Etablierung und Charakterisierung eines Metastasierung Modell des menschlichen Magenkrebs in Nackt mice

Etablierung und Charakterisierung eines Metastasierung Modell des menschlichen Magenkrebs in Nacktmäusen
Zusammenfassung
Hintergrund
Ein Maus-Modell der Metastasierung von menschlichen Magenkrebs ist eine der wichtigsten Werkzeuge für die biologischen Mechanismen menschlichen Magenkrebsmetastasen studieren zu Grunde liegen. In diesem Papier haben wir ein Mausmodell der metastatischen menschlichen Magenkrebs in Nacktmäusen, die eine höhere Rate der Tumorbildung und Metastasierung als bestehende Modelle hat.
Methoden
das Maus-Modell von metastasierendem menschlichen Magenkrebs zu erzeugen, frisch Tumorgewebe von Patienten, die Operation unterzogen für Magenkrebs haben wurden in der rechten und linken Buhnen von Nacktmäusen subkutan implantiert. Wenn das implantierte Gewebe 1 Kubikzentimeter wuchsen, wurden die Mäuse getötet und die Tumorgewebe wurden untersucht und reseziert. Die Tumorgewebe wurden in Nacktmäuse implantiert und zur pathologischen Untersuchung, immunhistochemische Färbung unterworfen, und Echtzeit-PCR für Cytokeratin 8/18 (CK8 /18), E-Cadherin, das vaskuläre Zelladhäsionsmolekül-1 (VCAM-1) und die interzelluläre Adhäsionsmolekül-1 (ICAM-1). Die Mäuse wurden auch für die Metastasierung in ihrem Bauchfell, Bauchhöhle, und die inneren Organe durch die histopathologische Untersuchung analysiert. Gewebe aus diesen Organen gesammelt wurden Pathologie untersucht.
Ergebnisse
Nach zehn Generationen Implantation alle Mäuse Tumorwachstum an der implantierten Position entwickelt, 94% der Mäuse entwickelten Metastasierung zur retroperitoneum und Eingeweide. Der implantierte und metastatischen Tumor aufrechterhalten die gleichen histologischen Merkmale in allen Generationen und die Metastasierung wurde in die Speiseröhre, Magen, Milz, Leber, Niere, Nebenniere, Darm und Bauchspeicheldrüse beobachtet. Diese metastasierten Tumoren zeigten keine nachweisbare Expression von CK8 /18, E-Cadherin, VCAM-1 und ICAM-1.
Schlussfolgerungen
Dieses Modell wird für das Verständnis der metastatischen Prozess der menschlichen Magenkrebs als wertvolles Werkzeug dienen.
Schlüsselwörter Charakterisierung Establishment Magenkrebs Metastasierung Mausmodelle hintergrund und Magenkrebs ist die vierthäufigste Krebserkrankung und die zweithäufigste Ursache für Todesfälle durch Krebs nur an Lungenkrebs in der Welt [1]. Obwohl die Prognose von Patienten mit Magenfrühkarzinomen durch aktuelle Methoden der Diagnose und Behandlung deutlich verlängert worden, die 5-Jahres-Überlebensrate nach der Diagnose von Magenkrebs-Patienten mit allen Stadien ist < 50% [2]. Metastasierung Konten teilweise für die hohe Sterblichkeit von Magenkrebs. Der Anteil der Patienten mit Magenkrebs vom Peritoneum Metastasierung sterben etwa 50% [3]. Aus diesem Grund hat die Metastasierung ein Fokus vieler Magenkrebsstudien geworden. Metastasierung ist ein sehr komplexer Prozess, an denen mehrere aufeinander folgende Schritte [4]. Gene, die mit der Zelladhäsion assoziiert, Motilität, Proliferation, Überleben, den Stoffwechsel und die Signaltransduktion eine wichtige Rolle bei der Metastasierung von Krebs [5-8] spielen. Wie diese Proteine ​​zusammen arbeiten Metastasierung zu fördern bleibt kaum verstanden. Ein Maus-Modell von metastasierendem Magenkrebs
