Creazione e caratterizzazione di un modello metastasi del cancro gastrico umano in topi nudi

Istituzione e caratterizzazione di un modello di metastasi del tumore gastrico umano in topi nudi
Abstract
sfondo
un modello murino di metastasi del tumore gastrico umano è uno degli strumenti più importanti per lo studio dei meccanismi biologici alla base del cancro gastrico umano metastasi. In questo lavoro, abbiamo stabilito un modello murino di cancro gastrico metastatico umano in topi nudi che ha un più alto tasso di formazione del tumore e metastasi rispetto ai modelli esistenti.
Metodi
Per generare il modello murino di carcinoma gastrico metastatico umano, fresco tessuti tumorali da pazienti che hanno subito un intervento chirurgico per cancro gastrico sono stati impiantati per via sottocutanea nella destra e inguine di topi nudi sinistra. Quando il tessuto impiantato è cresciuto a 1 centimetro cubo, i topi sono stati uccisi, ei tessuti tumorali sono stati esaminati e asportati. I tessuti tumorali sono stati impiantati in topi nudi e sottoposti ad esame patologico, colorazione immunoistochimica e real-time PCR per citocheratina 8/18 (CK8 /18), E-caderina, vascolare di adesione delle cellule molecola-1 (VCAM-1) e intercellulare molecola di adesione-1 (ICAM-1). I topi sono stati analizzati anche per le metastasi nella loro peritoneo, cavità addominale, e gli organi interni con l'esame istopatologico. I tessuti raccolti da questi organi sono stati esaminati per la patologia.
Risultati
Dopo dieci generazioni di impianto, tutti i topi hanno sviluppato la crescita del tumore alla posizione impiantato, il 94% dei topi ha sviluppato metastasi retroperitoneo e visceri. Il tumore impiantato e metastatico mantenuto le stesse caratteristiche istologiche attraverso tutte le generazioni, e le metastasi è stata osservata in esofago, stomaco, milza, fegato, reni, ghiandole surrenali, intestino e pancreas. Questi tumori metastatici non hanno rivelato espressione rilevabile di CK8 /18, E-caderina, VCAM-1 e ICAM-1.
Conclusioni
Questo modello servirà strumento prezioso per la comprensione del processo metastatico del cancro gastrico umano.
Parole
Caratterizzazione Istituzione gastrico metastasi del cancro del mouse modelli Sfondo
cancro gastrico è la quarta neoplasia più comune e la seconda causa di decessi per cancro solo al cancro del polmone nel mondo [1]. Anche se la prognosi dei pazienti con cancro gastrico precoce è stata prolungata distintamente per gli attuali metodi di diagnosi e trattamento, il tasso di sopravvivenza a 5 anni dopo la diagnosi di pazienti affetti da cancro gastrico con tutte le fasi è < il 50% [2]. Metastasi spiega in parte per l'alta mortalità da cancro gastrico. La percentuale di pazienti con cancro gastrico morire di metastasi peritoneo è pari a circa il 50% [3]. Pertanto, le metastasi è diventato un centro di molti studi di cancro gastrico. La metastasi è un processo molto complesso, che coinvolge più passaggi consecutivi [4]. Geni associati con l'adesione cellulare, la motilità, la proliferazione, la sopravvivenza, il metabolismo, e la trasduzione del segnale svolgono un ruolo importante nella metastasi del cancro [5-8]. Come queste proteine ​​lavorano insieme per promuovere la metastasi rimane poco conosciuta.
