Mekanisme (e) for underliggende den magesekkbeskyttende virkning av etylacetat fraksjonen erholdt fra det rå metanol forlater ekstrakt av Muntingia calabura

mekanismen (e) for underliggende den magesekkbeskyttende virkning av etylacetat fraksjonen erholdt fra det rå metanol forlater ekstrakt av Muntingia calabura

Abstract
Bakgrunn
Muntingia calabura
L. (familie muntingiaceae), vanligvis kjent som jamaicansk kirsebær eller kerukup siam
i Malaysia, brukes tradisjonelt til å behandle ulike plager. Målet med denne studien er å belyse de mulige underliggende gastroprotective mekanismer for etylacetatfraksjonen (EAF) av Muntingia calabura
metanol forlater ekstrakt (MEMC).
Metoder
MEMC og dens fraksjoner ble utsatt for HPLC-analyse for å identifisere og kvantifisere tilstedeværelse av sine phyto-bestanddeler. Mekanismen for gastroptotection av EAF ble videre undersøkt ved anvendelse av pylorus-ligering gastrisk lesjon rottemodell (100, 250, og 500 mg /kg). Makroskopisk undersøkelse av magen, ble evalueringen av gastrisk innhold parametere som volum, pH, fri og total surhet, protein estimering, og kvantifisering av slim utført. Deltakelsen av nitrogenoksid (NO) og sulfhydryl (SH) forbindelsene ble evaluert og superoksid dismutase (SOD), gluthathione (GSH), katalase (CAT), malondialdehyde (MDA), prostaglandin E 2 (PGE 2) og NO-nivå i etanolinduserte magesekken vev homogenat ble bestemt. Resultater

HPLC-analyse bekreftet tilstedeværelsen av quercetin og gallussyre i EAF. I pylorus-ringsmodell, EAF signifikant (p
< 0,001) forhindre mage lesjon formasjonen. Volum av mageinnhold og totalt proteininnhold reduseres signifikant (p
< 0,01 og p
< 0,05, henholdsvis), mens fri og total surhet redusert i doser på 250 og 500 mg /kg (p
< 0,001 og p
< 0,05, henholdsvis). EAF også utvidet slim innhold signifikant (p
< 0,001). Forbehandling med N-nitro-L-arginin-metylester (L-NAME) eller N-etylmaleimid (NEM) reverseres den magesekkbeskyttende aktivitet av EAF. EAF behandling markert forbedres den SOD, GSH og CAT-aktiviteten og PGE 2 og NO-nivå mens dempende MDA nivå, i forhold til kjøretøyets hovedgruppe.
Konklusjoner
Som konklusjon, de underliggende gastrobeskyttende mekanismene for EAF kan være forbundet med antisekretorisk, deltakelse av slim, antiperoxidative, forbedring av antioksidantstatus, modulering av NO og SH forbindelser, stimulering av PGE 2 samt tilstedeværelse av quercetin og gallisk syre.
nøkkelord
Muntingia calabura
Brøk magesår Antisekretorisk Antioxidant Nitrogenoksid sulfhydrylforbindelsen prostaglandin quercetin gallisk syre Bakgrunn
magesår er en av de viktigste gastrointestinale forstyrrelser som påvirker betydelig antall mennesker rundt om i verden, mens vokser i forekomst og utbredelse globalt [1]. Enkelte forfattere henviser til magesår som den nye "pest" i det 21. århundre [2]. Det har blitt anslått at 14,5 millioner av den verdensomspennende befolkningen er berørt av magesår med en dødelighet på 4.08 million [3]. Patofysiologien av magesår er assosiert med ubalanse mellom aggressive og beskyttende faktorer i magen. Mage mucosal skade oppstår når skadelige faktorer "velde" et intakt slimhinne forsvar, og svekkelse av slimhinneforsvarsmekanismer [4]. De skadelige faktorer i denne sammenheng inkluderer alkohol inntak, syre og pepsin sekresjon, dårlig kosthold, stress, reaktive oksygenforbindelser (ROS), bruk av ikke-steroide antiinflammatoriske midler (NSAIDs) og Helicobacter pylori
infeksjon [5, 6]. På den annen side, de viktigste forsvars faktorer og mekanismer som har råd til slimhinne forsvar inneholde tilstrekkelig slimsekresjon og mucosal blodstrømning, bikarbonat sekresjon, intakt slim barriere, prostaglandiner, overflateaktive fosfolipider, økte nivåer av antioksidanter, aktivitet av anti-inflammatoriske forbindelser og tilstrekkelig nivåer av nitrogenoksid (NO) [6-8].
