Mécanisme (s) de l'action sous-jacente de l'effet gastroprotective de la fraction d'acétate d'éthyle obtenu à partir du méthanolique brut extrait de feuilles de Muntingia calabura

Mécanisme (s) de l'action sous-jacente de l'effet gastroprotective de la fraction d'acétate d'éthyle obtenu à partir du méthanolique brut extrait de feuilles de Muntingia calabura
Contexte
Résumé
Muntingia calabura
L. (famille muntingiaceae), communément connu sous le nom de cerise jamaïcain ou kerukup siam
en Malaisie, est traditionnellement utilisé pour traiter diverses affections. Le but de cette étude est d'élucider les mécanismes possibles de gastroprotection sous-jacents de la fraction d'acétate d'éthyle (EAF) de Muntingia calabura
méthanolique extrait de feuilles (MEMC).
Méthodes
MEMC et ses fractions ont été soumis à une analyse HPLC à identifier et quantifier la présence de ses phyto-constituants. Le mécanisme de gastroptotection de EAF a également été étudiée en utilisant le modèle pylore induite par ligature lésions gastriques chez le rat (100, 250 et 500 mg /kg). L'analyse macroscopique de l'estomac, l'évaluation des paramètres de contenus gastriques tels que le volume, le pH, l'acidité libre et totale, de l'estimation de la protéine, et la quantification du mucus ont été réalisées. La participation de l'oxyde nitrique (NO) et sulfhydryle (SH) des composés a été évaluée et la superoxyde dismutase (SOD), la glutathion (GSH), de la catalase (CAT), le malondialdéhyde (MDA), la prostaglandine E 2 (PGE 2) et de NO dans l'éthanol induit homogénat de tissus de l'estomac a été déterminée.: Résultats
analyse HPLC ont confirmé la présence de la quercétine et de l'acide gallique en EAF. Dans le modèle pylore-ligature, EAF de façon significative (p
< 0,001) prévenir la formation de lésions gastriques. Volume du contenu gastrique et teneur totale en protéines réduit de façon significative (p
< 0,01 et p
< 0,05, respectivement), tandis que l'acidité libre et totale réduite dans les doses de 250 et 500 mg /kg (p
< 0,001 et p
< 0,05, respectivement). EAF a également augmenté la teneur en mucus significativement (p
< 0,001). Pré-traitement avec N-nitro-L-arginine méthyl ester (L-NAME) ou N-éthylmaléimide (NEM) inversé l'activité gastroprotective des EAF. traitement EAF nettement amélioré la SOD, glutathion et l'activité de CAT et PGE 2 et de NO alors que les conclusions de l'atténuation MDA niveau, par rapport au véhicule groupe.
En conclusion, les mécanismes sous-jacents gastroprotective de EAF pourraient être associés avec le antisécrétoire, la participation de mucus, antiperoxidative, amélioration du statut antioxydant, la modulation des composés NO et SH, la stimulation de PGE 2 ainsi que la présence de la quercétine et de l'acide gallique.
Mots-clés
Muntingia calabura
Contexte acide Fraction oxyde ulcère gastrique Antisecretory Antioxydant Nitric composé sulfhydryle prostaglandine quercétine Gallic
ulcère gastrique est l'un des principaux troubles gastro-intestinaux qui affectent nombre considérable de personnes dans le monde, tandis que la croissance dans la survenue et la prévalence dans le monde [1]. Certains auteurs se réfèrent à des ulcères gastriques comme la nouvelle «peste» du 21ème siècle [2]. Il a été prévu que 14,5 millions de la population mondiale sont touchés par les ulcères gastriques avec un taux de 4,08 millions de mortalité [3]. La physiopathologie de l'ulcère gastrique est associé au déséquilibre entre les facteurs agressifs et de protection dans l'estomac. les dommages de la muqueuse gastrique se produit lorsque des facteurs nocifs "submerger" une défense intacte de la muqueuse, ou l'affaiblissement des mécanismes de défense de la muqueuse [4]. Les facteurs nocifs dans ce contexte comprennent l'ingestion d'alcool, la sécrétion d'acide et de la pepsine, une mauvaise alimentation, le stress, les espèces réactives de l'oxygène (ROS), l'utilisation de médicaments non-stéroïdiens anti-inflammatoires non stéroïdiens (AINS) et l'infection de Helicobacter pylori [5, 6]. D'autre part, les facteurs et les mécanismes de défense principaux qui offrent une protection des muqueuses comprennent une sécrétion suffisante du mucus et du débit sanguin de la muqueuse, une sécrétion de bicarbonate, intacte barrière muqueuse, les prostaglandines, la surface de phospholipides actifs, l'augmentation des niveaux d'antioxydants, de l'activité des composés anti-inflammatoires et adéquats niveaux d'oxyde nitrique (NO) [6-8].