ist ein äußerst wertvolles Werkzeug, um die metastatischen Prozess zu verstehen. Der erste menschliche Karzinom Modell in Nacktmäusen wurde 1969 von Rygaard und Povlsen durch hypodermical Transplantation von humanen Kolon-Krebsgewebe festgestellt [9]. Obwohl das transplantierte Tumor seine bösartigen Eigenschaften beibehalten, verlor es seine metastatische Potential, und die ursprüngliche Struktur und das Verhalten des Tumors verändert [10]. Ein metastasierendem Modell des menschlichen Dickdarmkrebs wurde zuerst von Morikawa 1988 unter Verwendung von humanen Darmkrebszellen subserously implantiert in Blinddarm [11] konstruiert. Dieses Modell zeigte orthotope Tumorwachstum und Lebermetastasen. Furukawa weiter dieses Modell 1993, geändert durch die chirurgisch menschlichen Magenkrebsgewebe in der Tunica serosa Gastria von Nacktmäusen [12] näht. Dieses Modell entwickelt Tumoren robust und zeigte eine sehr hohe Rate von Metastasen in der Leber. Da Störung der Adhäsion des Gewebes Tumor seine biologische und maligner Verhalten ändert beschriebenen Mausmodelle erhalten die Integrität der so dass Tumoren für eine "patient-like-Modell" [13, 14]. Im Folgenden haben viele Mausmodelle von metastasierendem menschlichen Magenkrebs durch orthotope Transplantation von Magenkrebsgewebe erzeugt [15-18] Die Mausmodelle von metastasierendem menschlichen Magenkrebs
berichtet bisher stellen mehrere Herausforderungen. die Orthese Implantation in Nacktmäusen erforderlich Chirurgie, und die implantierten Tumorgewebe aus menschlichen Zelllinie Magenkrebs abgeleitet wurden anstelle von Patienten. Als Ergebnis ist das Verfahren langwierig und kann schwere Blutungen und Tod in Mäusen verursachen. Darüber hinaus, obwohl die Rate der orthotope Tumorbildung ist fast 80-100%, die Rate der Metastasierung nicht so hoch; die Lebertumor metastatic Raten waren bei 45-60% [16, 17], und dass mit dem Peritoneum bei einer lediglich 40% [18]. Somit Einrichtung dieser Mausmodelle könnten von verbesserten Verfahren profitieren, die Transplantation leichter machen würde, und in einer robusteren Metastasierung führen. In diesem Bericht beschrieben wir ein Mausmodell des metastasierten menschlichen Magenkrebs, die die Probleme der vorherigen Mausmodellen befasst. Wir haben unsere Maus-Modell von metastasierendem menschlichen Magenkrebs durch subkutane Implantation des Tumors chirurgisch direkt von Patienten mit Magenkrebs abgeleitet Gewebe. Im Vergleich zu anderen Mausmodellen vorher beschrieben wurde, dieses Mausmodell bildet Tumoren mit einer hohen Rate und was noch wichtiger ist, zeigt robuste Metastasierung.
Methoden
Ethik Aussage
die alle Protokolle, die die Verwendung von Versuchstieren und Tumorgewebe beteiligt aus Patienten mit Magenkrebs in dieser Studie durch die Ethikkommission der Medizin und Wissenschaft Forschungsinstitut der Provinz Gansu (Labortiere Wissenschaft Gruppe und klinische Versuchsgruppe, Referenznummer: P201108150024) genehmigt wurden, inklusive der genehmigten Programme die Erhebung, Verarbeitung und Implantation von Tumor Gewebe von Patienten mit Magenkrebs und der Resektion, der Lagerung und Untersuchung von Tumorgewebe von Nacktmäusen. Alle Studienteilnehmer zur Verfügung gestellt informierte Zustimmung, an der Studie teilzunehmen.
Tiere und klinische Tumorgewebe
BALB /C-Nacktmäusen bei 4-6 Wochen alt sind und 16 bis 18 g Gewicht, sowohl männliche als auch weibliche, wurden zur Verfügung gestellt von Shanghai Tumor Institute und in spezifischen pathogenfreien (SPF) Zustand aufgezogen. Das Tumorgewebe wurden von Patienten mit Magenkrebs erhalten, die eine Operation in der Gansu Tumor Krankenhaus unterzog. Die frischen Tumorgewebe wurden unmittelbar nach der Resektion implantiert. Klinische Daten der Patienten sind in Tabelle 1.Table 1 Klinische Daten
Samplea
histopathologische Klassifizierung
klinischen Stadien
Rate von Lymphknotenmetastasen

