneamente na direita e virilhas de ratos nus esquerda. Quando o tecido implantado cresceu para um centímetro cúbico, os ratinhos foram mortos, e os tecidos de tumor foram examinadas e ressecado. Os tecidos tumorais foram implantadas em ratinhos nus e submetido a uma análise patológica, coloração imuno-histoquímica e PCR em tempo real para citoqueratina 8/18 (CK8 /18), E-caderina, vascular molécula-1 de adesão celular (VCAM-1) e intercelular molécula de adesão-1 (ICAM-1). Os ratos também foram analisadas para a metástase no seu peritoneu, a cavidade abdominal, e órgãos internos através de exame histopatológico. Os tecidos colhidos a partir destes órgãos foram examinados para a patologia.
Resultados
Após dez gerações de implantação, todos os ratinhos desenvolveram o crescimento do tumor implantado em posição, 94% dos ratinhos desenvolveram metástases para o retroperitôneo e vísceras. O tumor implantado e metastático mantidas as mesmas características histológicas em todas as gerações, e metástase foi observada no esófago, estômago, baço, fígado, rim, supra-renal, intestino, pâncreas e. Estes tumores metastáticos, não revelaram expressão detectável de CK8 /18, E-caderina, VCAM-1, ICAM-1 e.

Conclusões Este modelo irá servir como ferramenta valiosa para a compreensão do processo metastático de cancro gástrico humano.
Palavras-chave
modelos Caracterização Estabelecimento gástrica câncer Metástase rato fundo
o câncer gástrico é a quarta neoplasia maligna mais comum e a segunda principal causa de mortes por câncer apenas para o câncer de pulmão no mundo [1]. Embora o prognóstico dos pacientes com câncer gástrico precoce foi prolongado distintamente pelos métodos atuais de diagnóstico e tratamento, a taxa de sobrevida em 5 anos após o diagnóstico de pacientes com câncer gástrico com todas as fases é < 50% [2]. A metástase é responsável, em parte, pela alta mortalidade por câncer gástrico. A proporção de doentes com cancro gástrico morrer de metástases peritoneu é de aproximadamente 50% [3]. Portanto, metástase tornou-se um foco de muitos estudos com câncer gástrico. A metástase é um processo muito complexo, envolvendo vários passos consecutivos [4]. Os genes associados com a adesão celular, motilidade, proliferação, sobrevivência, metabolismo, e a transdução de sinal desempenha um papel importante na metástase do cancro [5-8]. Como estas proteínas trabalhar em conjunto para promover a metástase continua mal compreendida.
Um modelo do rato do cancro gástrico metastático é uma ferramenta extremamente valiosa para a compreensão do processo metastático. O primeiro modelo carcinoma humano em ratinhos nus foi criada em 1969 por Rygaard e Povlsen através de transplante hypodermical de tecido de câncer de cólon humano [9]. Embora o tumor transplantado manteve as suas características malignas, ele perdeu o seu potencial metastático, e a estrutura original e comportamento do tumor mudou [10]. Um modelo metastático de cancro do cólon humano foi construído pela primeira vez por Morikawa em 1988, utilizando células cancerígenas do cólon humano subserously implantados no ceco [11]. Este modelo mostrou crescimento do tumor e metástases do fígado ortotópico. Furukawa modificado ainda mais este modelo em 1993 por costura cirúrgica do tecido do cancro gástrico humano no gastria túnica serosa de ratos pelados [12]. Este modelo desenvolvido tumores de forma robusta e mostrou uma muito elevada taxa de metástase para o fígado. Uma vez que a interrupção da aderência do tecido tumoral altera o seu comportamento biológico e malignos, os modelos de ratinho descritos reteve a integridade dos tumores possibilitando um "paciente-like-modelo" [13, 14]. A partir de agora, muitos modelos de ratos com cancro gástrico metastático humano ter sido gerados por transplante ortotópico de tecido de câncer gástrico [15-18] Tours A modelos do rato do cancro gástrico metastático humano relatados até agora colocam múltiplos desafios.; o implante ortopédico em ratinhos nus necessária a cirurgia, e os tecidos de tumor implantados foram derivadas de linha celular de cancro gástrico humano, em vez de pacientes. Como resultado, o processo é demorado e pode provocar hemorragia intensa e morte em ratos. Além disso, embora a taxa de formação de tumores é quase ortotópico de 80-100%, a taxa de metástase não tão elevada; os tumores metastáticos do fígado taxas foram em 45-60% [16, 17], e que, com o peritoneu a uma meramente 40% [18]. Assim, a criação destes modelos de murganho poderia beneficiar de métodos melhorados que tornem mais fácil o transplante e resultar em uma metástase mais robusto. Neste relatório, nós descrevemos um mouse modelo de cancro do estômago humano metastático que aborda as questões a partir de modelos anteriores de rato. Nós estabelecemos o nosso modelo de rato com câncer de estômago humano metastático através de implante subcutâneo de tecidos tumorais derivadas cirurgicamente diretamente de pacientes com câncer gástrico. Comparado a outros modelos de ratos descritas anteriormente, este modelo de rato forma tumores em uma taxa elevada e mais importante, mostra metástases robusto.
Métodos
declaração Ética
Todos os protocolos envolvendo o uso de animais experimentais e tecidos tumorais de pacientes com câncer gástrico neste estudo foram aprovados pelo Comitê de Medicina e Instituto de Pesquisa de ciência da província de Gansu (grupo de ciência de animais de laboratório e em grupo ensaio clínico, número de referência: P201108150024) Ética, os programas aprovados incluem a recolha, tratamento e implantação de tumor os tecidos de pacientes com cancro gástrico, e a ressecção, armazenamento e análise de tecidos de tumor de ratinhos nus. Todos os participantes do estudo forneceu consentimento informado para participar do estudo.
Animais e tecidos tumorais clínicos
ratinhos nus BALB /C em 4-6 semanas de idade e 16-18 g de peso, tanto homens como mulheres, foram fornecidas pelo Instituto Shanghai Tumor e criados em condições (SPF)-free específico do patógeno. Os tecidos tumorais foram obtidas de pacientes com câncer gástrico submetidos a cirurgia no Hospital Tumor Gansu. Os tecidos tumorais foram implantadas fresco imediatamente após ressecção. Os dados clínicos dos pacientes estão listadas na Tabela 1 1.Table dados clínicos
Samplea
histopatológico de classificação
estágios clínicos
Taxa de metástases linfonodais

