A análise de mutações PIK3CA em carcinoma gástrico e metanálise da literatura sugerem que exon-seletividade é uma assinatura do tipo de câncer

A análise de mutações PIK3CA em carcinoma gástrico e metanálise da literatura sugerem que exon-seletividade é uma assinatura do tipo de câncer da arte abstracta
Fundo
PIK3CA
é um dos genes mais frequentemente mutado em cancros humanos e é um alvo potencial para a terapia personalizada. O objetivo deste estudo foi avaliar a frequência e tipo de PIK3CA
mutações no carcinoma gástrico e compará-los com seus correlatos patológicos clínicos.
Métodos
Nós analisados ​​264 cancros gástricos, incluindo 39 com instabilidade de microssatélites (MSI ), por mutações nos dois hotspots PIK3CA
em exons 9 e 20 por sequenciação directa de ADN obtidas a partir de células cancerosas microdissecadas.
resultados
os casos com mutações foram 42 (16%). Todos eram missense heterozygous substituições de base única; o mais comum era H1047R (26/42; 62%) no exão 20 e a segunda foi Q546K (4/42; 9,5%) no exão 9. Todos os casos MSI mutantes (8/39) tinham a mutação H1047R. Nenhuma outra associação entre PI3KCA
mutações e seus co-variáveis ​​patológicos clínicos foi encontrado. Uma meta-análise das mutações que ocorrem nas mesmas regiões apresentados em 27 publicações mostrou que a relação entre o exão 20 e exon 9 prevalências foi de 0,6 (IC 95%: 0,5 -0.8) para o cólon, (IC 95%: 1,1 -2,3) 1,6 de mama , 2,7 (95% CI: 1.6 -4.9) para gástrica e 4,1 (IC 95%: 1,9 -10,3). para o câncer endometrial
Conclusões
A prevalência global de PIK3CA
mutações implica um papel importante para PIK3CA
no câncer gástrico. A falta de associação com qualquer condição patológica clínica-sugerem que as mutações em PIK3CA
ocorrer no início do desenvolvimento de cancro. A meta-análise mostrou que exon-seletividade é uma assinatura importante do tipo de câncer refletindo diferentes contextos em que surgem tumores.
Fundo
O câncer gástrico é a segunda causa de câncer de morte no mundo, embora sua incidência tem vindo a diminuir nos países ocidentais . Apesar dos avanços na sua caracterização molecular, até à data, o único tratamento eficaz é a cirurgia com intenção curativa e a média de sobrevivência de 5 anos é de 25% [1]
câncer gástrico esporádica podem surgir ao longo de duas grandes vias moleculares:. Um envolve bruta alteração cromossômica com várias perdas e ganhos de regiões cromossômicas grandes; a segunda é caracterizada por alterações somáticas difundidos em sequências genómicas repetitivas simples (microssatélites), como um resultado de ADN defeituosa complexo de reparação de emparelhamentos incorrectos. Estes tumores instáveis ​​último microssatélites são definidos (MSI), representam cerca de 15% de todos os tumores gástricos e estão associadas a um prognóstico mais favorável, tamanho maior, sexo feminino, idade avançada, menos envolvimento de gânglios linfáticos, histotipo intestinal e localização antral [2 ]. alterações freqüentes associadas a MSI incluem metilação do promotor de MLH1
[3] e as mutações de TGFBR2, IGFR2 Comprar e BAX
[4].
microssatélites estável (MSS) neoplasias gástricas mostrar um conjunto diferente de alterações: várias proto-oncogenes, incluindo MET
, FGFR2 Comprar e ERBB2
, são frequentemente amplificados [5] enquanto inactivação de ambos os alelos do gene TP53
por perda de heterozigosidade e mutação é a mais frequente genética evento associado a MSS fenótipo [6]. Além disso, a perda de TP73, APC
, DCC
, FHIT Comprar e TFF1