tiden, forebygging og behandling av magesår har fått mange av interesse og ble viktig utfordring og står overfor legemidlet i dag. Til dags dato, er det noen metoder som benyttes for å forhindre gastrisk sårdannelse, som omfatter forsterkning av den mukosale forsvar sammen med reduksjon av syresekresjon og dens nøytralisering, stimulering av gastrisk mucin syntese, forbedring av antioksidant nivåer i magen, og hemming av Helicobacter pylori
vekst [9]. Utskillelse av mavesyre er antatt å være den sentrale komponenten av magesår tross for tilstedeværelsen av flere årsaksfaktorer [7], og derfor hemming av syresekresjonen har en tendens til å være den viktigste terapeutiske mål for ulcer-sykdommer [10]. På den annen side, er en annen viktig faktor i patogenesen av magesår produksjon av reaktive oksygenarter (ROS). Fremstillingen av ROS og en samtidig reduksjon av antioksidant kapasitet forårsaker skade på de grunnleggende cellebestanddeler, som proteiner, lipider og nukleinsyrer, noe som resulterer i dannelsen av giftige forbindelser og forårsaker celledød på grunn av deres ekstreme reaktivitet [8, 11]. Derfor er kontroll av ROS formasjonen og mavesyre-sekresjon er avgjørende for behandlingen av disse sykdommer [12].
Aktuelle medisinske behandling av magesår inkluderer syre-stopper som reduserer syreutskillelse, protonpumpeinhibitorer, antibiotika for å utrydde Helicobacter pylori
og vev forings beskyttende midler slik som sukralfat og vismut cholinergics [13, 14]. Objektivfiltre disse stoffene har avtatt de sykelighet, men de er ofte forbundet med uønskede bivirkninger som hypersensitivitet, impotens, arytmi, blodkreft forstyrrelser, gynekomasti og antibiotikaresistens i det lange løp [15, 16]. Videre disse tilgjengelige medikamenter har også høy tilbakefallsrate, lav effekt i mage sår behandling og er ofte kostbare [5, 9, 10]. Det er derfor et stort behov for å finne en mer effektiv og sikker alternativ terapi for å behandle magesår. I denne sammenheng har bruken av medisinplanter fått interesse og fanget oppmerksomheten til mange forskere. Planteekstrakter kan være verdifulle og tjene som en ny kilde av legemiddelselskap i behandlingen av magesår der antisekretorisk, cellebeskyttende og antioksidantaktivitet, isolert eller i kombinasjon, er de tre viktigste funksjonene til en gastroprotective middel, som spiller en nøkkelrolle i mage mucosal beskyttelse [17].
anlegget Muntingia calabura
L. (familie muntingiaceae), vanligvis kjent som jamaicansk kirsebær eller kerukup siam
i Malaysia, er utbredt i hele den varme områder av Asia [18]. Flere medisinsk bruk er dokumentert på ulike deler av dette treet i Øst- og Sørøst-Asia, samt tropisk Amerika. Muntingia calabura er
blader, blomster, bjeffer og røtter har vært brukt som folkemedisin for å behandle hodepine, feber og begynnende forkjølelse. Ifølge peruanske folklore, er bladene som brukes til å gi lindring fra magesår og redusere hevelse av prostatakjertelen [19]. Dessuten er de også ansatt som antiseptisk, krampeløsende, og antidyspeptic middel [20, 21].
