Mechanismus (e) von Maßnahmen, um die gastroprotektive Wirkung von Ethylacetat-Fraktion aus dem rohen methanolischen erhalten zugrundeliegenden Blätter Extrakt von Muntingia calabura

Mechanismus (e) von Maßnahmen, um die gastroprotektive Wirkung von Ethylacetat-Fraktion aus dem rohen methanolischen verlässt Extrakt von Muntingia erhalten zugrundeliegenden calabura

Abstrakt
Hintergrund
Muntingia calabura
L. (Familie Muntingiaceae), die gemeinhin als Jamaican Kirsche bekannt oder kerukup siam
in Malaysia, verwendet wird traditionell verschiedene Krankheiten zu behandeln. Das Ziel dieser Studie ist es, die mögliche zugrundeliegende Mechanismen gastroprotektive Ethylacetat Fraktion (EAF) von Muntingia aufzuklären calabura
methanolischen Extrakt verläßt (MEMC).
Methods
MEMC und seine Fraktionen wurden einer HPLC-Analyse unterzogen, um identifizieren und die Präsenz seiner phyto-Bestandteile zu quantifizieren. Der Mechanismus der gastroptotection von EAF weiteren wurde mit Pylorus Ligatur-induzierten Magen-Läsion Rattenmodell untersucht (100, 250 und 500 mg /kg). Die makroskopische Analyse des Magens, der Auswertung von Mageninhalt Parameter wie Volumen, pH-Wert, frei und Gesamtsäure, Proteinschätzung und Quantifizierung von Schleim durchgeführt wurden. Die Beteiligung von Stickstoffmonoxid (NO) und Sulfhydryl (SH) Verbindungen wurde bewertet und die Superoxid-Dismutase (SOD), Glutathion (GSH), Katalase (CAT), Malondialdehyd (MDA), Prostaglandin E 2 (PGE 2) und NO-Ebene im Magen Gewebehomogenat Ethanol induziert wurde bestimmt.
Ergebnisse | HPLC-Analyse bestätigte das Vorhandensein von Quercetin und Gallussäure in EAF. In Pylorus-Ligatur-Modell, EAF signifikant (p
< 0,001) zu verhindern, Magen-Läsion Bildung. Volumen der Mageninhalt und Gesamtproteingehalt deutlich reduziert (p
< 0,01 und p
< 0,05), während eine freie und Gesamtsäure in Dosen von 250 reduziert und 500 mg /kg (p
< 0,001 und p
< 0,05). EAF vermehrt auch die Schleimgehalt signifikant (p
< 0,001). Vorbehandlung mit N-nitro-L-argininmethylester (L-NAME) oder N-Ethylmaleimid (NEM) umgekehrt die gastroprotektive Aktivität von EAF. EAF Behandlung deutlich verbessert die SOD, GSH und CAT-Aktivität und PGE 2 und NO Pegel, während mildernde MDA-Spiegel, bezogen auf die Fahrzeuggruppe.
Schlussfolgerungen
Abschließend die zugrunde liegenden Mechanismen der gastroprotektiver EAF könnte in Verbindung gebracht werden mit dem antisekretorische, die Teilnahme von Schleim, antiperoxidative, die Verbesserung der antioxidativen Status, Modulation von NO und SH-Verbindungen, die Stimulierung von PGE 2 sowie Vorhandensein von Quercetin und Gallussäure.
Schlüsselwörter Muntingia calabura
Fraktion Magengeschwür Antisekretorische Antioxidant Stickstoffmonoxid Sulfhydrylverbindung Prostaglandin Quercetin gallischen Säure Hintergrund
Geschwür Magen ist eine der wichtigsten Magen-Darm-Erkrankungen, die beträchtliche Anzahl von Menschen auf der ganzen Welt beeinflussen, während global in Auftreten und Prävalenz wächst [1]. Einige Autoren beziehen sich auf Magengeschwüre als die neue "Pest" des 21. Jahrhunderts [2]. Es wurde prognostiziert, dass 14,5 Millionen der Weltbevölkerung von Magengeschwüren mit einer Mortalitätsrate von 4.080.000 betroffen sind [3]. Die Pathophysiologie der Magengeschwür mit dem Ungleichgewicht zwischen aggressiven und Schutzfaktoren im Magen verbunden. Magenschleimhaut Schaden tritt auf, wenn schädliche Faktoren "Überwältigung" eine intakte Schleimhaut Verteidigung oder Schwächung der Schleimhaut Abwehrmechanismen [4]. Die schädlichen Faktoren sind in diesem Zusammenhang Alkoholkonsum, Säure und Pepsin-Sekretion, schlechte Ernährung, Stress, reaktive Sauerstoffspezies (ROS), die Verwendung von nicht-steroidalen Antirheumatika (NSAR) und Helicobacter pylori-Infektion
[5, 6]. Auf der anderen Seite werden die wichtigsten Abwehrfaktoren und Mechanismen, die Schleimhaut Verteidigung umfassen ausreichende Schleimabsonderung und Blutung der Schleimhaut, Bikarbonat-Sekretion, intakten Schleimbarriere, Prostaglandine, oberflächenaktive Phospholipide, erhöhten Gehalt an Antioxidantien, Aktivität von entzündungshemmenden Verbindungen und ausreichend leisten Ebenen von Stickstoffmonoxid (NO) [6-8].