1.
schlecht differenzierten Adenokarzinom
PT4aN3a M0 IIIc
30.07
2.
Adenokarzinom mäßig differenzierten
PT4aN0M0 IIb
0/12
3.
Colitis Typ mäßig differenzierten Adenokarzinom
PT4aN0M0 IIb
0/30
4.
schlecht differenzierten Adenokarzinom
PT4aN3a M0 IIIc
16/17
a1st und 4. Gewebe Magenkrebs waren schlecht differenzierten Adenokarzinom und Lymphknotenmetastasen haben. 2. und 3. wurden Adenokarzinom mäßig differenzierten und keine Lymphknotenmetastasen haben
Subkutane Implantation von frischem Tumorgewebe in Nacktmäuse
Die frischen Tumorgewebe von Patienten mit Magenkrebs reseziert wurden auf 1 Kubikmillimeter Stücke geschnitten, die mit DMEM verdünnt wurden Medium, und dann in die rechte subkutan implantiert und linken Achselhöhlen und Leistenbeugen von Nacktmäusen mit 16-gague Nadel unter aseptischen Bedingungen. Jede Probe wurde zu vier Mäuse implantiert, 5-6 Teile (0,8 ml) pro Maus. Die Nacktmäuse wurden in der Folge in den SPF-Zustand aufgezogen, und das Tumorwachstum auf Nacktmäusen wurde täglich untersucht. Sobald der Tumor an der Nacktmäusen bis 1 Kubikzentimeter gewachsen ist, wurde die Maus durch zervikale Dislokation und die Tumorgewebe wurden in aseptischen Bedingungen untersucht und reseziert getötet. Das Tumorgewebe von jeder Mäuse in drei Teile getrennt wurde - einen für eine weitere Runde der Implantation in nackte Mäuse verwendet wurde, wurde die andere für CK8 für pathologische Untersuchung und immunhistochemische (IHC) Anfärben in 10% Formaldehyd fixiert /18, E-Cadherin, VCAM-1 und ICAM-1 wurde die dritte in flüssigem Stickstoff und in -80 ° C für Echtzeit-PCR-Analyse von CK8 /18, E-Cadherin, VCAM-1 und ICAM-1 gespeichert. Die Mäuse wurden auf Tumormetastasen in ihrem Peritoneum Bauchhöhle, Leber, Milz, Magen, Darm, Niere, Lunge und Gehirn seziert und untersucht. Gesammelte Gewebe wurden für pathologische Untersuchung in 10% Formaldehyd fixiert.
Etablierung und Charakterisierung von Maus-Modell von metastasierendem menschlichen Magenkrebs
das Gewebe herausgeschnitten Tumor wurde auf der rechten Seite subkutan implantiert und Buhnen von 5 Nacktmäusen unter aseptischen Zustand gelassen mit 5-6 Stücke (0,8 ml) pro Maus. Das Schneiden und verdünnenden von Tumorgewebe, das Wachstum Untersuchung und Resektion des Tumors in den Nacktmäusen, Lagerung und Prüfung der implantierten Tumorgeweben, metastatischem Tumorgeweben und Mauskörper wurden wie oben beschrieben verarbeitet. Implantierte Tumorgeweben für zehn Generationen passagiert wurden.
Wirkung der Implantationsstelle Prüfungs auf die Rate der Metastasierung
Wie beschrieben, wurde das implantierte menschliche Magenkrebsgewebe von Nacktmäusen subkutan an verschiedenen zu drei Gruppen von Nacktmäusen implantiert Standorte unter aseptischen Bedingungen. Ein Durchschnitt von 5-6 Stücke wurden in Mäuse implantiert, wobei eine Gruppe die Gewebe an der rechten und linken Leistenbeugen, die andere Gruppe an der rechten und der linken Achselhöhle, und die dritte an zwei Stellen in der Rückseite empfängt. Wie oben erwähnt, Wachstumsuntersuchung und Resektion des Tumors in den Nacktmäusen wurden verarbeitet. Weitere Analysen einbezogen Untersuchung des Tumorwachstums an verschiedenen Standorten und Metastasen im Peritoneum und Bauchhöhle.
Implantierung und die Metastasierung von zuvor eingefroren und agierten menschliches Gewebe Magenkrebs in Nacktmäusen