På den annen side er Muntingia calabura
rapportert å ha et bredt spekter av farmakologiske aktiviteter, som har vist seg vitenskapelig. Dette omfatter antitumor [20, 22], antibakteriell [23], antinocisepsjon [19, 24, 25], anti-inflammatorisk, antipyretisk [25], antioksidanter og antiproliferative [26] aktiviteter som oppvises av bladene av Muntingia calabura
, mens flere typer forbindelser har blitt isolert og identifisert fra bladene, røtter og stammer bjeffer av Muntingia calabura product: [20-22, 27, 28]. Det har blitt påvist ulike fytokjemikalier i bladene av Muntingia calabura
som flavonoider, saponiner, tanniner og triterpenes [29].
I vår forrige undersøkelse, har vi rapportert den mage aktivitet av flere fraksjoner hentet fra rå metanol ekstrakt av Muntingia calabura product: (MEMC) forlater mot etanol-indusert gastrisk lesjon i rotter [30]. Fra vår studie har vi funnet at etylacetat fraksjonen vesentlig lindre gastrisk sårdannelse og som utøves den mest effektive beskyttelse sammenlignet med de andre fraksjoner. Derfor er den foreliggende studien var rettet for å bestemme virkningsmekanismen som ligger til grunn den profylaktiske virkning av etylacetatet fraksjon avledet fra MEMC mot gastriske lesjoner i rotter.
Pylorus-ligering modellen som er brukt i denne undersøkelsen er en av de mest brukte modeller for å studere effekten av medikamenter på magesyre og slimsekresjon. Sår som er utviklet ved ligering av pylorus enden av magesekken er forårsaket av økning av gastrisk saltsyre (HCl) sekresjon og /eller stasis av syre, noe som fører til automatisk fordøyelse av mageslimhinnen og nedbryting av mageslimhinnebarrieren [31]. Derfor er midler som er i stand til å øke slimsekresjon (cytobeskyttende) og /eller redusere sekresjon av gastrisk aggressive faktorer, slik som pepsin og syre er effektive gastrobeskyttende midler [32]. På den annen side er det etanol-indusert ulcus-modell nyttige for å studere effekten av potensielle legemidler eller testing av stoffer som har cytobeskyttende og /eller antioksidantaktivitet [33].
Metoder
Kjemikalier
Kjemikaliene som brukes i denne studien er av analytiske karakterer og hadde blitt tilberedes umiddelbart før bruk. De følgende stoffer ble anvendt: ranitidin (Sigma Aldrich, USA), absolutt etanol (Fischer Scientific, USA), N-etylmaleimid (NEM) (Sigma-Aldrich, USA), N G-nitro-L-arginin-estere (L-NAME) (Sigma-Aldrich, USA), carbenoxolone (CBX) (Sigma-Aldrich, USA) og dietyleter (Fischer Scientific, USA).
Plantemateriale materiale~~POS=HEADCOMP
Muntingia calabura
bladene ble samlet fra deres naturlige habitat i Shah Alam, Selangor, Malaysia, mellom mai og august 2010. anlegget ble identifisert av en botaniker fra institutt for Biovitenskap (IBS), Universiti Putra Malaysia (UPM), Serdang, Selangor. En kupong prøven, SK 2466/14, har blitt deponert på UPM IBS Laboratory of Natural Products Herbarium.
Utvinning og fraksjonering av Muntingia calabura
later
Metode beskrevet av Zakaria et al. [26] og Sufian et al. [28] ble anvendt for å fremstille det rå ekstrakt av Muntingia calabura
blader og dens fraksjoner, henholdsvis. Fem hundre gram modnede blader ble lufttørket ved romtemperatur (27 ±
2 ° C) i 1-2 uker og malt til fint pulver. Metanol (MeOH) ble anvendt som løsningsmiddel for ekstraksjon. Pulveret ble fuktet i MeOH i et forhold på 1:20 (w /v) i 72 timer. Blandingen ble filtrert ved bruk av filtertrakt, bomull og Whatman No. 1 filterpapir. Den bløtlegging og filtreringen ble gjentatt på residuet for to ganger. Det oppsamlede fra hver ekstraksjon Filtratet ble slått sammen og inndampet i en rotasjonsfordamper ved 40 ° C under redusert trykk for å oppnå metanolekstrakt av Muntingia calabura plakater (MEMC). Det tørkede urene ekstrakt ble suspendert i MeOH og destillert vann (dH 2o) vann i forholdet 1: 2, hvilket gir en vandig MeOH-løsning. Blandingen ble fordelt i rekkefølge med forskjellige oppløsningsmidler, som var petroleter og etylacetat, hvilket ga petroleter fraksjon (PEF), etylacetat fraksjonen (EAF). Fraksjonene ble filtrert og inndampet til tørrhet under vakuum ved hjelp av rotasjonsfordamper. MEMC, PEF og EAF ble underkastet HPLC for å kvantifisere forbindelsen av interesse, som kan være assosiert med ekstraktet s magesekkbeskyttende virkning.