Actuellement, la prévention et le traitement des ulcères gastriques a gagné beaucoup d'intérêt et est devenu et de faire face défi important médecine de nos jours. À ce jour, il y a quelques approches utilisées pour prévenir l'ulcération gastrique, qui comprennent la potentialisation de la défense de la muqueuse, avec une diminution de la sécrétion acide et sa neutralisation, la stimulation de la synthèse de la mucine gastrique, l'amélioration des niveaux d'antioxydants dans l'estomac, et l'inhibition de Helicobacter pylori
croissance [9]. Sécrétion d'acide gastrique est considéré comme l'élément central de ulcères gastriques, malgré la présence de nombreux facteurs étiologiques [7], et par conséquent, l'inhibition de la sécrétion d'acide gastrique ont tendance à être la cible thérapeutique essentielle pour les maladies d'ulcère [10]. D'un autre côté, un autre facteur clé dans la pathogenèse des ulcères gastriques est la production d'espèces réactives de l'oxygène (ROS). La production d'ERO et une réduction concomitante de la capacité antioxydante provoque des dommages aux constituants cellulaires essentiels qui sont des protéines, des lipides et des acides nucléiques, entraînant la formation de composés toxiques et provoque la mort cellulaire en raison de leur extrême réactivité [8, 11]. Par conséquent, en contrôlant la formation de ROS et la sécrétion d'acide gastrique sont essentielles pour le traitement de ces pathologies [12].
Le traitement médical actuel de ulcères gastriques comprennent les bloqueurs acides qui réduisent la sécrétion acide, les inhibiteurs de la pompe à protons, des antibiotiques pour l'éradication de Helicobacter pylori
et revêtement de tissu protecteur des agents tels que le sucralfate et cholinergiques du bismuth [13, 14]. Eventhough ces médicaments ont diminué les taux de morbidité, mais ils sont souvent associés à des effets indésirables indésirables tels que l'hypersensibilité, l'impuissance, l'arythmie, des troubles hématopoïétiques, la gynécomastie et la résistance aux antibiotiques dans le long terme [15, 16]. En outre, ces médicaments disponibles ont aussi taux élevé de rechute, une faible efficacité dans le traitement des ulcères gastriques et sont souvent coûteux [5, 9, 10]. Par conséquent, il existe un besoin urgent de découvrir une des thérapies alternatives plus sûres et efficaces pour traiter les ulcères gastriques. Dans ce contexte, l'utilisation des plantes médicinales a suscité un intérêt et attiré l'attention de nombreux chercheurs. Les extraits de plantes peuvent être utiles et servir comme une nouvelle source de produits thérapeutiques dans le traitement des ulcères gastriques par lequel antisécrétoires, activités cytoprotectrices et antioxydantes, isolé ou en combinaison, sont les trois principales fonctions d'un agent de gastroprotection, qui jouent un rôle clé dans la muqueuse gastrique protection [17].
L'usine Muntingia calabura
L. (famille muntingiaceae), communément connu sous le nom de cerise jamaïcain ou kerukup siam
en Malaisie, est largement distribué dans toutes les zones chaudes de la région de l'Asie [18]. Plusieurs utilisations médicinales ont été documentés sur les différentes parties de cet arbre en Orient et en Asie du Sud ainsi que l'Amérique tropicale. feuilles
, fleurs, écorces et racines de Muntingia calabura ont été utilisés comme un remède populaire pour traiter les maux de tête, la fièvre et le froid naissant. Selon le folklore péruvien, les feuilles sont utilisées pour soulager les ulcères gastriques et pour réduire le gonflement de la glande de la prostate [19]. En outre, ils sont également utilisés comme antiseptique, antispasmodique, et antidyspeptic agents [20, 21].