Derzeit hat die Prävention und Behandlung von Magengeschwüren viel Interesse gewonnen und wurde und wichtige Herausforderung Medizin konfrontiert heute. Bis heute gibt es einige Ansätze verwendet Magenulzeration zu verhindern, die Potenzierung der mukosalen Abwehr umfassen zusammen mit der Reduktion der Säuresekretion und deren Neutralisation, die Stimulierung der Magen-Mucin-Synthese, Verstärkung der Antioxidansniveaus im Magen, und Hemmung von Helicobacter pylori
Wachstum [9]. Die Sekretion von Magensäure ist die zentrale Komponente von Magengeschwüren trotz der Anwesenheit von vielen ursächlichen Faktoren erachtet werden [7] und damit die Hemmung der Sekretion von Magensäure neigen dazu, die Schlüssel therapeutisches Ziel für Ulkuserkrankungen [10] zu sein. Auf der anderen Seite, ein weiterer wichtiger Faktor in der Pathogenese von Magengeschwüren ist die Produktion von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS). Die Produktion von ROS und eine gleichzeitige Reduzierung der antioxidative Kapazität verursacht Schäden an den wesentlichen Zellbestandteilen, die Proteine, Lipide und Nukleinsäuren, was zur Bildung von toxischen Verbindungen und verursacht den Zelltod aufgrund ihrer extremen Reaktivität [8, 11]. Daher sind die ROS-Bildung und Sekretion von Magensäure Kontrolle von wesentlicher Bedeutung für die Behandlung dieser Erkrankungen [12].
Die aktuelle medizinische Behandlung von Magengeschwüren umfassen Säure-Blocker, die Säuresekretion zu reduzieren, Protonenpumpenhemmer, Antibiotika Helicobacter pylori auszurotten
und Gewebeauskleidung Schutzmittel, wie Sucralfat und Bismut Cholinergika [13, 14]. Eventhough haben diese Medikamente die Morbiditätsraten verringert, aber sie sind oft mit unerwünschten Nebenwirkungen wie Überempfindlichkeit, Impotenz, Arrhythmie, hämatopoetischen Störungen, Gynäkomastie und Antibiotika-Resistenz auf lange Sicht [15, 16] verbunden. Außerdem können diese verfügbaren Medikamente haben auch eine hohe Rezidivrate, niedrige Wirksamkeit bei Magengeschwüren Behandlung und sind oft teuer [5, 9, 10]. Daher besteht ein dringender Bedarf, wirksamere und sichere Alternative Therapien zu entdecken, Magengeschwüren zu behandeln. In diesem Zusammenhang hat sich die Verwendung von Heilpflanzen gewonnen Interesse und die Aufmerksamkeit vieler Forscher erfasst. Pflanzenextrakte können als neue Quelle von Therapeutika bei der Behandlung von Magengeschwüren wertvoll und dienen werden, wobei antisekretorische, zytoprotektive und antioxidative Aktivitäten, isoliert oder in Kombination, sind die drei Hauptfunktionen eines magen Agenten, der die Schlüsselrolle in der Magenschleimhaut spielen Schutz [17].
die Anlage Muntingia calabura
L. (Familie Muntingiaceae), die gemeinhin als Jamaican Kirsche bekannt oder kerukup siam
in Malaysia, ist weit verbreitet in den warmen Gebieten der asiatischen Region [18] verteilt. Mehrere medizinische Anwendungen haben auf verschiedenen Teilen dieses Baumes in Ost- und Südostasien sowie dem tropischen Amerika dokumentiert. Muntingia calabura
Blätter, Blüten, Rinden und Wurzeln wurden als Volksheilmittel verwendet, Kopfschmerzen, Fieber und einsetzenden Kälte zu behandeln. Nach peruanischen Folklore werden die Blätter verwendet Magengeschwüre zu schaffen Linderung und Schwellung der Prostata zu verringern [19]. Außerdem werden sie auch als antiseptisch, krampflösend verwendet, und antidyspeptic Mittel [20, 21].