Un modello murino di carcinoma gastrico metastatico è uno strumento estremamente prezioso per la comprensione del processo metastatico. Il primo modello di carcinoma umano in topi nudi è stata fondata nel 1969 da Rygaard e Povlsen attraverso il trapianto di tessuto hypodermical cancro del colon umano [9]. Sebbene il tumore trapiantato conservato le sue caratteristiche maligne, ha perso il suo potenziale metastatico, e la struttura originale e il comportamento del tumore cambiato [10]. Un modello metastatico del tumore del colon umano è stato costruito da Morikawa nel 1988 utilizzando cellule tumorali di colon umano subserously impiantati in cieco [11]. Questo modello ha mostrato la crescita tumorale e metastasi epatiche ortotopico. Furukawa ulteriormente modificato questo modello nel 1993 da chirurgicamente cucitura dei tessuti cancro gastrico umano nel Gastria tunica sierose di topi nudi [12]. Questo modello sviluppato tumori robusto e ha mostrato un tasso molto elevato di metastasi al fegato. Poiché rottura della adesione del tessuto tumorale altera il comportamento biologico e maligni, i modelli murini descritti mantenuto l'integrità dei tumori che consentono una "-like-paziente modello" [13, 14]. D'ora in avanti, molti modelli murini di cancro gastrico metastatico umano sono stati generati da trapianto ortotopico di tessuto cancro gastrico [15-18]
I modelli murini di cancro gastrico metastatico umano segnalati finora pongono molteplici sfide.; l'impianto plantare in topi nudi richiesto un intervento chirurgico, ei tessuti tumorali impiantati sono stati ricavati da linea di cellule di cancro gastrico umano invece di pazienti. Di conseguenza, la procedura è lunga e potrebbe causare pesanti sanguinamento e di morte nei topi. Inoltre, anche se il tasso di formazione del tumore ortotopico è quasi 80-100%, il tasso di metastasi meno elevato; i tassi tumore metastatico del fegato erano al 45-60% [16, 17] e che con il peritoneo in un solo% 40 [18]. Così, la creazione di questi modelli di topo potrebbe beneficiare di migliori metodi che renderebbero più facile e il trapianto di tradursi in una metastasi più robusto. In questo rapporto, abbiamo descritto un modello murino di cancro dello stomaco metastatico umano che risolve i problemi da precedenti modelli di topo. Abbiamo stabilito il nostro modello murino di cancro dello stomaco metastatico umano attraverso l'impianto sottocutaneo di tessuti tumorali derivate chirurgicamente direttamente da pazienti con cancro gastrico. Rispetto ad altri modelli murini descritti in precedenza, questo modello di topo forma tumori ad un ritmo elevato e, soprattutto, mostra metastasi robusto
. Metodi
etica dichiarazione
Tutti i protocolli prevedono l'uso di animali da laboratorio e da tessuti tumorali i pazienti con cancro gastrico in questo studio sono stati approvati dal Comitato Etico di Medicina e Scienza Research Institute della provincia del Gansu (gruppo animali da laboratorio scientifico e il gruppo di sperimentazione clinica, il numero di riferimento: P201108150024), i programmi approvati inclusi la raccolta, l'elaborazione e l'impianto di tumore I tessuti di pazienti con cancro gastrico, e la resezione, la conservazione e l'esame dei tessuti tumorali da topi nudi. Tutti i partecipanti allo studio fornito il consenso informato per partecipare allo studio.
Animali e tumorali tessuti clinici
BALB /C topi nudi a 4-6 settimane di età e 16-18 g di peso, sia maschili che femminili, sono stati forniti da Shanghai Tumor Institute e allevati in specifici patogeni senza condizione (SPF). tessuti tumorali sono stati ottenuti da pazienti con cancro gastrico che hanno subito un intervento chirurgico presso l'Ospedale Tumori Gansu. I tessuti tumorali freschi sono stati impiantati subito dopo la resezione. I dati clinici dei pazienti sono elencate nella Tabella 1 1.Table dati clinici
Samplea
istopatologica classificazione
stadi clinici
Tasso di metastasi linfonodali

1 °
scarsamente differenziato adenocarcinoma
PT4aN3a M0 IIIc
7/30
2 °
moderatamente differenziato adenocarcinoma