D'autre part, Muntingia calabura
est signalé à posséder un large éventail d'activités pharmacologiques, qui ont fait leurs preuves scientifiquement. Cela inclut antitumorale [20, 22], anti-bactérienne [23], l'antinociception [19, 24, 25], anti-inflammatoires, antipyrétiques [25], anti-oxydants et anti-prolifératifs [26] Les activités présentées par les feuilles de Muntingia calabura
, tandis que plusieurs types de composés ont été isolés et identifiés à partir des feuilles, des racines et des tiges écorces de Muntingia calabura
[20-22, 27, 28]. Divers phytochimiques ont été détectées dans les feuilles de Muntingia calabura
tels que les flavonoïdes, des saponines, des tanins et des triterpènes [29].
Dans notre étude précédente, nous avons rapporté l'activité gastroprotective de plusieurs fractions obtenues à partir d'extrait de méthanol brut de Muntingia calabura
(MEMC) quitte contre lésion gastrique induite par l'éthanol chez le rat [30]. D'après notre étude, nous avons constaté que la fraction d'acétate d'éthyle améliorer notablement l'ulcération gastrique et exerce la protection la plus efficace par rapport aux autres fractions. Par conséquent, la présente étude a pour but de déterminer le mécanisme d'action sous-tend l'effet prophylactique de la fraction d'acétate d'éthyle dérivé de MEMC contre les lésions gastriques chez le rat. Modèle Pylore-ligature utilisé dans cette étude est l'un des modèles les plus utilisés pour étudier l'effet des médicaments sur l'acide gastrique et la sécrétion de mucus. Ulcères développés par ligation l'extrémité pylorique de l'estomac sont causées par l'augmentation de l'estomac de l'acide chlorhydrique (HCl), la sécrétion et /ou la stase de l'acide, ce qui conduit à une digestion automatique de la muqueuse gastrique et la rupture de la barrière muqueuse gastrique [31]. Par conséquent, des agents qui sont capables d'augmenter la sécrétion de mucus (cytoprotecteur) et /ou réduire la sécrétion de facteurs agressifs gastriques tels que la pepsine et l'acide sont des agents efficaces de gastroprotection [32]. D'autre part, le modèle de l'ulcère induite par l'éthanol est utile pour étudier l'efficacité des médicaments potentiels ou tester des agents qui ont /ou des activités cytoprotectrices et antioxydantes [33]. Méthodes
Chimie
Les produits chimiques utilisés dans cette étude sont des qualités analytiques et avait été préparé immédiatement avant utilisation. Les médicaments suivants ont été utilisés: ranitidine (Sigma Aldrich, USA), l'éthanol absolu (Fischer Scientific, États-Unis), N-éthylmaléimide (NEM) (Sigma-Aldrich, USA), N G-nitro-L-arginine esters méthyliques (L-NAME) (Sigma-Aldrich, USA), carbénoxolone (CBX) (Sigma-Aldrich, USA) et de l'éther de diéthyle (Fischer Scientific, États-Unis). matériau
Plant
Muntingia calabura
feuilles ont été recueillies de leur habitat naturel à Shah Alam, Selangor, en Malaisie, entre mai et Août 2010. l'usine a été identifié par un botaniste de l'Institut de Bioscience (IBS), Universiti Putra Malaysia (UPM), Serdang, Selangor. Un spécimen de, SK 2466/14, a été déposé à l'IBS Laboratoire UPM de produits naturels Herbier.
Extraction et fractionnement de Muntingia calabura
feuilles
méthode décrite par Zakaria et al. [26] et Sufian et al. [28] a été utilisée pour préparer l'extrait brut de Muntingia calabura
feuilles et de ses fractions, respectivement. Cinq cents grammes de feuilles matures ont été séchées à l'air à la température ambiante (27 ± 2
° C) pendant 1-2 semaines et broyé en poudre fine. Du methanol (MeOH) a été utilisé comme solvant pour l'extraction. La poudre a été trempée dans du MeOH dans un rapport de 1:20 (p /v) pendant 72 h. Le mélange a été filtré en utilisant un entonnoir de filtration, le coton et le papier Whatman n ° 1 du papier filtre. Le trempage et filtration ont été répétés sur le résidu deux fois. Le filtrat a été recueillies à partir de chaque extraction ont été rassemblées et on évapore dans un évaporateur rotatif à 40 ° C sous pression réduite pour obtenir un extrait au méthanol de Muntingia calabura
(MEMC). L'extrait brut séché a été mis en suspension dans du MeOH et de l'eau distillée (dH 2 O) d'eau dans le rapport 1: 2 pour donner une solution aqueuse de MeOH. Le mélange a été réparti de manière séquentielle avec des solvants différents, qui sont l'éther de pétrole et d'acétate d'éthyle, ce qui donne l'éther de pétrole fraction (PEF), la fraction d'acétate d'éthyle (EAF). Les fractions ont été filtrés et évaporés à sec sous vide en utilisant un évaporateur rotatif. MEMC, PEF et EAF ont été soumis à une HPLC pour quantifier le composé d'intérêt, qui pourrait être associé à l'effet gastroprotective de l'extrait.
