Mecanismo (s) de la acción subyacente el efecto gastroprotector de la fracción de acetato de etilo obtenido de la metanólico crudo extracto de hojas de Mecanismo calabura

Muntingia (s) de la acción subyacente el efecto gastroprotector de la fracción de acetato de etilo obtenido de la metanólico crudo extracto de hojas de Muntingia calabura

Resumen Antecedentes

Muntingia calabura
L. (familia muntingiaceae), comúnmente conocida como la cereza de Jamaica o kerukup Siam Hoteles en Malasia, se utiliza tradicionalmente para tratar diversas dolencias. El objetivo de este estudio es dilucidar los posibles mecanismos subyacentes de gastroprotectores fracción de acetato de etilo (EEP) de Muntingia calabura
metanólica extracto de hojas (MEMC).
Métodos
MEMC y sus fracciones se sometieron a análisis de HPLC identificar y cuantificar la presencia de sus fito-constituyentes. El mecanismo de gastroptotection de EAF se investigó adicionalmente usando el modelo de ligadura del píloro inducida por lesión gástrica de rata (100, 250, y 500 mg /kg). El análisis macroscópico del estómago, evaluación de los parámetros de contenido gástrico, como el volumen, el pH, la acidez libre y total, la estimación de la proteína, y la cuantificación de moco se llevaron a cabo. Se evaluó la participación de óxido nítrico (NO) y compuestos de sulfhidrilo (SH) y la superóxido dismutasa (SOD), glutatión (GSH), catalasa (CAT), malondialdehído (MDA), la prostaglandina E 2 (PGE 2) y se determinó el nivel de NO en el homogeneizado de tejido del estómago inducida por etanol.
resultados
análisis HPLC confirmó la presencia de quercetina y ácido gálico en horno eléctrico de arco. En el modelo de ligadura del píloro, EAF significativamente (p Hotel < 0,001) prevenir la formación de la lesión gástrica. Volumen de contenido gástrico y el contenido total de proteínas reducido significativamente (p
< 0,01 y p
< 0,05, respectivamente), mientras que la acidez libre y total reducida en las dosis de 250 y 500 mg /kg (p
< 0,001 y p
< 0,05, respectivamente). EAF también aumenta el contenido de moco significativamente (p Hotel < 0,001). Pre-tratamiento con N-nitro-L-arginina metil éster (L-NAME) o N-etilmaleimida (NEM) invirtió la actividad gastroprotectora de EAF. EEP tratamiento mejoró notablemente la SOD, GSH y la actividad de CAT y PGE 2 y nivel de NO mientras que atenúa el nivel de MDA, en relación con el grupo de vehículo.
Conclusiones
En conclusión, los mecanismos subyacentes gastroprotectores del EEP podrían estar asociados con el antisecretor, la participación de moco, antiperoxidative, la mejora del estado antioxidante, la modulación de compuestos de NO y SH, la estimulación de PGE 2, así como la presencia de quercetina y ácido gálico.
Palabras clave
Muntingia calabura
fracción de óxido de úlcera gástrica antisecretor Antioxidante nítrico compuesto de sulfhidrilo prostaglandina quercetina galo Antecedentes ácido
úlcera gástrica es uno de los principales trastornos gastrointestinales que afectan a gran número de personas en todo el mundo, mientras que el crecimiento en presencia y prevalencia en todo el mundo [1]. Algunos autores se refieren a las úlceras gástricas como la nueva "plaga" del siglo 21 [2]. Se ha proyectado que 14,5 millones de la población en todo el mundo se ven afectados por úlceras gástricas con una tasa de mortalidad de 4,08 millones de personas [3]. La fisiopatología de la úlcera gástrica se asocia con el desequilibrio entre factores agresivos y protectores en el estómago. daño de la mucosa gástrica se produce cuando los factores nocivos "abrumar" una defensa de la mucosa intacta, o el debilitamiento de los mecanismos de defensa de la mucosa [4]. Los factores nocivos en este contexto incluyen la ingestión de alcohol, la secreción de ácido y la pepsina, la mala alimentación, el estrés, especies reactivas de oxígeno (ROS), el uso de fármacos no esteroides anti-inflamatorios no esteroideos (AINE) y la infección por Helicobacter pylori
[5, 6]. Por otra parte, los factores de defensa clave y mecanismos que ofrezcan defensa de la mucosa incluyen suficiente secreción de moco y el flujo sanguíneo de la mucosa, la secreción de bicarbonato, la barrera de moco intacto, prostaglandinas, superficie fosfolípidos activos, aumento de los niveles de antioxidantes, la actividad de compuestos anti-inflamatorios y adecuada los niveles de óxido nítrico (NO) [6-8].
Actualmente, la prevención y el tratamiento de las úlceras gástricas ha ganado mucho interés y se convirtió en importante reto y enfrentar la medicina hoy en día. Hasta la fecha, hay algunos enfoques utilizados para prevenir la ulceración gástrica, que incluyen la potenciación de la defensa de la mucosa, junto con la reducción de la secreción de ácido y su neutralización, la estimulación de la síntesis de mucina gástrica, la mejora de los niveles de antioxidantes en el estómago, y la inhibición de Helicobacter pylori