Identifikasjon og kvantifisering av phytoconstituents som er tilstede i EAF ved HPLC
metode som er beskrevet av Zakaria et al. [34] med små modifikasjoner ble tilpasset til å utføre den HPLC-analyse av EAF. I korthet, ble 10 mg av prøven ble suspendert i 1 ml metanol. Løsningene ble filtrert gjennom en filterpatron (porestørrelse 0,45 um) før bruk. Prøven ble analysert ved anvendelse av et HPLC-system (Waters Delta 600 med 600 Controller) med fotodiodeseriedetektor (PDA) (Waters 996). A C 18-kolonne (4,6 mm I.D. x 250 mm), pakket med 5 um diameter partikler ble anvendt. Den mobile fase var vann inneholdende 0,1% maursyre (A) og acetonitril (B). Startbetingelsene var 85% A og 15% B med en lineær gradient opp til 25% B ved t
= 12 min. Denne tilstand ble opprettholdt i 10 min. B ble redusert tilbake til 15%, den første tilstand, og ble opprettholdt inntil t
= 35 min. Ved t = 25 min
, returneres programmet til det opprinnelige løsningsmiddel blandingen. Strømningshastigheten var 1,0 ml /min, injeksjonsvolumet var 10 ul og bølgelengden var 280 nm for gallussyre og 330 nm for quercetin. kolonne ovn Den ble satt til 27 ° C. Stamløsninger av standardreferanser ble fremstilt i metanol ved en konsentrasjon mg /ml. Kromatografien topper ble bekreftet ved å sammenligne dens retensjonstid med de av referansestandarder og av de respektive UV-spektra. Kalibreringskurve for gallisk syre var Y = 29562x + 102 777 (R 2 = 0,9969) og quercetin var Y = 43236x - 81458 (R 2 = 0,999). All kromatografi operasjoner ble utført ved omgivelsestemperatur og i tre eksemplarer. HPLC-analysen ble utført i laboratoriet for Phytomedicine, medisinplanter Division, Forest Research Institute of Malaysia (FRIM), Kepong, Malaysia.
UHPLC-ESI analyse
UHPLC system ble utført på en Dionex 3000 UHPLC system kjøpt fra Thermo Fisher Scientific (USA) som besto av en autosampler utstyrt med en kolonne ovn, et brett kupé kjøligere, og en binær pumpe med innebygd løsemiddel gassutskiller. Den kromatografiske separasjon ble utført på en BEH C18 UHPLC kolonne, 100 mm x 2,5 um, 1,7 um (Waters) ved en strømningshastighet på 0,3 ml /min. De mobile faser anvendt var (A) 0,1% maursyre i vann og (B) 0,1% maursyre i acetonitril. Gradienten startet med 10% mobil fase B, og nådde 20% mobil fase B i 5 min, 60% mobil fase B i 17,0 min, ved isokratisk eluering med 90% B i 3 min. Gradienten nådd startbetingelsene ble holdt i 2 minutter som en re-ekvilibrering trinn. Injeksjonsvolumet var 10 ul og kolonnetemperaturen ble holdt ved 40 ° C. Den UHPLC Systemet ble koblet til en lineær ione-felle-Orbitrap massespektrometer Q Exactive fra Thermo Fisher Scientific (U.S.A) er utstyrt med en elektrospray-ionisering (ESI) kilde. Massen påvisning ble utført i et område på 150-1500 m /z. ESI kilde ble operert i negativ ion modus under følgende bestemte vilkår: source spenning, 3,2 kV; skjede gass, 35 vilkårlige enheter; hjelpe gass, 15 vilkårlig enhet; feie gass, 10 vilkårlig enhet; og kapillær temperatur, 320 ° C. Nitrogen (> 99,98%) ble ansatt som skjede gass, hjelpe og feie gass. Instrument kontroll og datainnsamling ble utført med Chameleon 6.8 software og Xcalibur 2.2 programvare (Thermo Fisher Scientific) for Dyr