Identification et quantification des phytoconstituents présents dans EAF par HPLC de méthode décrite par Zakaria et al. [34] avec de légères modifications ont été adaptées pour réaliser l'analyse HPLC du EAF. En bref, 10 mg d'échantillon ont été mis en suspension dans 1 ml de methanol. Les solutions ont été filtrées à travers une cartouche filtrante (diamètre des pores de 0,45 um) avant utilisation. L'échantillon a été analysé à l'aide d'un système HPLC (Waters Delta 600 avec 600 Controller) avec détecteur à réseau de photodiodes (PDA) (Waters 996). A C 18 colonne (4,6 mm de diamètre intérieur x 250 mm) garnie de 5 um particules de diamètre a été utilisé. La phase mobile était de l'eau contenant 0,1% d'acide formique (A) et d'acétonitrile (B). Les conditions initiales étaient de 85% de A et 15% B avec un gradient linéaire atteignant 25% de B à t = 12 min
. Cette condition a été maintenue pendant 10 min. B a été réduit de nouveau à 15%, la condition initiale, et a été maintenue jusqu'à ce que t
= 35 min. A t
= 25 min, le programme revient à la composition du solvant initial. Le débit était de 1,0 ml /min, le volume d'injection était de 10 ul et la longueur d'onde était de 280 nm pour l'acide gallique et de 330 nm pour la quercétine. Le four à colonne a été réglée à 27 ° C. Les solutions mères de normes de références ont été préparées dans le méthanol à une concentration de 1 mg /ml. Les pics chromatographiques ont été confirmées en comparant son temps de rétention avec ceux des étalons de référence et par le spectre UV respectif. Courbe d'étalonnage pour l'acide gallique est Y = 29562x + 102777 (R 2 = 0,9969) et la quercétine était Y = 43236x - 81458 (R 2 = 0,999). Toutes les opérations de Chromatographie ont été effectuées à la température ambiante et en triple. L'analyse HPLC a été réalisée dans le laboratoire de Phytothérapie, plantes médicinales Division, Institut de recherche forestière de Malaisie (FRIM), Kepong, Malaisie.
Analyse UHPLC-ESI
Le système UHPLC a été réalisée sur un système UHPLC Dionex 3000 acquis auprès de Thermo Fisher Scientific (USA) qui consistait en un échantillonneur automatique équipé d'un four à colonne, un dispositif de refroidissement du compartiment de bac et d'une pompe binaire avec construit dans le dégazeur. La séparation chromatographique a été effectuée sur une colonne C18 UHPLC BEH, 100 mm x 2,5 um, 1,7 um (WATERS) à un débit de 0,3 mL /min. Les phases mobiles utilisées étaient (A) d'acide formique à 0,1% dans l'eau et (B) de l'acide formique à 0,1% dans l'acétonitrile. Le gradient a commencé avec 10% de phase mobile B, pour atteindre 20% de phase mobile B à 5 min, 60% de phase mobile B à 17,0 min, à élution isocratique de 90% de B pendant 3 min. Le gradient a atteint les conditions initiales ont eu lieu pendant 2 minutes comme une étape rééquilibration. Le volume d'injection était de 10 ul et la température de la colonne a été maintenue à 40 ° C. Le système UHPLC a été couplé à un linéaire ion-trap-Orbitrap spectromètre de masse Q Exactive de Thermo Fisher Scientific (U.S.A.) équipé d'une ionisation par électronébulisation (ESI) la source. La détection de masse a été réalisée dans une plage de 150-1500 m /z. La source ESI a été utilisé en mode d'ions négatifs dans les conditions spécifiques suivantes: tension de source, 3,2 kV; gaz de gaine, 35 unités arbitraires; gaz auxiliaire, 15 unité arbitraire; balayer le gaz, 10 unité arbitraire; et la température capillaire 320 ° C. Azote (> 99,98%) a été employé en tant que gaz de gaine, auxiliaire et balayer le gaz. Le contrôle des instruments et l'acquisition de données ont été réalisées avec Chameleon 6.8 du logiciel et du logiciel 2.2 Xcalibur (Thermo Fisher Scientific)