Die implantierten menschlichen Magenkrebsgewebe vom vierten agierten und achten Generation durch Implantation in nackte Mäuse wurden in flüssigem Stickstoff gelagert und subkutan in Nacktmäuse implantiert am rechten und linken Leistenbeugen wie oben beschrieben. Weitere Analysen einbezogen Untersuchung des Tumorwachstums an verschiedenen Standorten und Metastasen im Peritoneum und Bauchhöhle.
Pathologische Untersuchung der implantierten und metastatischen menschlichen Magengewebe von Nacktmäusen
Die implantierten und metastatischen menschlichen Magenkrebsgewebe von Nacktmäusen waren in 10% Formaldehyd fixiert, in Paraffin eingebettet, in Abschnitte geschnitten, gefärbt in Hematoxylin-Eosin-Färbung (HE). Die Objektträger wurden in Olympus BX50 Lichtmikroskop ausgewertet, und die Bildaufnahme wurde von Mias pathologischen Workstation 4.0-System durchgeführt.
IHC-Färbung
Die Expression von E-Cadherin, VCAM-1, ICAM-1, und CK8 /18 wurden durch Immunhistochemie in den implantierten und metastasierten Tumorgewebe von Nacktmäusen und in den chirurgischen Proben verwendet für die Implantation untersucht. Bereiche für die Färbung verwendet wurden aus den chirurgischen Proben, die implantierten und metastasierten Tumorgewebe und das Gewebe erhalten, das metastasierten Tumoren enthalten. Reagenzien für die Färbung verwendet wurden, SP-9000 Histostain ™ -plus-Kits, 3-3'-Diaminobenzidintetrahydrochlorid (DAB) Kits, primären monoklonalen Maus-Antikörper gegen E-Cadherin (1: 200 Verdünnung), ICAM-1 (1: 500 Verdünnung) und primäre Kaninchen polyklonalen Antikörper gegen VCAM-1 (1: 500 Verdünnung) (Beijing Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co Ltd, Beijing, China). Die IHC-Färbung Objektträger wurden unabhängig voneinander von zwei Pathologen beurteilt und einen Unterschied im Entscheidungsergebnis wurde durch Konsens gelöst. Färbeintensität wurde als negativ, schwach, mittel oder stark bewertet. Das Lichtmikroskop und Bildaufnahme-Software waren die gleichen wie oben.
Gesamt-RNA-Extraktion und real-time PCR
Gesamt-RNA durch Trizol (Sheng Gong Biotechnology, Shanghai, China) von den implantierten und metastasierten Tumorgewebe extrahiert wurde, dass wuchs in Nacktmäusen und von den chirurgischen Proben für die Implantation verwendet wird, den Anweisungen des folgenden Herstellers. Die cDNA wurde durch reverse Transkriptase (Sheng Gong Biotechnology) synthetisiert, entsprechend den Empfehlungen des Herstellers. Die SYBR Vormischung Ex TaqTM (Takara Biotechnology, Dalian, China) wurde für die Echtzeit-PCR verwendet. Der 20-ul-Reaktion enthielt 10 ul SYBR Vormischung Ex TaqTM, 1 &mgr; l DNA-Matrize, 0,4 &mgr; l von jedem Primer und 8,2 ul dH 20. Die PCR-Zyklusbedingung war: 37 ° C für 5 min, 95 ° C für 30 s, und 40 Zyklen von 95 ° C für 5 s bis 60 ° C für 30 s. Die β-Actin-mRNA wurde als interne Kontrolle, und die Reaktionsmischung wurde als negative Kontrolle ohne Template-DNA verwendet. Alle Proben wurden 3 Mal unabhängig gemessen, und die quantitative PCR-Daten wurden unter Verwendung des Vergleichs CT-Methode analysiert. Kurz gesagt, wurde der Unterschied in Zyklus Schwellenwert, ACt, als die Differenz zwischen dem getesteten Gens und menschlichen β-Aktin bestimmt wird. Wir erhalten dann ΔΔCT durch den Unterschied zwischen den beiden Gruppen zu finden. Die Falte Änderung wurde als 2 -ΔΔCT berechnet. Die Primer werden in Tabelle 2 2.Table Primers in der Echtzeit-PCR verwendet aufgeführt
Gene
Vorwärtsprimer
umge primer