PT4aN0M0 IIb
0/12
3 °
ulcerosa digitare moderatamente differenziato adenocarcinoma
PT4aN0M0 IIb
0/30
4 °
scarsamente differenziato adenocarcinoma
PT4aN3a M0 IIIc
16/17
a1st e 4 ° del tessuto cancro gastrico erano scarsamente differenziato adenocarcinoma e hanno metastasi linfonodali. 2 ° e 3 ° sono stati moderatamente differenziato adenocarcinoma e non hanno metastasi linfonodali
impianto sottocutaneo di tessuti tumorali freschi in topi nudi
I tessuti tumorali asportati freschi da pazienti con cancro gastrico sono stati tagliati a pezzi 1 millimetro cubo, che sono stati diluiti con DMEM media, e poi per via sottocutanea impiantato nella destra e sinistra ascelle e inguine di topi nudi con l'ago a 16 gague in condizioni asettiche. Ogni campione è stato impiantato a quattro topi, 5-6 pezzi (0,8 mL) per topo. I topi nudi sono stati successivamente allevati in condizioni SPF, e la crescita tumorale in topi nudi è stata esaminata quotidiana. Una volta che il tumore sui topi nudi è cresciuta a 1 centimetro cubo, il mouse è stato ucciso da dislocazione cervicale e tessuti tumorali sono stati esaminati e asportato in condizioni asettiche. Il tessuto tumorale da ogni topo è stato diviso in tre parti - uno è stato utilizzato per un altro giro di impianto in topi nudi, l'altro è stato fissato in 10% di formaldeide per l'esame patologico e immunoistochimica (IHC) colorazione per CK8 /18, E-caderina, VCAM-1 e ICAM-1, il terzo è stato immagazzinato in azoto liquido e -80 ° C per analisi in tempo reale PCR di CK8 /18, e-caderina, VCAM-1 e ICAM-1. I topi sono stati sezionati e esaminati per metastasi tumorali nella loro peritoneo, cavità addominale, fegato, milza, stomaco, intestino, reni, polmoni e cervello. tessuti raccolti sono stati fissati in formaldeide al 10% per l'esame patologico
. Istituzione e caratterizzazione del modello murino di cancro gastrico metastatico umano
Il tessuto tumorale asportato è stato per via sottocutanea impiantato a destra ea sinistra inguine di 5 topi nudi in condizioni asettiche con 5-6 pezzi (0,8 ml) per il mouse. Il taglio e la diluizione del tessuto tumorale, esame la crescita e la resezione del tumore in topi nudi, conservazione e l'esame dei tessuti tumorali impiantate, tessuti tumorali metastatiche, e organi di topo sono stati trattati come descritto sopra. tessuti tumorali impiantate sono stati diversi passaggi per dieci generazioni.
effetto del sito dell'impianto sul tasso di metastasi
Come descritto Esaminare, il tessuto del cancro gastrico impiantato umani da topi nudi è stato per via sottocutanea impiantato a tre gruppi di topi nudi a diverso siti in condizioni asettiche. Una media di 5-6 pezzi sono stati impiantati in topi, con un gruppo che ha ricevuto i tessuti in inguine destro e sinistro, l'altro gruppo alle ascelle destro e sinistro, e la terza in due siti nella parte posteriore. Come accennato in precedenza, l'esame la crescita e la resezione del tumore nei topi nudi sono stati elaborati. Ulteriori analisi incluso esame della crescita del tumore in diversi siti e le metastasi nel peritoneo e cavità addominale.
Impianto e le metastasi di precedenza congelati e diversi passaggi tessuti cancro gastrico umano in topi nudi
I tessuti di cancro gastrico umano impiantati diversi passaggi dal quarto e ottava generazione per impiantazione in topi nudi sono stati conservati in azoto liquido e sottocutanea impiantato in topi nudi a destra e sinistra pennelli come descritto sopra. Ulteriori analisi incluso esame della crescita del tumore in diversi siti e le metastasi nella cavità peritoneale e addominale.
Esame patologico del tessuto gastrico umano impiantati e metastatici da topi nudi
I tessuti tumorali impiantati e metastatici umani gastrici da topi nudi erano fissato nel 10% di formaldeide, inclusi in paraffina, tagliato in sezioni, colorate in ematossilina-eosina (HE). I vetrini sono stati valutati utilizzando un microscopio ottico Olympus BX50, e l'acquisizione di immagini è stata effettuata da Mias patologico sistema Workstation 4.0.