Forsøkene ble utført på Sprague Dawley rotter. (180-200 g, 8-10 uker gamle). De ble hentet fra Animal Unit, Avdeling for medisin og helsefag, UPM, Malaysia. Dyrene ble holdt i polypropylen bur med tre barbering, matet med standard pellet og fri adgang til vann. De ble holdt i romtemperatur (27 ± 2 0 ° C, 70-80% luftfuktighet, 12 timer lys /mørke syklus) i Animal Holding Unit (UPM). Forut for alle analysene, ble rottene fastet. Standard preparater og MEMC ble administrert oralt (p.o.) ved gavage med 8% Tween 80 (10 ml /kg) som kjøretøyet. Bruk av dyr i denne studien ble godkjent av Animal Care og brukte Committee (ACUC) av UPM (Godkjenning: UPM /FPSK /PUTER /BR-uuh /00474)
Fastsettelse av mekanismen bak den mage aktivitet. EAF
Pyloric ligation
Metode av Shay et al. [35] med små modifikasjoner ble anvendt for å utføre pyloric ligering. Rottene ble tilfeldig inndelt i 5 grupper, med seks rotter i hver gruppe. Gruppe-I kontrollgruppen administreres sammen med 8% Tween 80 (kjøretøy) oralt (po), gruppe-II var den positive kontroll administrert med ranitidin ved 100 mg /kg (po), mens for gruppe-III, -IV og- V, rotter ble administrert med EAF (100, 250 og 500 mg /kg, henholdsvis). Pylorus ligering ble utført på 48 timer fastende rotter 1 time etter administrering av testforbindelsene. Under lett anestesi indusert ved hjelp av ketamin-HCl (100 mg /kg, intramuskulært) og xylazin HCI (16 mg /kg, intramuskulær), ble en 2 cm lang midtlinjen abdominal innsnitt utført, like nedenfor sternum. Pyloric del av magen ble forsiktig mobilisert og nøye ligert med et silke ligatur rundt pylorus sphincter i en stram knute. Care ble tatt mens gifte for å unngå interferens med mage blodtilførsel. Abdominal innsnitt ble sydd, huden ble renset for blod- flekker eller blødning og dyrene ble tillatt å komme seg etter anestesien.
Bestemmelse av gastrisk mucosal lesjon
Dyrene ble avlivet 6 timer etter ligering av eksponering til dietyleter og halshugging. De magene ble fjernet, og innholdet ble tømt ut, oppsamlet og sentrifugert. Magen ble åpnet langs den store kurvatur for å bestemme lesjonen skaden som beskrevet av Balan et al. [36]. Den prosentvise beskyttelse ble beregnet ved hjelp av følgende formel: $$ \\ mathrm {Protection} \\ \\ venstre (\\% \\ right) = \\ frac {\\ venstre (\\ mathrm {U} \\ mathrm {A} \\ \\ mathrm {kontroll} \\ \\ hbox {-} \\ \\ mathrm {U} \\ mathrm {A} \\ \\ mathrm {p} \\ mathrm {r} \\ mathrm {e} \\ hbox {-} \\ mathrm {behandlet} \\ \\ mathrm {gruppe} \\ høyre)} {\\ venstre (\\ mathrm {U} \\ mathrm {A} \\ \\ mathrm {kontroll} \\ right)} \\ ganger 100 \\% $$ Bestemmelse av volum, pH, gratis og total surhet av mageinnhold