Animaux
Les expériences ont été réalisées sur des rats mâles Sprague Dawley. (180-200 g; vieille 8-10 semaines). Ils ont été obtenus auprès de l'Unité animale, Faculté de médecine et de sciences de la santé, UPM, Malaisie. Les animaux ont été maintenus dans des cages en polypropylène avec copeaux de bois, nourris avec des granulés standard et le libre accès autorisé à l'eau. Ils ont été maintenus dans la température ambiante (27 ± 2 0C; 70-80% d'humidité; 12 h cycle lumière /obscurité) dans l'unité de parcage des animaux (UPM). Préalablement à tous les essais, les rats ont été soumis à un jeûne. médicaments standard et MEMC ont été administrés oralement (p.o.) par gavage avec 8% de Tween 80 (10 ml /kg) lorsque le véhicule. L'utilisation d'animaux dans cette étude a été approuvée par le soin des animaux et du Comité d'occasion (ACUC) d'UPM (Approbation No: UPM /FPSK /PADS /BR-UUH /00474)
Détermination du mécanisme sous-jacent de l'activité gastroprotective de. ligature du pylore de EAF
Méthode par Shay et al. [35] avec de légères modifications a été employé pour effectuer la ligature du pylore. Les rats ont été répartis au hasard en 5 groupes, avec six rats dans chaque groupe. Groupe I a été le groupe témoin administré avec 8% de Tween 80 (véhicule) par voie orale (po), Groupe-II a été le contrôle positif administré avec ranitidine à 100 mg /kg (po), tandis que pour le groupe-III, -IV et- V, les rats ont été administrés avec EAF (100, 250 et 500 mg /kg, respectivement). Ligature du pylore a été réalisée sur des rats à jeun 48 h 1 h après l'administration des composés d'essai. Sous anesthésie induite par la lumière à l'aide de chlorhydrate de kétamine (100 mg /kg par voie intramusculaire) et de chlorhydrate de xylazine (16 mg /kg par voie intramusculaire), une incision abdominale 2 cm de long ligne médiane a été réalisée juste en dessous du sternum. La partie pylorique de l'estomac était doucement mobilisée et soigneusement ligaturé avec une ligature de soie autour du sphincter pylorique dans un noeud serré. On a pris soin tout attacher le noeud pour éviter toute interférence avec l'approvisionnement en sang gastrique. Évaluation de l'incision abdominale a été suturée, la peau a été nettoyée de toutes les taches de sang ou des saignements et les animaux ont été autorisés à se remettre de l'anesthésie. De lésion de la muqueuse gastrique
Les animaux ont été sacrifiés 6 h après la ligature par l'exposition à l'éther de diéthyle et dislocation cervicale. Les estomacs ont été enlevés, et le contenu ont été drainées, recueillis et centrifugés. L'estomac a été ouvert le long de la grande courbure pour déterminer les dommages de la lésion comme décrit par Balan et al. [36]. La protection de pourcentage a été calculé selon la formule suivante: $$ \\ mathrm {Protection} \\ \\ left (\\% \\ right) = \\ frac {\\ left (\\ mathrm {U} \\ mathrm {A} \\ \\ mathrm {commande} \\ \\ hbox {-} \\ \\ mathrm {U} \\ mathrm {A} \\ \\ mathrm {p} \\ mathrm {r} \\ mathrm {e} \\ hbox {-} \\ mathrm {traité} \\ \\ mathrm {groupe} \\ droite)} {\\ left (\\ mathrm {U} \\ mathrm {A} \\ \\ mathrm {commande} \\ right)} \\ times 100 \\% $$ Détermination du volume, pH, libre et l'acidité totale de l'estomac