1º
adenocarcinoma pouco diferenciado
PT4aN3a M0 IIIc
7/30
2ª
moderadamente diferenciado adenocarcinoma
PT4aN0M0 IIb
0/12
3ª
ulcerativa tipo adenocarcinoma diferenciado moderadamente
PT4aN0M0 IIb
0/30
4
adenocarcinoma pouco diferenciado
PT4aN3a M0 IIIc
16/17
tecido câncer gástrico A1ST e 4 foram adenocarcinoma pouco diferenciado e ter metástases linfonodais. 2ª e 3ª foram moderadamente diferenciado adenocarcinoma e não têm metástase linfática
implantação subcutânea de tecidos tumorais frescas em ratinhos nus
Os tecidos tumorais frescas ressecados de pacientes com câncer gástrico foram cortadas para 1 peças milímetro cúbico que foram diluídas com DMEM médio, e depois implantadas subcutaneamente na direita e esquerda axilas e virilhas de ratos nu com agulha de 16 gague sob condições assépticas. Cada amostra foi implantado para quatro ratinhos, pedaços de 5-6 (0,8 mL) por ratinho. Os ratos nus foram criados em condição subsequentemente SPF, e o crescimento do tumor em ratinhos nus foi examinada diariamente. Uma vez que o tumor nos ratinhos nus tem crescido a um centímetro cúbico, o rato foi morto por deslocamento cervical e os tecidos de tumor foram examinadas e ressecado em condição asséptica. O tecido do tumor de cada ratos foi separada em três partes - um foi usado para outra rodada de implantação em ratos nus, o outro foi fixado em formol a 10% para exame anatomopatológico e imuno-histoquímica (IHQ) coloração para CK8 /18, E-caderina, VCAM-1 e ICAM-1, o terceiro foi armazenado em azoto líquido e em -80 ° C para análise em tempo real de PCR de CK8 /18, e-caderina, VCAM-1, ICAM-1 e. Os ratos foram dissecados e examinados para a metástase do tumor no seu peritoneu, a cavidade abdominal, fígado, baço, estômago, intestino, rins, pulmão e cérebro. tecidos colhidos foram fixados em formol a 10% para exame patológico.
Estabelecimento e caracterização de modelo do rato do cancro gástrico metastático humano
O tecido do tumor extirpado foi implantada subcutaneamente à direita e à esquerda virilhas de 5 ratinhos nus sob condições assépticas utilizando 5-6 peças (0,8 ml) por rato. O corte e diluição de tecido de tumor, crescimento de exame e ressecção do tumor em ratinhos nus, o armazenamento e o exame dos tecidos implantados tumorais, tecidos tumorais metastáticas, e órgãos de rato foram processados ​​tal como descrito acima. Tumor implantado tecidos foram passados ​​por dez gerações.
efeito do local de implantação sobre a taxa de metástase
Como descrito Examinar, o tecido gástrico humano implantado cancro de ratinhos nus foi implantada subcutaneamente a três grupos de ratinhos nus em diferentes sites sob condições assépticas. Uma média de 5-6 peças foram implantadas em ratinhos, com um grupo recebendo os tecidos do lado direito e virilha esquerda, o outro grupo na direita e à esquerda axilas, ea terceira em dois locais na parte de trás. Como mencionado acima, a análise de crescimento e ressecção do tumor em ratinhos nus foram tratados. Outras análises incluíram a análise do crescimento do tumor em diferentes locais e metástase no peritônio e da cavidade abdominal.
Implantação e metástase de anteriormente congelados e passadas tecido de cancro gástrico humano em ratinhos nus