Auf der anderen Seite, Muntingia calabura
wird berichtet, ein breites Spektrum an pharmakologischen Wirkungen besitzen, die wissenschaftlich erwiesen haben. Diese Anti-Tumor umfassen [20, 22], antibakterielles Mittel [23], Antinociception [19, 24, 25], entzündungshemmende, antipyretische [25], Antioxidationsmittel und antiproliferative [26] durch die Blätter zeigten Aktivitäten Muntingia calabura
, während verschiedene Arten von Verbindungen, die aus den Blättern, Wurzeln isoliert und identifiziert wurden, und Rinden von Muntingia Stamm calabura
[20-22, 27, 28]. Verschiedene Phytochemikalien wurden in den Blättern von Muntingia calabura
wie Flavonoide, Saponine, Tannine und Triterpene [29].
In unserer früheren Studie festgestellt wurde, haben wir die gastroprotektive Aktivität verschiedener Fraktionen aus Rohmethanol erhaltene Extrakt berichtet von Muntingia calabura
(MEMC) Blätter gegen Ethanol-induzierten Magen-Läsion bei Ratten [30]. Aus unserer Studie haben wir die Ethylacetatfraktion deutlich Magenulzeration verbessern und übte den wirksamsten Schutz im Vergleich zu den anderen Fraktionen gefunden. Daher wurde die vorliegende Studie soll die Wirkungsmechanismus die unter der prophylaktischen Wirkung der Ethylacetatfraktion von MEMC gegen Magenläsionen in Ratten abgeleitet zu bestimmen.
Pylorus-Ligatur-Modell in dieser Studie verwendet wird, ist eines der am häufigsten verwendeten Modelle die Wirkung von Medikamenten auf Magensäure und Schleimabsonderung zu studieren. Ulzera, entwickelt von den Pylorusende des Magens Ligieren werden durch Zunahme der Magen-Salzsäure (HCl) Sekretion und /oder Stauung von Säure verursacht wird, auf Auto Verdauung der Magenschleimhaut und Aufschlüsselung der Magenschleimhaut Barriere führt [31]. Daher können Mittel, die Schleimabsonderung (zytoprotektive) erhöhen können und /oder Sekretion von Magen-aggressiven Faktoren reduzieren, wie Pepsin und Säure sind wirksam magenMittel [32]. Auf der anderen Seite, die Ethanol-induzierten Ulzera Modell ist für die Untersuchung der Wirksamkeit von potentiellen Medikamente nützlich oder Testmittel, die zytoprotektive und /oder Antioxidantien-Aktivitäten haben [33].
Methoden
Chemicals
Die verwendeten Chemikalien in diese Studie sind von analytischen Qualitäten und hatte vor der Anwendung hergestellt sofort worden. Folgende Wirkstoffe wurden verwendet: Ranitidin (Sigma Aldrich, USA), absolutem Ethanol (Fischer Scientific, USA), N-Ethylmaleimid (NEM) (Sigma-Aldrich, USA), N G-nitro-L-Arginin-Methylester (L-NAME) (Sigma-Aldrich, USA), Carbenoxolon (CBX) (Sigma-Aldrich, USA) und Diethylether (Fischer Scientific, USA).
Pflanzenmaterial
Muntingia calabura
Blätter wurden gesammelt aus ihrem natürlichen Lebensraum in Shah Alam, Selangor, Malaysia, zwischen Mai und August 2010. die Anlage, die von einem Botaniker aus dem Institut für Bioscience (IBS), Universiti Putra Malaysia (UPM), Serdang, Selangor identifiziert wurde. Ein Belegprobe, SK 2466/14 wurde an der UPM IBS Laboratory of Natural Products Herbarium.
Extraktion und Fraktionierung von Muntingia calabura
verlässt
Methode von Zakaria et al abgeschieden. [26] und Sufian et al. [28] wurde das rohe Extrakt von Muntingia calabura
Blätter und seine Fraktionen, die jeweils zur Herstellung verwendet. Fünfhundert Gramm gereiften Blätter wurden bei Raumtemperatur luftgetrocknet (27 ±
2 ° C) für 1-2 Wochen und Masse zu einem feinen Pulver. Methanol (MeOH) wurde als Lösungsmittel für die Extraktion verwendet. Das Pulver wurde in MeOH bei einem Verhältnis von 1:20 (w /v) für 72 h getränkt. Das Gemisch wurde unter Verwendung von Filtertrichter filtriert, Baumwolle und Whatman No. 1 Filterpapier. Das Einweichen und Filtration wurden zweimal auf den Rückstand wiederholt. Das Filtrat aus jeder Extraktion gesammelt wurde in einem Rotationsverdampfer bei 40 ° C unter vermindertem Druck gesammelt und eingedampft, um Methanol-Extrakt von Muntingia calabura
(MEMC) erhalten. 2 zu erhalten eine wässrige Lösung MeOH: Das getrocknete rohe Extrakt wurde in MeOH und destilliertem Wasser (dH 2 O) Wasser im Verhältnis von 1 aufgehängt ist. Das Gemisch wurde nacheinander mit verschiedenen Lösungsmitteln partitioniert, die Petrolether und Ethylacetat, Petrolether-Fraktion (PEF), Ethylacetat-Fraktion (EAF) führt. Die Fraktionen wurden filtriert und dampft unter Vakuum zur Trockene am Rotationsverdampfer. MEMC, PEF und EAF einer HPLC unterworfen, um die Verbindung von Interesse zu quantifizieren, die mit dem Extrakt der gastroprotektiver Wirkung in Verbindung gebracht werden könnte.