IHC colorazione
I livelli di espressione di E-caderina, VCAM-1, ICAM-1, e CK8 /18 sono state esaminate mediante immunoistochimica nei tessuti tumorali impiantati e metastatici da topi nudi e nei campioni chirurgici utilizzati per l'impianto. Sezioni utilizzati per la colorazione sono stati ottenuti dai campioni chirurgici, i tessuti tumorali impiantati e metastatici e tessuti contenenti tumori metastatici. I reagenti usati per la colorazione sono stati SP-9000 Histostain ™ -PLUS Kit, 3-3'-diaminobenzidina tetraidrocloride (DAB) kit, anticorpi monoclonali di topo primaria contro E-caderina (1: 200 diluizione), ICAM-1 (1: 500 diluizione) e primaria anticorpo policlonale di coniglio contro VCAM-1 (1: 500 diluizione) (Beijing Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co Ltd., Pechino, Cina). I vetrini di colorazione IHC sono stati valutati indipendentemente da due patologi, e l'eventuale differenza nel risultato decisione è stata risolta con il consenso. Colorazione intensità è stata valutata come negativo, debole, moderato o forte. Il microscopio e l'acquisizione di immagini software luce fosse la stessa di cui sopra.
Estrazione di RNA totale e real-time PCR
RNA totale è stato estratto da Trizol (Sheng gong Biotecnologie, Shanghai, Cina) dai tessuti tumorali metastatiche impiantati e che è cresciuto in topi nudi e dai campioni chirurgici utilizzati per l'impianto, seguendo le istruzioni del produttore. Il cDNA è stato sintetizzato da trascrittasi inversa (Sheng gong Biotecnologie), secondo le raccomandazioni del fabbricante. Il SYBR premiscelato Ex TaqTM (Takara Biotecnologie, Dalian, Cina) è stato utilizzato per la PCR in tempo reale. La reazione di 20 microlitri conteneva 10 ml SYBR premiscelato Ex TaqTM, 1 ml DNA stampo, 0,4 ml ogni primer, e 8.2 ml dH 20. La condizione ciclismo PCR era: 37 ° C per 5 min, 95 ° C per 30 s, e 40 cicli di 95 ° C per 5 s a 60 ° C per 30 s. L'mRNA β-actina è stato utilizzato come controllo interno, e la miscela di reazione senza il DNA stampo è stato utilizzato come controllo negativo. Tutti i campioni sono stati misurati per 3 volte in modo indipendente, e il quantitativo di PCR sono stati analizzati utilizzando il metodo CT comparativo. Brevemente, la differenza di ciclo soglia, ΔCT, è stato determinato come differenza tra il gene testato e β-actina umana. Abbiamo poi ottenuto ΔΔCT trovando la differenza tra i due gruppi. Il cambiamento volte è stato calcolato come 2 -ΔΔCT. I primer sono elencati nella tabella 2 2.Table Primer utilizzati per la PCR in tempo reale
Gene
Forward Primer
Reverse primer

β-actin
5'-TGGCACCCAGCA
5'-CTAAGTCATAGT
CAATGAA-3'
CCGCCTAGAAGCA-3'
E-cadherin
5'-GAGTGCCAACTG
5'-AGTCACCCACCT
GACCATTCAGTA-3'
CTAAGGCCATC-3'
ICAM-1
5'-TGTATGAACTGA
5'-CACCTGGCAGCG
GCAATGTGCAAGA-3'
TAGGGTAA-3'
VCAM-1
5'-GGCGCCTATACC
5'-AGAGCACGAGAA
ATCCGAAA-3'
GCTCAGGAGAA-3'
Risultati
formazione tumorale e metastasi