β-actin
5'-TGGCACCCAGCA
5'-CTAAGTCATAGT
CAATGAA-3'
CCGCCTAGAAGCA-3'
E-cadherin
5'-GAGTGCCAACTG
5'-AGTCACCCACCT
GACCATTCAGTA-3'
CTAAGGCCATC-3'
ICAM-1
5'-TGTATGAACTGA
5'-CACCTGGCAGCG
GCAATGTGCAAGA-3'
TAGGGTAA-3'
VCAM-1
5'-GGCGCCTATACC
5'-AGAGCACGAGAA
ATCCGAAA-3'
GCTCAGGAGAA-3'
Ergebnisse
Tumorbildung und Metastasierung Unter den vier Mäusen, die mit den ersten chirurgischen Proben implantiert, nur eine entwickelte Tumor an der Stelle der Implantation von 76 Tage (Fig. 1a)
. Fünfundzwanzig Tage später wurde die Maus durch zervikale Dislokation und analysiert für Tumoren getötet. Tumorgewebe bei einem Durchschnitt von 1 Kubikzentimeter in Größe, zeigte eine intakte Hülle und harte Textur (Fig. 1b). Metastase in der retroperitoneum wurde durch visuelle Inspektion (Abb. 1c) gefunden. Keine Metastasen wurde in seinem Peritoneum Bauchhöhle, Leber, Milz, Magen, Darm, Niere, Lunge und Gehirn nachgewiesen. Feige. 1 metastatischem Tumorwachstum aus dem implantierten Gewebe Magenkrebs erhalten chirurgisch (X 400). a, b: Implantierte Krebsgewebe wuchs Kubikzentimeter bis ~ 1 und zeigte eine intakte Hülle und harte Textur; c: Tumor metastasiert in die Maus retroperitoneum; d, e: Das implantierte Gewebe und metastasierten Tumoren bestand aus wenig differenzierten Karzinomzellen und einigen Mesenchymzellen und Blutgefäße, mit einer gewissen Ähnlichkeit mit Drüsenhöhle. Die Krebszellen zeigten dunkel gebeiztem Kernen und wenig Zytoplasma und es fehlte das normale Verhältnis zwischen Zellkern und Zytoplasma; f: implantierte Tumorgewebeinfiltration
Pathologische Analyse zeigt, ergab, dass die implantierte und metastatischem Tumorgewebe schlecht differenzierten Karzinomzellen bestand, und nur ein wenig von Mesenchym und Blutgefäße. Diese Gewebe erscheinen diffundiert, fehlte Struktur und Drüsenlumen ähneln. Darüber hinaus zeigten die Zellen dunkel gebeiztem Kerne, wenig Zytoplasma und misproportioniert Kerne und Zytoplasma (Abb. 1d, e, f). Ähnliche Ergebnisse wurden in einer Parallelstudie mit der Implantation der Tumorgewebe in 4 Mäusen erhalten; nur eine Maus entwickelt Tumor (durchschnittliche Größe: 1,5 Kubikzentimeter) 26 Tage nach der Implantation. Keine Metastasen wurde in seinem Peritoneum Bauchhöhle, Leber, Milz, Magen, Darm, Niere, Lunge und Gehirn beobachtet. Die anderen Mäuse, die mit dem zweiten implantierten und vierten chirurgischen Proben zeigten keine Tumorwachstum.
Stabilität des implantierten Tumors folgende Passage in mehrere Generationen
Der Tumor, der aus den ersten chirurgischen Probe entwickelt wurde für zehn Generationen agiert. Die Geschwindigkeit des Tumorwachstums war 100% und der Metastasierung in retroperitoneum und Eingeweiden war 80-100% (durchschnittlich 94%), unabhängig davon, ob das primäre Gewebe verwendet wurde, frisch oder gefroren (Tabelle 3). Die Eingeweide Metastasierung wurde in den Lymphknoten um Speiseröhre, unter Magenschleimhaut, Tunica serosa Gastria, Milz, Leber Portalbereich, zentrale venae und Sinus hepaticus, Leberparenchym, Leberkapsel, Nierenhilus, Nierenparenchym, Nebenniere, Darm serosa beobachtet, Pankreas und spermaduct (Fig. 2). Die Generationszeit beträgt 16 days.Table 3 Stabilität und Metastasierungsrate von an verschiedenen positionsa
Variable
implantierten Tumoren
Kein
Wachstum in implantierten Position (%)
Metastasierung retroperitoneum (%)
Viscera (%)
Generationsdauer (Tage)
Passage Nummer
1.
5
100 (5/5 )
100 (5/5)
80 (4/5)
20
2.
5
100 (5/5)
80 (4/5)
100 (5/5)
14
3.
5
100 (5/5)
100 (5/5)
80 (4/5)
14
4.
5
100 (5/5)
80 (4/5)
100 (5/5)
15
5.
5
100 (5/5)
100 (5/5)
80 (4/5)
14
6.
5
100 (5/5)
80 (4/5)
100 (5/5)
13
7.
5
100 (5/5)
100 (5/5)
100 (5 /5)
17
8.
5
100 (5/5)
100 (5/5)
100 (5/5)
18
9.
5
100 (5/5)
100 (5/5)
100 (5/5)
17
10.
5
100 (5 /5)
100 (5/5)
100 (5/5)
18
in flüssigem Stickstoff gelagert
4.
5
100 (5/5)
100 (5/5)
100 (5/5)
17
8.
5
100 (5/5)
100 (5/5)
100 (5/5)
18
Einpflanzung in verschiedenen Position
Groins
50
100 (50/50)
94 (47/50)
94 (47/50
) 16
Zurück 10
100 (10/10)
30 (3/10)
10 (1/10)
20
Armpits
10
100 (10/10)
0 (0/10)
30 (3/10) 14
a Nach zehn Generationen der Implantation alle Mäuse bei der das Tumorwachstum entwickelt implantierten Position, und 94% der Mäuse entwickelten Metastasen in der retroperitoneum und Eingeweiden, unabhängig davon, ob der Tumor Quelle frisch oder gefroren war. Die durchschnittliche Zeit, Tumor des Lagers ist 16 Tagen. Die Leiste von Mäusen ist am besten Implantierung Position, was zu 94% retroperitoneum und Eingeweiden Metastasierung
Abb. 2 Pathologische Untersuchung des Tumors, die zu den Eingeweiden (X 100) metastasiert. Mikrometastasen wurde in den Lymphknoten um die Speiseröhre (a) beobachtet, unter der Magenschleimhaut (b), und in anderen Bereichen wie Tunica serosa Gastria (c), Parenchym unter Leberkapsel (d), Leber Portalbereich (e ), Sinus hepaticus (f), Milz (g), Centrals venae Leber (h), der Bauchspeicheldrüse (i), Nierenhilus (j), Nierenparenchym (k), der Nebenniere (l), Darm serosa (m), spermaduct (n) und Lunge (o)
die Metastasierungsrate der in verschiedenen Positionen implantierten Tumor
Einpflanzung in verschiedene Positionen, die Rate der Metastasierung betroffen, aber nicht die Geschwindigkeit des Tumorwachstums. Einpflanzung in die Leiste führte in 94% retroperitoneum und Eingeweiden Metastasierung; Implantation in den Rücken in Folge 30% retroperitoneum Metastasierung und 10% Eingeweiden Metastasierung; Implantation in den Achselhöhlen führte zu keiner retroperitoneum Metastasierung und 20% Eingeweiden Metastasierung. Die Generationszeit war: 16 Tage in den Leistenbeugen, 20 Tage für diejenigen, die in den Rücken implantiert Tumoren und 14 Tage für die in den Achselhöhlen implantiert (Tabelle 3). Die metastatischen Eingeweiden enthalten Leber (50%), Niere (44%), Darm (28%), der Speiseröhre (12%), der Bauchspeicheldrüse (12%), Magen (6%), Milz (6%) und spermaduct (6 %) (Tabelle 4) .Tabelle 4 Metastasierung in die visceraa
implantierte Position
No
Eingeweiden Metastasierung (%)
Leber (%)