Identifizierung und Quantifizierung von phytoconstituents in EAF durch HPLC
Methode von Zakaria et al. [34] mit leichten Modifikationen angepasst wurde die HPLC-Analyse von EAF auszuführen. Kurz gesagt, wurden 10 mg der Probe in 1 ml Methanol suspendiert. Die Lösungen wurden durch eine Filterkartusche (Porengröße von 0,45 &mgr; m) vor der Verwendung filtriert. Die Probe wurde unter Verwendung eines HPLC-Systems (Waters Delta 600 mit 600 Controller) mit Photodiodenarray-Detektor (PDA) (Waters 996) analysiert. A C 18-Säule (4,6 mm I.D. x 250 mm) wurde mit 5 &mgr; m Durchmesser Partikeln gepackt verwendet. Die mobile Phase war Wasser mit 0,1% Ameisensäure (A) und Acetonitril (B). Anfangsbedingungen waren 85% A und 15% B mit einem linearen Gradienten von 25% B bei t Erreichen
12 min =. Dieser Zustand wurde für 10 min gehalten. B wurde wieder auf 15%, den Anfangszustand, reduziert und wurde bis t
= 35 min gehalten. Bei t = 25 min
kehrte das Programm zu dem Anfangslösungsmittelzusammensetzung. Die Fließgeschwindigkeit betrug 1,0 ml /min, Injektionsvolumen betrug 10 ul und die Wellenlänge 280 nm wurden für Gallussäure und 330 nm für Quercetin. Der Säulenofen wurde auf 27 ° C eingestellt. Stammlösungen von Standards Referenzen wurden in Methanol bei einer Konzentration von 1 mg /ml hergestellt. Die Chromatographie-Peaks wurden durch Vergleich ihrer Retentionszeiten mit denen von Referenzstandards und von dem jeweiligen UV-Spektren bestätigt. Kalibrierkurve für Gallensäure war Y = 29562x + 102777 (R 2 = 0,9969) und Quercetin war Y = 43236x - 81.458 (R 2 = 0,999). Alle Chromatographie Operationen wurden bei Umgebungstemperatur und in dreifacher Ausführung durchgeführt. Die HPLC-Analyse wurde im Labor von Phytotherapie, Heilpflanzen-Abteilung, Forest Research Institute of Malaysia (FRIM), Kepong, Malaysia.
UHPLC-ESI-Analyse
Das UHPLC-System durchgeführt wurde auf einem Dionex 3000 UHPLC-System durchgeführt einem Schalenfach-Kühler, und eine binäre Pumpe mit eingebautem ausgestattet, in Lösungsmittel-Entgasungsanlage erworben von Thermo Fisher Scientific (USA), die mit einem Säulenofen von einem Autosampler bestand. Die chromatographische Trennung wurde auf einer C18 BEH UHPLC-Säule, 100 mm x 2,5 um, 1,7 um (WATERS) bei einer Fließgeschwindigkeit von 0,3 ml /min. Die mobilen Phasen verwendet wurden (A) 0,1% Ameisensäure in Wasser und (B) 0,1% Ameisensäure in Acetonitril. Der Gradient begann mit 10% mobile Phase B, 20% mobile Phase B in 5 min zu erreichen, 60% mobile Phase B bei 17,0 min, bei isokratischen Elution von 90% B für 3 min. Der Gradient erreicht die Anfangsbedingungen für 2 min als Wieder Äquilibrierungsschritt gehalten wurden. Das Injektionsvolumen betrug 10 ul und die Säulentemperatur wurde bei 40 ° C gehalten. Das UHPLC-System wurde zu einer linearen Ionenfallen-Orbitrap-Massenspektrometer