Os tecidos de câncer gástrico humano implantados passadas de quarta e oitava geração por implantação em ratinhos nus foram armazenados em azoto líquido e implantado subcutaneamente em ratinhos nus no virilha direita e esquerda, tal como descrito acima. Outras análises incluíram a análise do crescimento do tumor em diferentes locais e metástases na cavidade do peritônio e abdominal.
Exame anatomopatológico dos tecidos gástricos humanos implantados e metastáticos de ratos nus
Os tecidos gástricos humanos implantados e metastáticos de câncer de ratinhos nus fixado em 10% de formaldeído, embebida em parafina, cortados em secções, manchado em coloração de hematoxilina-eosina (HE). As lâminas foram avaliadas usando um microscópio óptico Olympus BX50, e a aquisição de imagem foi realizada por meio do sistema da estação de trabalho 4.0 patológica Mias.
Coloração IHC
Os níveis de caderina-E, VCAM-1, ICAM-1, e CK8 /18 foram examinadas por imuno-histoquímica em tecidos tumorais implantadas e metastáticos de ratos nus e nas peças cirúrgicas utilizadas para a implantação. Secções utilizados para a coloração foram obtidos a partir de espécimes cirúrgicos, os tecidos de tumor implantados e metastáticos, e os tecidos que contêm tumores metastáticos. Os reagentes utilizados para a coloração foram SP-9000 ™ Histostain -plus kits, 3-3'-tetrahidrocloreto de diaminobenzidina (DAB) Kits, anticorpos monoclonais de rato primária contra a E-caderina (1: 200 de diluição), ICAM-1 (diluição 1: 500) e anticorpo primário policlonal de coelho contra a VCAM-1 (diluição 1: 500) (Beijing Zhongshan golden Bridge Biotechnology Co Ltd., Beijing, China). As lâminas de coloração IHC foram avaliadas independentemente por dois patologistas e qualquer diferença no resultado decisão foi resolvida por consenso. Intensidade de coloração foi avaliada como negativa, fraca, moderada ou forte. O microscópio e software de aquisição de imagem luz foram os mesmos que acima.
Extracção de ARN total e PCR em tempo real
O ARN total foi extraído por Trizol (Sheng gongo Biotecnologia, Xangai, China) a partir dos tecidos tumorais implantadas e metastáticos que cresceu em ratinhos nus e de espécimes cirúrgicos utilizados para implantação, seguindo as instruções do fabricante. O ADNc foi sintetizada por transcriptase inversa (Sheng gongo Biotechnology), de acordo com as recomendações do fabricante. A pré-mistura de SYBR Ex TaqTM (TaKaRa Biotecnologia, Dalian, China) foi utilizado para a PCR em tempo real. A reacção de 20 uL continha 10 ul de pré-mistura SYBR Ex TaqTM, molde de ADN de 1 ul, 0,4 ul de cada iniciador, e 8,2 ul dH 20. A condição dos ciclos de PCR foram: 37 ° C durante 5 min, 95 ° C durante 30 s, e 40 ciclos de 95 ° C durante 5 s a 60 ° C durante 30 s. O ARNm β-actina foi utilizada como controlo interno, e a mistura de reacção sem o ADN molde foi usado como controlo negativo. Todas as amostras foram medidos 3 vezes independentemente, e os dados quantitativos de PCR foram analisados ​​usando o método comparativo CT. Resumidamente, a diferença de limiar de ciclo, ΔCT, foi determinada como a diferença entre o gene e testado β-actina humana. Foram obtidos ΔΔCT por encontrar a diferença entre os dois grupos. A mudança vezes foi calculada como 2 -ΔΔCT. Os primers estão listadas na Tabela 2.Table 2 primers utilizados na PCR em tempo real
Gene
Atacante primário
reverso primer