Kidney (%)
Darms (%)
Speiseröhren (%)
Pancreas (%)
Magen (%)

Spleen (%)
spermaduct (%)
Groins
50
94 (47/50)
50 (25/50)
44 ( 22/50)
28 (14/50)
12 (6/50)
12 (6/50)
6 (3/50)
6 (3/50)
6 (3/50)
Zurück 10
10 (1/10)
0
0
0
0
0
10 ( 1/10)
10 (1/10)
0
Armpits 10
30 (3/10)
20 (2/10)
0
0
10 (1/10)
0
0
0
0
eine Leber und Niere wurden die Eingeweide mit der höchsten Rate der Metastasierung (44-50%), und die Magen, Milz und spermaduct waren die niedrigsten (6%)
Charakterisierung des implantierten und metastasierten Tumor
der IHC und Echtzeit-PCR ergab Ergebnisse, dass ICAM-1, VCAM-1 und CK8 /18, aber nicht E-Cadherin, wurden überwiegend bei der Operation und in der implantierten Tumor der primären und der ersten Generation (Abb ausgedrückt. 3). Wie in Tabelle 5 gezeigt, ist der primäre und der ersten Generation des Tumors zeigte positive Färbung für VCAM-1 und CK8 /18, aber die nachfolgenden Generationen zeigten schwache Färbung für diese Proteine: VCAM-1-Färbung wurde als positiv bewertet mäßig (++) in dem primären, schwaches Signal (+) in der ersten Generation und CK8 /18-Färbung wurde als schwaches Signal (+) in der ersten Generation erzielt. Tumoren in allen Stadien zeigten negative Färbung für E-Cadherin, während metastatischer Tumor in allen Generationen negative Färbung für E-cadherin zeigte, ICAM-1, VCAM-1 und CK8 /18. Wie für die Transkripte wir VCAM-1-mRNA in der primären und der ersten Generation implantierten Tumor erkannt, aber nicht an der metastatischen Stadium. E-Cadherin und ICAM-1-Transkripte wurden in allen Generationen von implantierten und metastatischen Tumoren nicht nachgewiesen. Feige. 3 IHC-Analyse der Expression von E-Cadherin, VCAM-1, ICAM-1 und CK8 /18 (X 200). CK8 /18-Expression wurde in den Operationspräparat für die Implantation verwendet detektiert (a) und in den primären implantierten Tumorgeweben (b), aber nicht in der F1-Generation implantierten Tumorgewebe (c), VCAM-1 wurde in den chirurgischen Probe ausgedrückt ( d), und in den primären Tumorgewebe implantiert (e), aber nicht in der F2-Generation implantiert Tumorgewebe (f). E-Cadherin-Expression wurde in der chirurgischen Probe (g) nicht nachweisbar und in den primären implantierten Tumorgeweben (h). ICAM-1 wurde in den chirurgischen Probe (i) ausgedrückt, aber nicht in den primären implantierten Tumorgeweben (j)
Tabelle 5 Expression von E-Cadherin, ICAM-1, VCAM-1 und CK8 /18 in den Tumoren an Operation, bei der Implantation und während der Metastasierung
Variable
No
Protein expressiona
mRNA expressiona