contenu Le contenu gastrique égoutté a été centrifugé pendant 10 min à 2500 rpm pour éliminer tout débris solides. Le volume et le pH du suc gastrique a été mesurée. Le suc gastrique a également été soumis à l'estimation de l'acidité libre et total selon la méthode décrite par Srivastava et al. [37]. Titrage avec du NaOH 0,01 N avec un réactif orange de méthyle a été effectuée jusqu'à ce que la couleur de la solution devient jaune afin de déterminer l'acidité libre. Le volume de substance alcaline ajoutée a été notée. Ensuite, deux à trois gouttes de phénolphtaléine, on a ajouté à la solution. La solution a été titrée jusqu'à reflets rouges définies apparaissent. Le volume total de NaOH ajoutée a été notée. Ce volume correspond à l'acidité totale. Acidité a été calculé selon la formule suivante: $$ \\ mathrm {Acidité} = \\ frac {\\ mathrm {Volume} \\ \\ mathrm {de} \\ \\ mathrm {NaOH} \\ times \\ mathrm {normalité} \\ \\ mathrm {de} \\ \\ mathrm {NaOH} \\ times 100} {0,1} \\ mathrm {m} \\ mathrm {e} \\ mathrm {q} /\\ mathrm {l} $$ Estimation de la protéine
La teneur totale en protéines dans le suc gastrique a été estimé par la méthode de Lowry adaptée de Lowry et al. [38] en utilisant le réactif de cuivre alcalin et le réactif de Folin. La couleur développée a été lue à 660 nm. La teneur en protéines a été calculée à partir de la courbe standard préparée avec de l'albumine sérique et la concentration en protéines bovine a été exprimée en mg /ml de suc gastrique.
Estimation de l'estomac mur mucus contenu
méthode décrite par Corne et al. [39] avec de légères modifications ont été employées pour déterminer le contenu mur de mucus gastrique. L'estomac a été ouvert le long de la grande courbure, pesés et immergés dans 10 ml de 0,1% de bleu Alcian (0,16 M saccharose 0,05 M d'acétate de sodium, pH 5,8) pendant 2 h. L'estomac a ensuite été rincé deux fois dans une solution 0,25 M de saccharose (15 min à chaque fois) pour éliminer le colorant excessif. Le colorant restant qui complexé avec la muqueuse gastrique a été extraite avec 0,5 M MgCl 2. Le segment glandulaire est resté dans cette solution pendant 2 heures avec agitation intermittente pendant 1 min dans chaque intervalle de 30 minutes. L'extrait bleu résultant a ensuite été agité vigoureusement avec un volume égal d'éther diéthylique jusqu'à ce que la formation d'une émulsion. L'émulsion résultante a été centrifugée pendant 10 min à 3600 tours par minute. L'absorbance de la phase aqueuse a été lue à 580 nm en utilisant un spectrophotomètre. La concentration de bleu Alcian a été calculé par une courbe standard et les résultats sont exprimés en mg de bleu Alcian /g de tissu humide.
Gastrique lésion muqueuse induite par l'éthanol en L-NAME ou rats NEM pré-traités
Le le rôle du NO endogène et l'implication de sulfhydryle (SH) composés à l'effet de gastroprotection EAF ont été évalués selon la méthode décrite par Takayama et al. [40]. Des rats mâles ont été divisés en 9 groupes et prétraitées (ip) avec (ester de N-nitro-L-arginine méthyl, 70 mg /kg), une solution saline, le L-NAME un inhibiteur de la synthèse de NO ou de NEM (N-éthylmaléimide, 10 mg /kg) un composé de bloqueur SH. Trente minutes après le prétraitement, on administre aux animaux (per os) véhicule (8% de Tween 80), carbénoxolone (100 mg /kg) ou EAT (500 mg /kg). Soixante minutes plus tard, tous les groupes ont reçu de l'éthanol absolu (5 ml /kg, p.o.) pour induire des ulcères gastriques. Tous les rats ont été sacrifiés 1 heure après l'administration d'éthanol par exposition à de l'éther diéthylique et dislocation cervicale. L'estomac a été enlevé et les lésions gastriques a été déterminée comme décrit ci-dessus. Depuis EAF a montré un effet dose-dépendante et exerce une action protectrice substantielle contre la muqueuse gastrique dans le modèle de l'ulcère gastrique induite par l'éthanol, la dose efficace la plus élevée (500 mg /kg) a été utilisé pour cette étude.