β-actin
5'-TGGCACCCAGCA
5'-CTAAGTCATAGT
CAATGAA-3'
CCGCCTAGAAGCA-3'
E-cadherin
5'-GAGTGCCAACTG
5'-AGTCACCCACCT
GACCATTCAGTA-3'
CTAAGGCCATC-3'
ICAM-1
5'-TGTATGAACTGA
5'-CACCTGGCAGCG
GCAATGTGCAAGA-3'
TAGGGTAA-3'
VCAM-1
5'-GGCGCCTATACC
5'-AGAGCACGAGAA
ATCCGAAA-3'
GCTCAGGAGAA-3'
Resultados
formação de tumor e metástases
Entre as quatro ratinhos implantados com os espécimes cirúrgicos 1a, apenas um tumor desenvolvido no local do implante, por 76 dias (Fig. 1a). Vinte e cinco dias mais tarde, o rato foi morto por deslocamento cervical e analisados ​​para tumores. tecido tumoral a uma média de 1 centímetro cúbico de tamanho, exibido um envelope intacta e textura dura (Fig. 1b). Metástase no retroperitônio foi encontrado por inspeção visual (Fig. 1c). Nenhuma metástase foi detectado na sua peritoneu, cavidade abdominal, fígado, baço, estômago, intestino, rins, pulmão e cérebro. FIG. Um crescimento metastático do tumor a partir do tecido de cancro gástrico implantado cirurgicamente obtida (X 400). a, b: Implantado tecido de câncer cresceu para ~ 1 centímetro cúbico e exibido um envelope intacta e textura dura; c: Tumor metástase para o retroperitônio rato; d, e: O tecido implantado e os tumores metastáticos consistia de células de carcinoma pouco diferenciados e algumas células mesenquimais e vasos sanguíneos, com alguma semelhança com a cavidade glandular. As células cancerosas mostrou núcleo corado-escuros e citoplasma escasso e faltava a proporção normal de entre núcleo e citoplasma; f: Tumor implantado mostrando infiltração tecidual
análise patológica revelou que os tecidos tumorais implantadas e metastáticos consistiu em células de carcinoma pouco diferenciados, e apenas um pouco de mesênquima e dos vasos sanguíneos. Estes tecidos apareça difusa, faltava a estrutura, e se assemelham lúmen glandular. Além disso, as células apresentado núcleos corados-escuro, citoplasma escasso, e núcleos misproportioned e citoplasma (Fig. 1D, E, F). Resultados semelhantes foram obtidos num estudo paralelo, envolvendo a implantação do tecido de tumor em 4 murganhos; apenas um rato tumor desenvolvido (tamanho médio: 1,5 centímetro cúbico) 26 dias após a implantação. Nenhuma metástase foi observada na sua peritoneu, cavidade abdominal, fígado, baço, estômago, intestino, rins, pulmão e cérebro. Os outros ratos implantados com o 2º e 4º espécimes cirúrgicos não mostrou o crescimento do tumor.
Estabilidade do tumor implantado seguinte passagem em várias gerações
O tumor que se desenvolveu a partir de 1 peça cirúrgica foi passada por dez gerações. A taxa de crescimento do tumor foi de 100% e o de metástases em retroperitôneo e vísceras foi de 80-100% (média de 94%), independentemente de o tecido primário foi utilizado fresco ou congelado (Tabela 3). A metástase vísceras foi observada nos nódulos linfáticos em torno esófago, abaixo da mucosa gástrica, túnica serosa gastria, baço, área portal hepática, cavas central e hepaticus sinusal, parênquima hepático, cápsula do fígado, hilo renal, parênquima renal, glândula supra-renal, serosa intestino, pâncreas, e spermaduct (Fig. 2). O tempo de geração é de 16 days.Table 3 Estabilidade e taxa de metástase de tumores implantados em diferentes positionsa