Q Exactive von Thermo Fisher Scientific (U.S.A.), gekoppelt mit einem Elektrospray-Ionisation (ESI) Quelle ausgestattet. Die Massendetektion wurde in einem Bereich von 150-1500 m /z durchgeführt. Source-Spannung 3,2 kV;: Die ESI-Quelle wurde in negativen Ionenmodus unter den folgenden speziellen Bedingungen betrieben Sheathgas, 35 willkürlichen Einheiten; Hilfsgas, 15 willkürliche Einheit; fegen Gas, 10 willkürliche Einheit; und Kapillar-Temperatur, 320 ° C. Stickstoff (> 99,98%) wurde als Mantelgas verwendet, Hilfs- und Gas fegen. Gerätesteuerung und Datenerfassung wurden mit Chameleon 6.8 Software und Xcalibur 2.2 Software (Thermo Fisher Scientific) durchgeführt
Tiere
Die Versuche an männlichen Sprague Dawley Ratten durchgeführt wurden. (180-200 g; 8-10 Wochen alt). Sie wurden von der Tiereinheit, Fakultät für Medizin und Gesundheitswissenschaften, UPM, Malaysia erhalten. Die Tiere wurden in Polypropylenkäfigen mit Holzschnitzeln gehalten, mit Standard-Pellet gespeist und erlaubt den freien Zugang zu Wasser. in der Tierhalteeinheit (UPM) Sie wurden in der Raumtemperatur; (; 70-80% Luftfeuchtigkeit 12 h Licht /Dunkelheit-Zyklus 27 ± 2 0 ° C) gehalten. Vor allen Tests wurden die Ratten fasteten. Standard Drogen und MEMC wurden oral (p.o.) mit der Schlundsonde mit 8% Tween 80 (10 ml /kg) als Vehikel verabreicht. Die Verwendung von Tieren in dieser Studie wurde von der Animal Care und Gebraucht Committee (ACUC) von UPM zugelassen (Zulassungsnummer: UPM /FPSK /PADS /BR-UUH /00474)
Bestimmung des Mechanismus der magenschützende Aktivität der zu Grunde liegen. EAF
Bindung pylori
Methode von Shay et al. [35] mit leichten Modifikationen verwendet wurde Bindung pylori durchzuführen. Die Ratten wurden zufällig in 5 Gruppen eingeteilt, wobei sechs Ratten in jeder Gruppe. Gruppe-I wurde die Kontrollgruppe mit 8% Tween verabreicht 80 (Vehikel) oral (po), Gruppe-II war die positive Kontrolle verabreicht mit Ranitidin bei 100 mg /kg (po), während für die Gruppe-III, -IV und- V wurden die Ratten mit EAF verabreicht (100, 250 und 500 mg /kg, jeweils). Pylorus-Ligation wurde 48 h nüchternen Ratten 1 h nach der Verabreichung der Testverbindungen durchgeführt. Unter leichten Anästhesie Ketamin HCl induziert unter Verwendung von (100 mg /kg, intramuskulär) und Xylazin HCl (16 mg /kg, intramuskulär), eine 2 cm lange Mittellinie wurde Bauchschnitt durchgeführt, knapp unterhalb des Brustbeins. Der Pylorus Teil des Magens war sanft mobilisierte und vorsichtig mit einem Seidenligatur um den Magenpförtner in einem festen Knoten abgebunden. Es wurde darauf geachtet, während der Bindung des Knotens Interferenz mit Magen Blutversorgung zu vermeiden. Der Bauchschnitt vernäht wurde, wurde die Haut von irgendwelchen Blutflecken gereinigt oder Blutungen und die Tiere wurden aus der Narkose zu erholen.