também são freqüentemente detectada [5, 7].
PIK3CA
é um gene que codifica para a p110 subunidade-alfa de fosfoinositide-3-quinase (PI3K). Recentemente, um papel fundamental como oncogene está emergindo para PIK3CA
, já que é um dos genes mais frequentemente atingidas por mutações somáticas em vários tipos de câncer humano [8, 9]. PI3K é parte de uma família de Ser-Thr-cinases, que interage com o bifosfato de fosfatidilinositol (PIP2-4,5) para produzir o trifosfato de fosfatidilinositol (3,4,5-PIP3), um segundo mensageiro com várias funções. PIP3 liga-se sobretudo ao domínio plekstrine homologia (PH) de um número de moléculas alvo e leva a sua activação através da membrana de direccionamento celular ou modulação da sua actividade. Uma das melhores alvos caracterizados de produtos lipídicos PI3K é a proteína quinase Akt. a activação da via PI3K /Akt foi demonstrado estar envolvida na regulação de várias funções celulares tais como a sobrevivência celular, crescimento celular e estimulação da angiogénese, da inibição de apoptose, a tradução de várias proteínas e, consequentemente, para o desenvolvimento de cancro [10, 11].
dos vinte exões que constituem o gene PIK3CA
, mais de 75% das mutações são encontrados em dois pontos quentes localizados nos exons 9 e 20, que codificam para os domínios de hélice e quinase, respectivamente [8]. A expressão das variantes mais comuns (E542K, E545K e H1047R) está associada com um aumento da actividade de cinase de lípido e é oncogénica tanto em coltures celulares e in vivo [12, 13]. Mutações que afetam os dois hot-spots foram recentemente demonstrou ser funcionalmente diferentes [14] e as respectivas taxas de mutação têm sido frequentemente relatados como associados a tipos específicos de câncer ou de recursos específicos do paciente [15, 16].
Neste estudo , analisamos 264 cancros gástricos para a presença de mutações nos exões 9 e 20, por meio de sequenciação directa, e correlacionado a presença de mutações com características clínicas-patológico, incluindo MSI fenótipo. Além disso, comparamos a prevalência de mutações que ocorrem nos dois exons com outros estudos que investigaram amostras primárias de câncer humano.
Métodos
pacientes e amostras
Nosso estudo incluiu 264 casos consecutivos de câncer gástrico avançado obtidas de pacientes submetidos a intervenção cirúrgica entre 1989 e 2003 na Universidade de Verona. Todos os pacientes foram tratados por remoção cirúrgica radical com margens livres de doença microscópica e não receber quimioterapia ou radioterapia pré ou pós-operatório. A classificação histológica foi de acordo com Lauren e 1997 do sistema TNM unificada para carcinoma gástrico foi utilizado para o estadiamento patológico. As características patológicas clínicas da série são detalhados na Tabela 1. Este estudo foi apresentado, analisado e aprovado pelo Comitê de Ética local da preocupação Verona Hospitais para incluir amostras utilizadas para esta análise. amostras de tumor foram obtidas com o consentimento informado do insititutions que forneceram os materials.Table 1 características clínicas de 264 casos de cânceres gástricos analisados ​​para mutações em PI3KCA.
Parâmetro
Categorias
Frequency
Sexo
F
89 (33,7%)
M
175 (66,3%)
Idade
média (sd)
67,4 (11,2)
Lauren
intestinal
170 (65,4%)
Mixed
27 (10,4%)
difusa
63 (24,2%)
pT Página 2
99 (37,4%) Sims 3
129 (48,7%)
4
36 (13,6%)
pN
0
53 (20,2%)
1
100 (38,0%)
2
80 (30,4%) Sims 3
30 (11,4%)
pM
0
215 (87,4%)
1
31 (12,6%)
Tumor Localização
Antrum
107 (40,5%)
corpo
72 (27,3%)
fundus