Variável
Sem
Crescimento na posição implantado (%)
metástase retroperitônio (%)
Vísceras (%)
Geração de tempo (dias)
número Passage
primeira
5
100 (5/5 )
100 (5/5)
80 (4/5)
20
segundo
5
100 (5/5)
80 (4/5)
100 (5/5)
14
3ª
5
100 (5/5)
100 (5/5)
80 (4/5)
14
4
5
100 (5/5)
80 (4/5)
100 (5/5)
15
quinta
5
100 (5/5)
100 (5/5)
80 (4/5)
14
sexta
5
100 (5/5)
80 (4/5)
100 (5/5)
13
7ª
5
100 (5/5)
100 (5/5)
100 (5 /5)
17
8ª
5
100 (5/5)
100 (5/5)
100 (5/5)
18
9º
5
100 (5/5)
100 (5/5)
100 (5/5)
17
10º
5
100 (5 /5)
100 (5/5)
100 (5/5)
18
armazenado em nitrogênio líquido
4
5
100 (5/5)
100 (5/5)
100 (5/5)
17
8ª
5
100 (5/5)
100 (5/5)
100 (5/5)
18
Implantação na posição diferente
Virilhas
50
100 (50/50)
94 (47/50)
94 (47/50 )
16
Voltar
10
100 (10/10)
30 (3/10)
10 (1/10)
20
Axilas
10
100 (10/10)
0 (0/10)
30 (3/10)
14
um Depois de dez gerações de implantação, todos os ratinhos desenvolveram o crescimento do tumor na posição implantado, e 94% dos ratinhos desenvolveram metástases para o retroperitônio e vísceras, independentemente se a fonte de tumor era fresco ou congelado. O tempo médio de portadores de tumor é de 16 dias. Virilha dos ratos é melhor posição de implantação, resultando em 94% retroperitônio e vísceras metástase
Fig. 2 O exame patológico do tumor com metástase para as vísceras (X 100). Micro-metástases foi observada nos nódulos linfáticos em torno do esófago (a), abaixo da mucosa gástrica (b), e em outras áreas, tais como a túnica serosa gastria (c), o parênquima sob cápsula hepática (d), a área portal hepática (e ), hepaticus sinusal (f), baço (g), cavas centrais hepática (h), pâncreas (i), hilo renal (J), parênquima renal (k), glândula supra-renal (l), serosa intestino (m), spermaduct (n), e pulmão (o)
a taxa de metástase do tumor implantado em posições diferentes
implantação em diferentes posições afectadas a taxa de metástase, mas não a taxa de crescimento do tumor. Implantação para a virilha resultou em 94% e metástase retroperitôneo vísceras; implante na parte traseira resultou em 30% de metástases retroperitôneo e 10% metástase vísceras; implantação em axilas não resultou em nenhuma metástase retroperitônio e 20% de metástase vísceras. O tempo de geração foi: 16 dias para tumores implantados nas virilhas, 20 dias para os implantados na parte de trás, e 14 dias para os implantados nas axilas (Tabela 3). As vísceras metastático incluídos no fígado (50%), do rim (44%), intestino (28%), o esófago (12%), pâncreas (12%), estômago (6%), no baço (6%), e spermaduct (6 %) (Tabela 4) .table 4 metástase para a posição visceraa
Implantado
Sem
vísceras metástase (%)
fígado (%)