Beurteilung der Magenschleimhaut Läsion
Die Tiere wurden 6 Stunden nach der Ligatur durch die Einwirkung von Diethylether geopfert und zervikale Dislokation. Die Mägen wurden entfernt, und der Inhalt wurde abgelassen, gesammelt und zentrifugiert. Der Magen wurde entlang der großen Kurvatur geöffnet, um die Läsion Schaden zu bestimmen, wie durch Balan et al. [36]. Der prozentuale Schutz wurde anhand der folgenden Formel berechnet: $$ \\ mathrm {Schutz} \\ \\ left (\\% \\ rechts) = \\ frac {\\ left (\\ mathrm {U} \\ mathrm {A} \\ \\ mathrm {Steuerung} \\ \\ hbox {-} \\ \\ mathrm {U} \\ mathrm {A} \\ \\ mathrm {p} \\ mathrm {R} \\ mathrm {e} \\ hbox {-} \\ mathrm {behandelt} \\ \\ mathrm {Gruppe} \\ rechts)} {\\ left (\\ mathrm {U} \\ mathrm {A} \\ \\ mathrm {Steuerung} \\ right)} \\ mal 100 \\% $$ Bestimmung von Volumen, pH-Wert, freiem und Gesamtsäuregehalt von Mageninhalt
das abgelassene Mageninhalt wurde 10 min bei 2500 rpm zentrifugiert, um festen Debris zu entfernen. Das Volumen und pH des Magensafts wurde gemessen. Der Magensaft wurde ebenfalls frei und Gesamtsäure Schätzung gemäß Verfahren, beschrieben von Srivastava et al unterworfen. [37]. Titration mit 0,01 N NaOH mit Methylorange-Reagenz wurde durchgeführt, bis die Farbe der Lösung gelblich wurde, um den Gehalt an freien Fettsäuren zu bestimmen. Das Volumen an zugegebenem Alkali festgestellt wurde. Dann werden zwei bis drei Tropfen Phenolphthalein wurde zu der Lösung gegeben. Die Lösung wurde titriert, bis definitive roten Reflexen erscheinen. Das Gesamtvolumen der NaOH zugegeben festgestellt wurde. Dieses Volumen entspricht Gesamtsäure. Säure wurde mit der folgenden Formel berechnet: $$ \\ mathrm {} Acidität = \\ frac {\\ mathrm {Volume} \\ \\ mathrm {der} \\ \\ mathrm {NaOH} \\ times \\ mathrm {Normalität} \\ \\ mathrm {von} \\ \\ mathrm {NaOH} \\ times 100} {0,1} \\ mathrm {m} \\ mathrm {e} \\ mathrm {q} /\\ mathrm {l} $$ Schätzung von Protein
der Gesamtproteingehalt im Magensaft wurde geschätzt, durch Lowry-Methode, von Lowry et al angepasst. [38] alkalischen Kupfer-Reagenz und Folin-Reagenz verwendet wird. Die Farbe entwickelt wurde bei 660 nm abgelesen. Der Proteingehalt wurde aus der Standardkurve berechnet, hergestellt mit Rinderserumalbumin und die Proteinkonzentration wurde als mg /ml Magensaft ausgedrückt.
Abschätzung der Magenwand Schleimgehalt
Verfahren, beschrieben von Corne et al. [39] mit leichten Modifikationen wurde die Magenwand Schleim Inhalt zu bestimmen, verwendet. Der Magen wurde entlang der großen Kurvatur, gewogen geöffnet und in 10 ml von 0,1% Alcianblau (0,16 M Saccharose in 0,05 M Natriumacetat, pH 5,8) für 2 h eingetaucht. Der Magen wurde dann zweimal in 0,25 M Saccharoselösung (jeweils 15 min) gespült, um die überschüssigen Farbstoff zu entfernen. Der verbleibende Farbstoff, der mit dem Magenschleim im Komplex wurde mit 0,5 M MgCl 2 extrahiert. Das Drüsen Segment blieb in dieser Lösung für 2 h mit intermittierendem Rühren für 1 min in jedem 30 min-Intervall. Das sich ergebende blaue Extrakt wurde dann mit einem gleichen Volumen Diethylether bis zur Bildung einer Emulsion kräftig geschüttelt. Die resultierende Emulsion wurde für 10 min bei 3600 rpm zentrifugiert. Die Absorption der wässrigen Schicht wurde bei 580 nm mit einem Spektrophotometer abgelesen. Die Konzentration von Alcianblau wurde durch eine Standardkurve berechnet und die Ergebnisse wurden in mg Alcianblau /g feuchtes Gewebe.
Ethanol-induzierte Magenschleimhaut Läsion in L-NAME oder NEM vorbehandelt Ratten
die zum Ausdruck gebrachten Rolle von endogenem NO und die Beteiligung von Sulfhydryl (SH) -Verbindungen in der gastroprotektiven Wirkung von EAF wurden unter Verwendung des von Takayama et al beschrieben, bewertet. [40]. Männliche Ratten wurden in 9 Gruppen eingeteilt und vorbehandelte (ip) mit Kochsalzlösung, L-NAME (N-nitro-L-Arginin-Methylester, 70 mg /kg) einem Inhibitor der NO-Synthese oder NEM (N-Ethylmaleimid, 10 mg /kg) eine SH-Verbindung Blocker. Dreißig Minuten nach der Vorbehandlung wurden die Tiere verabreicht (p.o.) Fahrzeug (8% Tween 80), Carbenoxolon (100 mg /kg) oder EAF (500 mg /kg). Sechzig Minuten später wurden alle Gruppen erhielten absolutem Ethanol (5 ml /kg, p.o) Magengeschwüre zu induzieren. Alle Ratten wurden 1 h nach der Verabreichung von Ethanol durch Einwirkung von Diethylether und zervikale Dislokation getötet. Der Magen wurde entfernt und Magenschädigung wurde wie oben beschrieben bestimmt. Da EAF eine dosisabhängige Wirkung zeigten und ausgeübt wesentliche Schutzwirkung gegen Magenschleimhaut im Magengeschwür-Modell Ethanol-induzierten, die höchste effektive Dosis (500 mg /kg) wurde für diese Studie verwendet.