den tømmes gastrisk innhold ble sentrifugert i 10 minutter ved 2500 rpm for å fjerne eventuelle faste rester. Volumet og pH i mavesaft ble målt. Magesaften ble også utsatt for fri og total surhet estimert i henhold til fremgangsmåten beskrevet av Srivastava et al. [37]. Titrering med 0,01 N NaOH med metyloransje-reagens ble utført inntil fargen på oppløsningen ble gulaktig for å bestemme den fri syre. Volumet av tilsatt alkali ble notert. Deretter ble to til tre dråper fenolftalein tilsatt til løsningen. Løsningen ble titrert til klare røde TIGNES vises. Det totale volumet av tilsatt NaOH ble notert. Dette volumet tilsvarer total surhet. Surhet ble beregnet ved hjelp av følgende formel: $$ \\ mathrm {surhet} = \\ frac {\\ mathrm {Volume} \\ \\ mathrm {av} \\ \\ mathrm {NaOH} \\ ganger \\ mathrm {normalitet} \\ \\ mathrm {av} \\ \\ mathrm {NaOH} \\ ganger 100} {0,1} \\ mathrm {m} \\ mathrm {e} \\ mathrm {q} /\\ mathrm {L} $$ Evaluering av protein
totale proteininnhold i magesaft ble anslått ved Lowrys metode, tilpasset fra Lowry et al. [38] med alkalisk kobber reagent og Folin reagens. Fargen som utviklet seg ble avlest ved 660 nm. Proteininnholdet ble beregnet fra standardkurven fremstilt med bovint serumalbumin og proteinkonsentrasjonen ble uttrykt som mg /ml magesaft.
Estimering av mageveggen slim innhold
Metode beskrevet av Corne et al. [39] med små modifikasjoner ble anvendt for å bestemme vegg slim gastrisk innhold. Magen ble åpnet langs den store kurvatur, veid, og neddykket i 10 ml 0,1% Alcian blått (0,16 M sukrose i 0,05 M natriumacetat, pH 5,8) i 2 timer. Magen ble deretter skylt to ganger i 0,25 M sukrose-løsning (15 minutter hver) for å fjerne overdreven fargestoff. De resterende fargestoff som kompleksdannet med gastrisk slim ble ekstrahert med 0,5 M MgCl 2. Kjertel segment holdt i denne oppløsning i 2 timer med intermitterende omrøring i 1 minutt i hvert 30 min intervaller. Den resulterende blå ekstraktet ble deretter rystet kraftig med et like stort volum av dietyleter til dannelse av en emulsjon. Den resulterende emulsjon ble sentrifugert i 10 minutter ved 3600 rpm. Absorbansen av det vandige lag ble avlest ved 580 nm ved hjelp av et spektrofotometer. Konsentrasjonen av Alcian blått ble beregnet gjennom en standardkurve og resultatene ble uttrykt i mg av Alcian blått /g vått vev.
Etanol-indusert gastrisk mucosal lesjon i L-NAME eller NEM forhåndsbehandlede rotter
rollen til endogent NO og involvering av sulfhydryl (SH) forbindelser i magesekkbeskyttende virkning av EAF ble evaluert ved å bruke metoden beskrevet av Takayama et al. [40]. Hannrotter ble delt opp i 9 grupper og forbehandlet (ip) med saltvann, L-NAME (N-nitro-L-arginin-metylester, 70 mg /kg) en inhibitor av NO-syntese eller NEM (N-etylmaleimid, 10 mg /kg) en SH forbindelse blocker. Tretti minutter etter forbehandlingen ble dyrene administrert (p.o.) bærer (8% Tween 80), carbenoxolone (100 mg /kg) eller EAF (500 mg /kg). Seksti minutter senere ble alle grupper mottok absolutt etanol (5 ml /kg, p.o.) for å indusere magesår. Alle rottene ble avlivet en time etter administrering av etanol ved eksponering til dietyleter og cervikal dislokasjon. Magen ble fjernet og gastrisk skade ble bestemt som beskrevet ovenfor. Siden EAF oppviste en doseavhengig effekt og som utøves betydelig beskyttende virkning mot mageslimhinnen i etanol-indusert ulcus-modell, ble den høyeste effektive dose (500 mg /kg) anvendt for denne studien.