Analyse biochimique
mesure de la superoxyde dismutase (SOD), le glutathion (GSH) niveau et catalase (CAT) activité
tissus de l'estomac des rats prétraités avec un véhicule (8% de Tween 80), ranitidine (100 mg /kg) ou EAT (100, 250 et 500 mg /kg), suivie d'un ulcère à induction en utilisant de l'éthanol absolu pendant 1 h ont été utilisés pour la détermination de la SOD, le niveau de GSH et l'activité CAT. tissu gastrique a été découpé en morceaux et le poids exact a été enregistré. Les tissus ont été homogénéisés avec un homogénéiseur en utilisant un tampon froid approprié, puis ont été centrifugés à 10000 g pendant 15 min à 4 ° C. Les surnageants ont été utilisés pour déterminer les activités de CAT et les niveaux de SOD, et GSH. La concentration de protéines dans les surnageants a été mesurée par la méthode de Bradford [41] en utilisant la sérumalbumine bovine (BSA) comme étalon. Les niveaux de SOD, glutathion et CAT ont été déterminées en utilisant les kits de dosage commerciaux selon les instructions du fabricant, respectivement (superoxyde dismutase Assay Kit, Kit glutathion Assay et catalase Assay Kit, Cayman Chemical Company, Ann Arbor, MI, États-Unis).
mesure de malondialdéhyde (MDA) niveau
taux de MDA ont été mesurés dans les tissus de l'estomac obtenus à partir de l'ulcère gastrique induite par l'éthanol. Le tissu de l'estomac a été homogénéisé et centrifugé comme décrit précédemment et le surnageant a été utilisé pour la détermination de la MDA en utilisant un kit de dosage immuno-enzymatique (USCN Life Science Inc., Atlanta, GA, USA). Les densités optiques ont été mesurées à 450 nm et les résultats ont été exprimés en ng /mg de protéine.
Détermination de la prostaglandine E2 (PGE2)
PGE 2 ont été déterminés dans les tissus de l'estomac obtenus à partir de l'gastrique induite par l'éthanol ulcère. Le surnageant des tissus de l'estomac homogénéisé et centrifugé a été utilisé pour la détermination de PGE 2 en utilisant prostaglandine E 2 Kit express EIA (Cayman Chemical Company, Ann Arbor, MI, États-Unis). Les densités optiques ont été mesurées à 412 nm. Les PGE 2 concentrations ont été normalisées par des teneurs en protéines et les résultats ont été exprimés en pg /mg de protéine.
Détermination de NO niveau
niveau de NO dans la muqueuse gastrique a été évaluée comme le total des niveaux de nitrate /nitrite en utilisant le réactif de Griess [42]. En bref, les homogénats de l'estomac ont été préparés dans un tampon phosphate mM de potassium 50 (pH 7,8). Les homogénats ont été centrifugés à 4000 tpm pendant 10 min à 4 ° C. Cinquante microlitres du réactif de Griess (0,1% de N- (1-naphtyl) ethylenediamide dichlorhydrate sulfanilamide à 1% dans 5% d'acide phosphorique) a été ajouté à 50 ul surnageant et l'absorbance a été mesurée à 540 nm après 10 minutes. Le nitrite de sodium a été utilisé comme étalon dans cet essai afin de générer la courbe d'étalonnage. L'analyse statistique

Les résultats ont été exprimés en moyenne ± erreur type moyenne (SEM) et analysées en utilisant une seule analyse de variance à un facteur (ANOVA), suivie de par post hoc
test de Dunnett ou le test de Newman-Keuls. Les résultats ont été considérés comme significatifs lorsque p <
0.
05.