E-cadherin

ICAM-1

VCAM-1

CK8/18

E-cadherin

ICAM-1

VCAM-1

surgical Probe
1
- +++ +++

+++
Primary
1 implantiertem Tumor
- -
++
+
0
0
0,0927
Metastase
-
- -
- 0
0
0
1.
5
implantierte Tumor
- (0/5)
- (0/5)
+ (5/5)
- (0/5 )
0
0
0,1997
Metastase
- (0/5)
- (0/5)
- (5/5)
- ( 0/5)
0
0
0
2. ~ 10.
45
implantierte Tumor
- (0/45)
- (0/45)
- (0/45)
- (0/45)
0
0
0
Metastase
- (0/42)
- (0 /42)
- (0/42)
- (0/42)
0
0
0
einem Molekularanalyse der implantierten und metastasierten Tumoren zeigten keine nachweisbare Expression von CK8 /18, E-Cadherin, VCAM-1 und ICAM-1, mit der Ausnahme positive Färbung für VCAM-1 im implantierten Tumorgewebe der ersten Generation
Discussion
Krebs durch Proliferation gekennzeichnet ist, Invasion und Metastasierung. Mehr als 90% der Krebssterblichkeit ist zur Metastasierung aufgrund dadurch intensiver Forschung Führung [19]. Metastasierung ist ein komplizierter und schlecht Prozess verstanden Proteine ​​mit Funktionen in der Zelladhäsion, ECM-Abbau beteiligt, und Motilität [19-21]. Zahlreiche Studien zu haben Magenkrebs Metastasen berichtet [22-26]. Aber andernfalls den meisten dieser Studien wurden in vitro durchgeführt, die metastatischen Prozess zu imitieren, die in vivo auftritt. Dies legt nahe, ein Bedarf an einem Tiermodell für Krebsmetastasen, die eine robuste und konsistenten Phänotyp aufweist. In der vorliegenden Studie wurde ein Modell des metastasierten menschlichen Magenkrebs wurde durch hypodermische Impfung in Nacktmäusen mit Krebsgewebe chirurgisch von Patienten mit Magenkrebs erhalten etabliert. Alle Mäuse entwickelten Tumorwachstum in der implantierten Position und retroperitoneum Metastasen, und 94% der Mäuse entwickelten Metastasen in den Eingeweiden, unabhängig davon, ob der Tumor Quelle war frisch oder gefroren. Das implantierte und Metastase die gleichen Eigenschaften in allen Generationen gehalten und die Eingeweide Metastasen in Lymphknoten um die Speiseröhre, unterhalb der Magenschleimhaut, Tunica serosa Gastria, Milz, Leber Portalbereich, zentrale venae und Sinus hepaticus, Leberparenchym beobachtet, Leberkapsel, Nierenhilus, Nierenparenchym, Nebenniere, Darm serosa und Bauchspeicheldrüse. Metastasierung war robust in diesem Mausmodell. Die retroperitoneum Metastasierung möglicherweise aus der Dissoziation von Tumorzellen aus dem implantierten Tumor, Einführung in die Inguinaldrüsen führte, und den Transport zum retroperitoneum. Dies kann für das Tumor-Konto Leber Portalbereich, zentrale venae metastasierenden in und Sinus Hepaticus sowie in Tunica serosa Gastria, Nierenhilus, Nebenniere, und Darm serosa. Metastasierung könnte auch durch die Lymphknoten aufgetreten ist; Tumore wurden in den Lymphknoten der Umgebung der Speiseröhre unterhalb Magenschleimhaut, Milz, Pankreas und Nieren-Parenchym beobachtet
Das Auftreten von Metastasen an der Stelle der Implantation subkutan abhängig zu sein scheint. Implantation in die Leiste in 100% retroperitonealen Metastasierung resultierte und 94% Eingeweiden Metastasierung; Implantation in die Rückseite führte in 30% retroperitoneum Metastasierung und 10% Eingeweiden Metastasierung; Implantation in den Achselhöhlen führte zu keiner retroperitoneum Metastasierung und 20% Eingeweiden Metastasierung. Diese Beobachtung ist mit Metastasen im Einklang mit Tumorwachstum Mikroumgebung einschließlich Blutgefäß und Lymphe Verteilung verbunden. Tatsächlich hat die Maus Leiste mehr Blutgefäße und Lymph-Netzwerke, die in die Bauchhöhle und Eingeweide fließen als die Rückseite. Obwohl die Achseln reichen Blutgefäße und lymphatischen Netzwerke haben, ist die Richtung der Vena anterograde, und die meisten von Lymphe verbinden mit der Lunge, Luftröhre und Pleura, Orte, an denen selten Magenkrebs transloziert wird. Daher ergibt sich die einfache Methode der subkutanen Implantation von Krebszellen in den Leisten von Nacktmäusen effizient in einem Modell von metastatischen menschlichen Magenkrebs. Dieses Modell hat eine höhere Eingeweiden Metastasierungsrate als die in der Literatur berichtet [13-18] und leicht auf andere Arten von Krebs beim Menschen angewendet werden.