Biokjemisk analyse
Måling av superoksid dismutase (SOD), glutation (GSH) nivå og katalase (CAT) aktivitet
Mage vev i rotter forbehandlet med bærer (8% Tween 80), ranitidin (100 mg /kg) eller EAF (100, 250 og 500 mg /kg) etterfulgt av sår induksjon ved hjelp av absolutt etanol i 1 time, ble anvendt for bestemmelse av SOD, GSH nivå og CAT-aktivitet. Gastrisk vev ble skåret i stykker, og den nøyaktige vekt ble registrert. Vevene ble homogenisert med en homogenisator ved hjelp av passende kald buffer, og deretter ble sentrifugert ved 10 000 g i 15 min ved 4 ° C. Supernatantene ble anvendt for å bestemme aktiviteten av CAT og nivåer av SOD, og ​​GSH. Konsentrasjonen av protein i supernatantene ble målt ved Bradford-metoden [41] ved bruk av bovint serumalbumin (BSA) som en standard. Nivåer av SOD, GSH og CAT ble bestemt ved hjelp av kommersielle analysesett i henhold til produsentens instruksjoner, henholdsvis (superoksiddismutase Assay Kit, Glutathione Assay Kit og Catalase Assay Kit, Cayman Chemical Company, Ann Arbor, MI, USA).
måling av malondialdehyd (MDA) nivå
MDA-nivåer ble målt i mage vev oppnådd fra etanol-induserte magesår. Magen Vevet ble homogenisert og sentrifugert som beskrevet tidligere, og supernatanten ble anvendt for bestemmelse av MDA ved hjelp av en enzymbundet immunosorbent assay kit (USCN Life Science Inc., Atlanta, GA, USA). De optiske densiteter ble målt ved 450 nm, og resultatene ble uttrykt som ng /mg protein.
Bestemmelse av prostaglandin E2 (PGE2)
PGE 2-nivåer ble bestemt i mage vev oppnådd fra etanol-indusert gastrisk magesår. Supernatanten av homogenisert og sentrifugert mage vev ble anvendt for bestemmelse av PGE 2 ved hjelp av Prostaglandin E 2 Express EIA-sett (Cayman Chemical Co., Ann Arbor, MI, USA). De optiske densiteter ble målt ved 412 nm. PGE 2-konsentrasjoner ble normalisert ved proteininnhold, og resultatene ble uttrykt som pg /mg protein.
Bestemmelse av NO-nivå
NO nivå i mageslimhinnen ble evaluert som totale nitrat /nitritt-nivåer ved hjelp av Griess-reagens [42]. I korte trekk, ble mage homogenater fremstilt i 50 mM kaliumfosfatbuffer (pH 7,8). Homogenatene ble sentrifugert ved 4000 rpm i 10 min ved 4 ° C. Femti mikroliter av Griess-reagens (0,1% N- (1-naftyl) ethylenediamide dihydroklorid, 1% sulfanilamid i 5% fosforsyre) ble tilsatt til 50 ul supernatant og absorbansen ble målt ved 540 nm etter 10 min. Natriumnitritt, ble anvendt som standard i denne analysen for å generere standardkurven.
Statistisk analyse
Resultatene ble uttrykt som gjennomsnitt ± standardfeil (SEM) og analysert ved bruk av en enveis variansanalyse (ANOVA), fulgt av Dunnetts post hoc
test eller Newman-Keuls test. Resultatene ble betraktet som signifikant når p <
0.