Tra i quattro topi impiantati con i campioni chirurgici 1 °, un solo tumore sviluppato al sito di impianto da 76 giorni (Fig. 1a). Venticinque giorni dopo, il mouse è stato ucciso da dislocazione cervicale e analizzato per i tumori. tessuto tumorale a una media di 1 centimetro cubo di dimensioni, appare una busta intatta e la consistenza dura (Fig. 1b). Metastasi in retroperitoneo è stato trovato da ispezione visiva (Fig. 1c). No metastasi è stata rilevata nella sua peritoneo, cavità addominale, fegato, milza, stomaco, intestino, reni, polmoni e cervello. Figura. 1 crescita metastatica del tumore dal tessuto impiantato cancro gastrico ottenuto chirurgicamente (X 400). a, b: Impiantato tessuto del cancro crebbe fino a ~ 1 centimetro cubo e visualizzata una busta intatta e la consistenza dura; C: tumore metastasi nel retroperitoneo del mouse; d, e: Il tessuto impiantato e tumori metastatici consisteva di cellule di carcinoma scarsamente differenziate e poche cellule mesenchima e dei vasi sanguigni, con una certa somiglianza con la cavità ghiandolare. Le cellule tumorali hanno mostrato nuclei scuri macchiati e scarso citoplasma e mancava la proporzione normale tra il nucleo e nel citoplasma; F: tumore Impiantato che mostra il tessuto infiltrazione
analisi patologica ha rivelato che i tessuti tumorali impiantati e metastatici consisteva di cellule di carcinoma scarsamente differenziate, e solo un po 'di mesenchima e dei vasi sanguigni. Questi tessuti appaiono diffusi, mancava la struttura, e assomigliano a lume ghiandolare. Inoltre, le cellule visualizzati nuclei scuro macchiato, scarso citoplasma, e nuclei misproportioned e il citoplasma (Fig. 1D, e, f). Risultati simili sono stati ottenuti in uno studio parallelo che coinvolge l'impianto del tessuto tumorale in 4 topi; tumore sviluppato (dimensione media: 1.5 centimetro cubo) solo un topo di 26 giorni dopo l'impianto. No metastasi è stata osservata nel suo peritoneo, cavità addominale, fegato, milza, stomaco, intestino, reni, polmoni e cervello. Gli altri topi impiantati con il 2 ° e 4 ° campioni chirurgici non ha mostrato alcuna crescita tumorale.
Stabilità del tumore impiantato seguente passaggio in più generazioni
Il tumore che si è sviluppato dal campione chirurgico 1 ° è stato diversi passaggi per dieci generazioni. Il tasso di crescita del tumore è stata del 100% e quella di metastasi in retroperitoneo e visceri era 80-100% (media 94%), indipendentemente dal fatto che il tessuto primario è stato usato fresco o surgelato (Tabella 3). La metastasi visceri è stata osservata nei linfonodi intorno all'esofago, al di sotto della mucosa gastrica, tunica sierose Gastria, milza, area del portale del fegato, vene centrale e hepaticus seno, parenchima epatico, capsula epatica, ilo renale, parenchima del rene, surrene, intestino sierosa, pancreas e spermaduct (Fig. 2). Il tempo di generazione è di 16 days.Table 3 di stabilità e di tasso di metastasi dei tumori impiantati in diverse positionsa
variabile
No
crescita in posizione impiantato (%)
metastasi retroperitoneo (%)
Viscera (%)
tempo di generazione (giorni)
numero Passage
1 °
5
100 (5/5 )
100 (5/5)
80 (4/5)
20
2 °
5
100 (5/5)
80 (4/5)
100 (5/5)
14
3 °
5
100 (5/5)
100 (5/5)
80 (4/5)
14
4 °
5
100 (5/5)
80 (4/5)
100 (5/5)
15
5 °
5
100 (5/5)
100 (5/5)
80 (4/5)
14
6
5
100 (5/5)
80 (4/5)
100 (5/5)
13
7
5
100 (5/5)
100 (5/5)
100 (5 /5)
17
8
5
100 (5/5)
100 (5/5)
100 (5/5)
18
9 °
5
100 (5/5)
100 (5/5)
100 (5/5)
17
10
5
100 (5 /5)
100 (5/5)
100 (5/5)
18
memorizzati in azoto liquido
4 °
5
100 (5/5)
100 (5/5)
100 (5/5)
17
8
5
100 (5/5)
100 (5/5)
100 (5/5)
18
impianto in diversa posizione
Inguini
50

• La resistenza dei batteri del rumine murein ai bovini lysozyme
• fibroblasti cancro-associata sono positivamente correlati con potenziale metastatico dei cancers