Kidney (%)
Intestino (%)
Esôfago (%)
Pâncreas (%)
estômago (%)

Spleen (%)
Spermaduct (%)
Virilhas
50
94 (47/50)
50 (25/50)
44 ( 22/50)
28 (14/50)
12 (6/50)
12 (6/50)
6 (3/50)
6 (3/50)
6 (3/50)
Voltar
10
10 (1/10)
0
0
0
0
0
10 ( 1/10)
10 (1/10)
0
Axilas
10
30 (3/10)
20 (2/10)
0
0
10 (1/10)
0
0
0
0
um fígado e rim foram as vísceras com a maior taxa de metástase (44-50%), ea estômago, baço e spermaduct foram os mais baixos (6%)
Caracterização do tumor implantado e metastático in the IHC e em tempo real os resultados de PCR revelou que a ICAM-1, VCAM-1, e CK8 /18, mas não e-caderina, foram predominantemente expresso no momento da cirurgia e no tumor implantado de geração primária e primeiro (Fig. 3). Como mostrado na Tabela 5, a geração primária e primeira do tumor apresentou coloração positiva para VCAM-1 e CK8 /18, mas as gerações subsequentes mostraram coloração fraca para estas proteínas: VCAM-1 coloração foi marcado como moderadamente positiva (++) no primário, sinal fraco (+) na primeira geração, e CK8 /18 coloração foi marcado como sinal fraco (+) na primeira geração. Os tumores em todos os estádios mostrou coloração negativa para E-caderina, enquanto tumor metastático em todas as gerações apresentaram coloração negativa para E-caderina, ICAM-1, VCAM-1, e CK8 /18. Como para os transcritos, que detectado ARNm de VCAM-1 no tumor primário e de primeira geração implantados, mas não na fase metastático. E-caderina e ICAM-1 transcrições não foram detectadas em todas as gerações de tumores implantados e metastáticos. FIG. 3 análise IHC da expressão de E-caderina, VCAM-1, ICAM-1 e CK8 /18 (x 200). CK8 /expressão 18 foi detectado nas amostras cirúrgicas utilizadas para implante (a), e nos tecidos de tumores implantados primárias (b), mas não na geração implantados tecidos de tumor (C) F1, a VCAM-1 foi expressa na peça cirúrgica ( d), e nos tecidos de tumores implantados primários (e), mas não nos tecidos de tumores implantados geração F2 (F). A expressão da E-caderina não era detectável na peça cirúrgica (G) e nos tecidos tumorais implantadas primárias (h). ICAM-1 era expressa na peça cirúrgica (i), mas não nos tecidos de tumor primárias implantadas (j) Tabela 5
expressão de E-caderina, ICAM-1, VCAM-1 e CK8 /18 nos tumores em cirurgia, após a implantação e durante a metástase
variável
Sem
Protein expressãoA
mRNA expressãoA

E-cadherin

ICAM-1

VCAM-1

CK8/18

E-cadherin

ICAM-1

VCAM-1

surgical espécime
1
- +++
+++
+++
primária
1

• Resistência das bactérias ruminais murein a resistência lysozyme
• fibroblastos associados ao câncer são positivamente correlacionados com o potencial metastático de fibroblastos associados ao câncer gástrico cancers