Résultats
Identification et quantification de l'acide gallique et quercétine
HPLC empreintes de MEMC, PEF et EAF ont révélé la présence de l'gallique acide à λ max 216,6 à 272,0 nm et la quercétine à λ max 255,5 à 370,6 nm (Fig. 1a et b). Smasher de ces composés dans MEMC, PEF ou EAF a augmenté la surface de pic, correspondant à la même λ valeur maximale des composés. Le résultat de quantification présentés dans le tableau 1 montre que EAF contient la plus grande quantité d'acide gallique (39,89 ± 0,96 mg /g d'extrait) et la quercétine (9,36 ± 0,29 mg /g d'extrait) suivie par MEMC et PEF. Figue. 1 a et b: analyse HPLC MEMC, PEF et EAF effectuée à la longueur d'onde de 330 nm a révélé la présence de la quercétine à Xmax 255,5 à 370,6 nm à TA 3.696 min. Enrichissements de la quercétine avec les extraits ont augmenté la surface de pic, ce qui correspond à la même valeur Xmax des composés. c et d: HPLC empreintes de MEMC, PEF et EAF à la longueur d'onde de 280 nm a révélé la présence de l'gallicacid à ​​Xmax 216,6 à 272,0 nm à TA 4.204 min. Smasher d'acide gallique avec les extraits a augmenté la surface de pic, ce qui correspond à la même valeur Xmax des composés
Tableau 1 l'acide et la composition de la quercétine dans MEMC et ses fractions actives (PEF et EAF) au mg /1 g d'extrait gaulois. Les résultats sont exprimés en moyenne ± écart-types (SDS) de trois déterminations
composés
MEMC
PEF
EAF
acide gallique (mg /g)
11,97 ± 0,27 3,40 ± 0,01

39,89 ± 0,96
quercétine (mg /g)
4,83 ± 0,16 8,81 ± 0,44

9,36 ± 0,29
identification des composés phénoliques dans EAF de EAF a été analysé sur la base des données de masse précises des ions moléculaires, dans laquelle les ions détectés ont été provisoirement identifiés par leur formule moléculaire générée, à travers l'analyse des données du logiciel (Xcalibur) qui a fourni la liste des possibles élémentaire formules, ainsi que l'utilisation de la norme lorsqu'ils sont disponibles et après enquête approfondie de la littérature.
le seuil de précision largement acceptée pour la confirmation des compositions élémentaires a été établie à 5 ppm. L'analyse UHPLC-ESI de EAF a révélé la présence de 22 composés phénoliques (tableau 2) qui liste le nombre maximum, le temps de rétention, observé m /z
, la formule moléculaire générée et le composé proposé détecté. La figure 2 correspond au chromatogramme des pics de base à ion négatif, avec la structure de la molécule ermanine, kaempféride, et pinobaksin pinostrobine sur la Fig. 3.Table 2 composés phénoliques identifiés dans EAF par Peak Pas de UHPLC-MS
tR (min)
[MH] -
erreur (ppm)

Formule
identification

1.
0,45
169,01376
3.433
acide gallique de C7H5O5
2.
2.34
163,03978
4.964
C9H7O3
acide
protocatéchique 3.
3.10
193,05020
3.443
acide férulique de C10H9O4
4.
4,53
599,10547
3.879
C28H23O15
Quercitroside-2 "-O-gallate
5.
4,93
939,11377
4.220
C41H31O26 de Pentagalloyl -hexoside II
6.
5.05
447,09421
4.523
C21H19O11
kaempférol-3-O
-galactoside
7.
5,31
317,0308
5.130 8.
6,20
193,08661
3.569
C10H9O4
isoférulique acide
9.
6,91

C15H9O8
myricétine 583,11053
3.941
Afzelin-O-gallate de C28H23O14
10.
7,35
301,03586
4.023
C15H9O7
quercétine
11.
7,42
603,07928
3.894
C30H19O14
quercétine dimère
12.
7,67
255,06636
4.605
C15H11O4
pinocembrine
13.
8.14
593,13116
3.697
C30H25O13
kaempférol-3-O
-glucoside
14.
8,18
315,05196
6.478
C16H11O7
rhamnétine
15.
8,55
271,06094
3.099
C15H12O5
Pinobaksin
16.
8,94
285,04037
3.528
C15H9O6
17.
10,80
253,05063
4.326
C15H9O4
Chyrsin
kaempférol I
18.
11,67
253,05099
5.749
C15H9O4
Chyrsin II
19.
11,91
299,05597
3.195
C16H11O6
kaempféride
20.
12,56
313,07245
5.703
C17H13O6
ermanine I
21
12,78
313,07230
5.224
ermanine II
C17H13O6
22.
13,32
269,08194
4.105
C16H13O4
pinostrobine
Fig. Figue. Figue. Tous les auteurs ont lu et approuvé le manuscrit final.

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