Tumorinvasion mit anschließender Metastasen ist die Hauptursache für Morbidität und Mortalität bei Patienten mit Krebs. Krebsmetastasen ist ein komplexer Prozess, bei dem Tumorzellen von der primären Tumormasse trennen, wandern durch das Gefäßsystem, extravasate in andere Gewebe und wachsen in neue Tumoren [27-30]. Unter diesen verschiedenen Verfahren wird eine Veränderung in den Hafteigenschaften der primären Tumorzellen ein kritischer Faktor für die Tumorprogression [28]. Es wurde gezeigt, dass die Zelladhäsion für Tumorprogression verantwortlich ist, an denen Moleküle, die eine Rolle bei der Zell-Zell-Adhäsion und Zell-Matrix-Adhäsion [31-34] spielen. Zelladhäsion spielt eine wichtige Rolle in den beiden unterschiedlichen Stadien des Tumor metastatischen Prozess - die Ablösung vom Primärtumor und seine Haftung auf dem Kreislaufsystem [27]. Daher spielen Zelladhäsionsmoleküle eine kritische Rolle bei der Invasion und Metastasierung von einer Vielzahl von menschlichen Tumoren.
E-Cadherin spielt eine wichtige Rolle bei der Zell-Zell-Adhäsion in epithelialen Geweben [35]. Neben ihrer Rolle in normalen Zellen kann diese Zelladhäsionsmolekül eine wichtige Rolle in maligner Zelltransformation, Tumorentwicklung und Progression spielen. Der Verlust der Integrität Tumorgewebe kann zu lokalen Invasion führen [36]. Daher Verlust der Funktion von E-cadherin in Tumorgewebe korreliert mit Invasivität und Metastasierung von Tumoren [37]. Studien haben gezeigt, dass abweichende E-Cadherin-Expression mit dem Erwerb von Invasivität und fortgeschrittenen Tumorstadium für Magenkrebs assoziiert ist [38-40].
ICAM-1 und VCAM-1 sind sehr wichtige Zelladhesionsmoleküle zur Immunglobulin gehör Superfamilie. Die ICAM-1-Funktionen in der Zell-Zell und ECM-Adhäsion, einschließlich physiologische polymorphkernigen (PMN) tight Adhäsion und trans endothelialen Migration über die Lymphozyten Leukozyten-Integrine functionassociated Antigen-1 (LFA-1) (CD11a /CD18) und Makrophagen-1-Antigen ( MAC-1) (CD11b /CD18) [41]. Der VCAM-I vermittelt zelluläre Adhäsion über Integrin [42]. ICAM-1 spielt eine wichtige Rolle bei der Zell-Zell und Zell-ECM-Wechselwirkungen, insbesondere Tumorinvasion und Zytotoxizität von Lymphozyten. Studien haben gezeigt, dass sich die positive Expressionsrate von ICAM-1 mit Lymphknotenmetastasen und die Tiefe der Tumorinvasion verbunden war, und der VCAM-1-Expression positiv Magenkrebs waren mehr invasive und wurden mit mehr Lymphknotenmetastasen als VCAM-1-Expression negativ assoziiert diejenigen, [43-45]. Cytokeratin erscheinen auf allen Epithelzellen, einige nicht-epithelialen Zellen und die meisten Tumorzellen. Die Cytokeratine, aus der Intermediärfilament (IF) Proteinfamilie, sind Hauptkomponenten von Hornzellen und unterhält die Organisation von epithelialen Geweben. Studien haben gezeigt, dass die Zytokeratine sind sehr hoch konserviert und wichtig für die Gewebedifferenzierung. Derzeit sind mehr als 20 verschiedene Cytokeratine sind identifiziert worden [46], von denen CK 8, 18 und 19 sind die am reichlichsten in einfachen Epithelzellen. In der vorliegenden Studie zeigten die IHC und RT-PCR-Ergebnisse, dass die Expression von E-Cadherin-negativ ist, und die von ICAM-1, VCAM-1 und CK8 /18 positiv sind, in den chirurgischen Probe für die Implantation verwendeten, im Einklang mit Frühere Studien [38, 40, 43, 45]. Alle Autoren gelesen und genehmigt haben das endgültige Manuskript.

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