Biochemische Analyse
Measurement von Superoxid-Dismutase (SOD), Glutathion (GSH) Ebene und Katalase (CAT) Aktivität
Magen Gewebe der Ratten mit Vehikel vorbehandelt (8% Tween 80), Ranitidin (100 mg /kg) oder EAF (100, durch Geschwür Induktion mit absolutem Ethanol für 1 h, gefolgt 250 und 500 mg /kg) wurden für die Bestimmung von SOD, GSH-Ebene und CAT-Aktivität verwendet. Magen-Gewebe wurde in Stücke geschnitten und das genaue Gewicht wurde aufgezeichnet. Die Gewebe wurden mit einem Homogenisator unter Verwendung von geeigneten kaltem Puffer homogenisiert und dann bei 10000 g für 15 min bei 4 ° C zentrifugiert wurden. Die Überstände wurden verwendet, um die Aktivitäten von CAT und Ebenen der SOD und GSH zu bestimmen. Die Konzentration von Protein in den Überständen wurde durch das Bradford-Verfahren [41] unter Verwendung von Rinderserumalbumin (BSA) als Standard gemessen. Levels von SOD, GSH und CAT wurden unter Verwendung der im Handel erhältlichen Test-Kits bestimmt nach den Anweisungen des Herstellers, bzw. (Superoxid-Dismutase Assay Kit, Glutathione Assay Kit und Katalase Assay Kit, Cayman Chemical Company, Ann Arbor, MI, USA).
Messung von Malondialdehyd (MDA) Ebene
MDA-Spiegel wurden in Magengewebe aus der Ethanol-induzierten Magengeschwüren erhalten gemessen. Die Magengewebe wurde homogenisiert und zentrifugiert, wie vorher beschrieben, und der Überstand wurde zur Bestimmung von MDA verwendet durch einen enzyme-linked immunosorbent assay-Kit (USCN Life Science Inc., Atlanta, GA, USA). Die optischen Dichten wurden bei 450 nm gemessen, und die Ergebnisse wurden als ng /mg Protein.
Bestimmung von Prostaglandin E2 (PGE2)
PGE ausgedrückt 2-Spiegel wurden in Magengewebe von der Ethanol-induzierten Magen erhalten bestimmt Geschwür. Der Überstand von homogenisiert und zentrifugiert Magengewebe wurde zur Bestimmung von PGE 2 unter Verwendung Prostaglandin E 2 Express EIA Kit (Cayman Chemical Company, Ann Arbor, MI, USA) verwendet. Die optischen Dichten wurden bei 412 nm gemessen. Die PGE 2-Konzentrationen wurden durch Proteingehalt normalisiert und die Ergebnisse wurden als pg /mg Protein.
Bestimmung der NO-Ebene
NO Ebene in der Magenschleimhaut als Gesamt Nitrat /Nitritspiegel mit Griess-Reagenz bewertet wurde ausgedrückt [42]. Kurz gesagt, wurden die Magen Homogenaten in 50 mM Kaliumphosphat-Puffer (pH 7,8) hergestellt. Die Homogenate wurden bei 4000 rpm für 10 min bei 4 ° C zentrifugiert. Fünfzig Mikroliter von Griess-Reagenz (0,1% N- (1-naphthyl) ethylendiamid dihydrochlorid, 1% Sulfanilamid in 5% Phosphorsäure) wurde auf 50 &mgr; l Überstand zugegeben, und die Extinktion wurde bei 540 nm nach 10 min gemessen. Natriumnitrit wurde als Standard in diesem Test verwendet die Standardkurve zu erzeugen.
Statistische Analyse
Die Ergebnisse als Mittelwert ± Standardabweichung Mittelwert ausgedrückt wurden (SEM) und analysiert One Way Varianzanalyse (ANOVA) mit, gefolgt von Dunnetts post hoc
Test oder dem Newman-Keuls-Test. Die Ergebnisse wurden als signifikant angesehen, wenn p <
0
05.