69 (26,1%)
Linitis
12 (4,5%)
coto gástrico
4 (1,5%)
MSI
MSI
39 (14,8%)
MSS
225 (85,2%)
a análise da mutação
DNA normal e tumor foi extraído de tecidos embebidos em parafina microdissecadas manualmente, conforme descrito [17]. Mononucleótido microssatélites BAT25
e BAT26
(localizados em intrões do MSH2
e KIT
genes, respectivamente) foram examinadas através de amplificação por PCR utilizando iniciadores marcados com corantes fluorescentes, como descrito [18]. A amplificação por PCR e sequenciamento de PIK3CA
exons 9 e 20 foram realizados como descrito [19], utilizando os seguintes iniciadores Exon9_Forward: GGGAAAAATATGACAAAGAAAGC; Exon9_Reverse: CTGAGATCAGCCAAATTCAGTT; Exon9_Sequencing: TAGCTAGAGACAATGAATTAAGGGAAA-3; Exon20_Forward: CTCAATGATGCTTGGCTCTG; Exon20_Reverse: TGGAATCCAGAGTGAGCTTTC; Exon20_Sequencing:.. Meta-análise foram identificados TTGATGACATTGCATACATTCG As diferenças de sequência
da sequência de referência NCBI via inspeção manual de eletroferogramas alinhados assistidas pelo pacote Mutation Surveyor software (SoftGenetics, State College, PA)
Para investigar a padrão de PIK3CA
mutações em outros estudos que envolvem gástrica, bem como outros tipos de cancro, foi analisada a prevalência de mutações em PIK3CA
dados já presentes na literatura e /ou a base de dados CÓSMICA [20]. As etapas realizadas para a busca, selecione papéis e recolher dados estão detalhados no Arquivo adicional 1. A lista completa de referências dos estudos incluídos é fornecida no Arquivo adicional 2.
análise estatística
Para meta-análise, as estimativas de prevalência em pool, razões de prevalência e intervalos de confiança foram calculados com base de efeitos fixos regressão de Poisson, ajustados para o número de casos analisados ​​por estudo. A prevalência e intervalos de confiança de estudos individuais foram avaliadas utilizando Clopper método de Pearson e [21]. Correlação da presença da mutação H1047R com características clínicas, patológicas, os valores de p e os intervalos de confiança foram avaliados por meio de análise de regressão logística. Correlação com a sobrevida foi avaliada por meio do teste log-rank. Para a regressão multivariada de Cox, foram selecionadas as variáveis ​​mais informativos entre os modelos que incluíram estado mutacional, usando uma 'frente' método passo a passo. Um valor de p inferior a 0,05 foi considerado significativo. Em todos os cálculos e ilustrações do pacote de software estatístico R foi utilizado [22].

Resultados Foram analisadas as sequências de exons 9 e 20 de gene PIK3CA
em 264 cânceres gástrico avançado. A lista e a frequência de mutações encontradas são detalhados na Tabela 2. Um total de 42 casos (15,9%; 95% CI 11,7% - 20,9%), continham pelo menos uma mutação nas regiões analisadas. Todas as mutações encontradas foram missense heterozygous substituições de base única. A mutação mais frequente era H1047R ocorrendo no local activo do domínio kinasic no exão 20 e que representa 62% de todas as mutações. A segunda mutação mais comum foi Q546K que envolve uma mudança de aminoácido no domínio helicase no exão 9 e representa 9,5% de todas as mutações found.Table 2 frequência de mutações PI3KCA encontrados em 264 cânceres gástrico, por tipo de mutação.

Mutation
frequência
geral (MSI apenas)
por cento /total de casos

A percentagem de casos /mutantes
Exon 9
E542K
2
0,76%
4,76%
E545K
2
0,76%
4,76%
Q546K
4
1,52%
9,52%
total de Mutations (ex. 9)
8
3,03%
Exon 20
M1043V
1

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