05. Search Results
Identifisering og kvantifisering av gallisk syre og quercetin
HPLC fingerprinting av MEMC, PEF og EAF avslørte tilstedeværelsen av gallisk syre ved λ maks 216,6 til 272,0 nm og quercetin på λ maks 255,5 til 370,6 nm (fig. 1a og b). Spiking av disse forbindelsene i MEMC, PEF eller EAF øket toppområdet, som svarer til den samme λ max verdien av forbindelsene. Kvantifiseringen Resultatet presenteres i Tabell 1 viser at EAF inneholder det høyeste beløpet av gallisk syre (39,89 ± 0,96 mg /g ekstrakt) og quercetin (9,36 ± 0,29 mg /g ekstrakt) etterfulgt av MEMC og PEF. Fig. 1 a og b: HPLC-analyse av MEMC, PEF og EAF utført ved bølgelengden 330 nm viste nærvær av quercetin ved ^ maks 255,5 til 370,6 nm ved RT 3,696 min. Spiking av quercetin med ekstraktene øket toppområdet, som svarer til den samme Amaks verdi av forbindelsene. c og d: HPLC fingerprinting av MEMC, PEF og EAF ved bølgelengde på 280 nm viste nærvær av gallicacid ved ^ maks 216,6 til 272,0 nm ved RT 4,204 min. Spiking av gallussyre med ekstraktene øket toppområdet, som svarer til den samme Amaks verdi av forbindelsene
Tabell 1 Galliske syre og quercetin sammensetning i MEMC og dets aktive fraksjoner (PEF og EAF) i mg /1 g ekstrakt. Resultatene er uttrykt som gjennomsnitt ± standardavvik (SDS) av tre bestemmelser
Forbindelser
MEMC
PEF
EAF
gallisk syre (mg /g)
11,97 ± 0,27
3,40 ± 0,01
39.89 ± 0.96
quercetin (mg /g)
4,83 ± 0,16
8,81 ± 0,44
9,36 ± 0,29
Identifikasjon av fenoliske forbindelser i EAF
EAF ble analysert basert på den nøyaktige massedata for de molekylære ioner, hvor ioner detekteres ble forsøksvis identifisert ved deres genererte molekylformel, gjennom programvaren analyse av data (Xcalibur) som ga liste over mulige elementært formler, sammen med bruk av standard når det er tilgjengelig, og etter grundig undersøkelse av litteraturen.
allment akseptert nøyaktighet terskel for bekreftelse av elementær blandingene ble etablert ved 5 ppm. Den UHPLC-ESI analyse av EAF viste nærvær av 22 fenoliske forbindelser (tabell 2) som lister toppen nummer, retensjonstid, observert m /z
, den genererte molekylformel og den foreslåtte forbindelse påvises. Figur 2 svarer til basistopp kromatogrammet i negativ ion, med molekyl strukturen i ermanin, kaempferide, pinobaksin og pinostrobin i fig. 3.Table to fenoliske forbindelser identifisert i EAF av UHPLC-MS
Peak Ingen
tR (min) product: [MH] -
Error (ppm)

Formula
Identifikasjon
1.
0,45
169,01376
3,433
C7H5O5
gallisk syre
2.
2,34
163,03978
4,964
C9H7O3
Protocatechuic syre
3.
3.10
193,05020
3,443
C10H9O4
Ferulic syre
4.
4,53
599,10547
3,879
C28H23O15
Quercitrin-to "O-gallate
5.
4,93
939,11377
4.220
C41H31O26
Pentagalloyl -hexoside II
6.
5.05
447,09421
4,523
C21H19O11
Kaempferol-3-O
-galactoside
7.
5,31
317,0308
5,130
C15H9O8
myricetin
8.
6,20
193,08661
3,569
C10H9O4
isoferulic syre
9.
6,91
583,11053
3,941
C28H23O14
Afzelin-O-gallate
10.
7,35
301,03586
4,023
C15H9O7
quercetin
11.
7.42
603,07928
3,894
C30H19O14
quercetin dimer
12.
7,67
255,06636
4,605 ​​
C15H11O4
Pinocembrin
13.
8,14
593,13116
3,697
C30H25O13
Kaempferol-3-O
-glucoside
14.
8.18
315,05196
6,478
C16H11O7
Rhamnetin
15.
8,55
271,06094
3,099
C15H12O5
Pinobaksin
16.
8.94
285,04037
3,528
C15H9O6
Kaempferol
17.
10.80
253,05063
4,326
C15H9O4
Chyrsin jeg
18.
11.67
253,05099
5,749
C15H9O4
Chyrsin II
19.
11.91
299,05597
3,195
C16H11O6
Kaempferide
20.
12.56
313,07245
5,703
C17H13O6
Ermanin jeg
21
12.78
313,07230
5,224
C17H13O6
Ermanin II
22.
13.32
269,08194
4,105
Fig. Fig. Alle forfattere lese og godkjent den endelige manuskriptet.

• Effekter av nikotin på mage myoelectrical aktivitet i ICR mus
• Clinicopathological betydningen av claudin-4 i magekreft