Ergebnisse | Identifizierung und Quantifizierung von Gallensäure und Quercetin
HPLC Abnahme von Fingerabdrücken von MEMC, PEF und EAF die Anwesenheit des gallischen enthüllt Säure bei λ max 216,6-272,0 nm und Quercetin bei λ max 255,5-370,6 nm (Abb. 1a und b). Schmettern dieser Verbindungen in MEMC, PEF oder EAF erhöht den Spitzenbereich, entsprechend dem gleichen λ max-Wert der Verbindungen. Die Quantifizierung Ergebnis in Tabelle 1 zeigt, dass EAF die höchste Menge an Gallussäure (39,89 ± 0,96 mg /g Extrakt) und Quercetin (9,36 ± 0,29 mg /g Extrakt), gefolgt von MEMC und PEF enthält. Feige. 1 a und b: HPLC-Analyse von MEMC, PEF und EAF durchgeführt bei der Wellenlänge 330 nm, das Vorhandensein der Quercetin bei RT 3,696 min bei &lgr; max von 255,5 bis 370,6 nm ergab. Spiking von Quercetin mit den Extrakten erhöhte die Peakfläche, auf der gleichen λ max-Wert der Verbindungen entspricht. c und d: HPLC-Fingerprinting von MEMC, PEF und EAF bei 280 nm Wellenlänge zeigte die Anwesenheit des gallicacid bei &lgr; max von 216,6 bis 272,0 nm bei RT 4,204 min. Spiking der Gallussäure mit den Extrakten erhöhte die Peakfläche, auf der gleichen λ max-Wert der Verbindungen entsprechen
Tabelle 1 Gallussäure und von Quercetin Zusammensetzung in MEMC und seine aktiven Fraktionen (PEF und EAF) in mg /1 g Extrakt. Die Ergebnisse sind als Mittelwert ± Standardabweichung (SD) von drei Bestimmungen ausgedrückt
Verbindungen
MEMC
PEF
EAF
Gallussäure (mg /g)
11,97 ± 0,27
3,40 ± 0,01
39,89 ± 0,96
Quercetin (mg /g)
4,83 ± 0,16
8,81 ± 0,44
9,36 ± 0,29
Identifizierung von phenolischen Verbindungen in EAF
EAF wurde auf der Grundlage der genauen Massendaten der Molekülionen analysiert, in denen Ionen wurden durch ihre erzeugte Molekülformel vorläufig identifiziert erkannt, durch die Software Datenanalyse (Xcalibur), die Liste der möglichen elementaren bereitgestellt Formeln, zusammen mit der Verwendung von Standard bei Verfügbarkeit und nach der gründlichen Überblick über die Literatur. die weithin akzeptierte Genauigkeit Schwelle für die Bestätigung der Elementzusammensetzungen
bei 5 ppm hergestellt wurde. Die UHPLC-ESI-Analyse von EAF zeigte die Anwesenheit von 22 phenolischen Verbindungen (Tabelle 2), die die höchste erreichbare Anzahl Liste, Verweilzeit, m /z
beobachtet, die erzeugte Summenformel und die vorgeschlagene Verbindung nachgewiesen. Figur 2 entspricht dem Basispeak Chromatogramm in negative Ionen, mit der Molekülstruktur von ermanin, kaempferide, pinobaksin und pinostrobin in Fig. 3.Table 2 phenolhaltigen Verbindungen in EAF von UHPLC-MS
Peak Nr identifiziert
tR (min)
[MH] -
Fehler (ppm)

Formel
Identification
1.
0.45
169,01376
3,433
C7H5O5
2.
2,34
Gallussäure

163,03978
4,964
C9H7O3
Protocatechusäure
3.
3.10
193,05020
3,443
C10H9O4
Ferulasäure
4.
4,53
599,10547
3,879
C28H23O15
Quercitrin-2 "-O-Gallat
5.
4,93
939,11377
4.220
C41H31O26
Pentagalloyl -hexoside II
6.
5,05
447,09421
4,523
C21H19O11
Kaempferol-3-O
-galactoside
7.
5,31
317,0308
5.130
C15H9O8
Myricetin
8.
6.20
193,08661
3,569
C10H9O4
Isoferulic acid
9.
6,91
583,11053
3,941
C28H23O14
Afzelin-O-Gallat
10.
7,35
301,03586
4,023
C15H9O7
Quercetin
11.
7,42
603,07928
3,894
C30H19O14
Quercetin-Dimer
12.
7,67
255,06636
4.605
C15H11O4
Pinocembrin
13.
8,14
593,13116
3,697
C30H25O13
Kaempferol-3-O
-glucoside
14.
8,18
315,05196
6.478
C16H11O7
Rhamnetin
15.
8,55
271,06094
3,099
C15H12O5
Pinobaksin
16.
8,94
285,04037
3,528
C15H9O6
Kaempferol
17.
10.80
253,05063
4,326
C15H9O4
Chyrsin I
18.
11.67
253,05099
5,749
C15H9O4
Chyrsin II
19.
11.91
299,05597
3,195
C16H11O6
Kaempferide
20.
12.56
313,07245
5,703
C17H13O6
Ermanin I
21
12.78
313,07230
5.224
C17H13O6
Ermanin II
22.
13.32
269,08194
4.105
Feige. Feige. Alle Autoren gelesen und genehmigt haben das endgültige Manuskript.

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