crecimiento [9]. La secreción de ácido gástrico se cree que es el componente central de las úlceras gástricas a pesar de la presencia de muchos factores causales [7] y por lo tanto, la inhibición de la secreción de ácido gástrico tienden a ser la diana terapéutica clave para enfermedades de úlcera [10]. Por otro lado, otro factor clave en la patogénesis de las úlceras gástricas es la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS). La producción de ROS y una reducción concomitante de la capacidad antioxidante causa daño a los constituyentes celulares esenciales, que son proteínas, lípidos y ácidos nucleicos, lo que resulta en la formación de compuestos tóxicos y causa la muerte celular debido a su extrema reactividad [8, 11]. Por lo tanto, el control de la formación de ROS y la secreción de ácido gástrico son esenciales para el tratamiento de estas patologías [12]. Comentario El tratamiento medicinal actual de las úlceras gástricas incluyen bloqueadores de ácido que reducen la secreción de ácido, inhibidores de la bomba de protones, antibióticos para erradicar Helicobacter pylori
y el tejido de revestimiento proteger agentes tales como sucralfato y colinérgicos bismuto [13, 14]. Apesar de estas drogas han disminuido las tasas de morbilidad, pero a menudo están asociados con efectos adversos indeseables, tales como la hipersensibilidad, la impotencia, la arritmia, trastornos hematopoyéticos, ginecomastia y la resistencia a los antibióticos a largo plazo [15, 16]. Además, estos fármacos disponibles también tienen alta tasa de recaída, baja eficacia en el tratamiento de úlceras gástrica y son a menudo costosos [5, 9, 10]. Por lo tanto, existe una necesidad urgente de descubrir una más eficaces y seguras terapias alternativas para el tratamiento de las úlceras gástricas. En este contexto, el uso de plantas medicinales ha ganado interés y captado la atención de muchos investigadores. Los extractos de plantas pueden ser valiosos y servir como una nueva fuente de productos terapéuticos en el tratamiento de úlceras gástricas mediante el cual antisecretor, actividades citoprotectores y antioxidantes, aislados o en combinación, son las tres principales funciones de un agente gastroprotector, que desempeñan un papel clave en la mucosa gástrica la protección [17].
La planta Muntingia calabura
L. (familia muntingiaceae), comúnmente conocida como la cereza de Jamaica o kerukup Siam Hoteles en Malasia, está ampliamente distribuida en todas las zonas cálidas de Asia [18]. Varios usos medicinales se han documentado en varias partes de este árbol en el este y el sudeste de Asia, así como América tropical. de Muntingia calabura
hojas, flores, cortezas y raíces se han utilizado como un remedio popular para el tratamiento de dolores de cabeza, fiebre y frío incipiente. Según el folklore peruano, las hojas se utilizan para proporcionar alivio de las úlceras gástricas y para reducir la inflamación de la glándula de la próstata [19]. Además, también se emplean como agente antiséptico, antiespasmódico, y antidispépticos [20, 21].
Por otro lado, Muntingia calabura
se informa de poseer una amplia gama de actividades farmacológicas, que han sido probados científicamente. Esto incluye antitumoral [20, 22], antibacteriana [23], antinocicepción [19, 24, 25], anti-inflamatorios, antipiréticos [25], antioxidantes y antiproliferativos [26] Las actividades mostradas por las hojas de Muntingia calabura
, mientras que varios tipos de compuestos se han aislado e identificado a partir de las hojas, raíces y tallos cortezas de Muntingia calabura
[20-22, 27, 28]. Fitoquímicos diferentes se han detectado en las hojas de Muntingia calabura
tales como flavonoides, saponinas, taninos y triterpenos [29].
En nuestro estudio anterior, hemos reportado la actividad gastroprotector de varias fracciones, obtenidos de extracto de metanol crudo de Muntingia calabura gratis (MEMC) se va contra la lesión gástrica inducida por etanol en ratas [30]. De nuestro estudio, hemos encontrado que la fracción de acetato de etilo marcadamente aminorar la ulceración gástrica y ejercido la protección más eficaz en comparación con las otras fracciones. Por lo tanto, el presente estudio fue dirigido para determinar el mecanismo de acción subyacente en el efecto profiláctico de la fracción de acetato de etilo derivado de MEMC contra las lesiones gástricas en ratas.
Modelo del píloro ligadura usado en este estudio es uno de los modelos más utilizados para estudiar el efecto de los fármacos sobre el ácido gástrico y la secreción de moco. Úlceras desarrollados ligando el extremo pilórico del estómago son causados ​​por el aumento de la secreción y /o estasis de ácido gástrico ácido clorhídrico (HCl), que conduce a la digestión de automóviles de la mucosa gástrica y la descomposición de la barrera de la mucosa gástrica [31]. Por lo tanto, los agentes que son capaces de aumentar la secreción de mucus (citoprotector) y /o reducir la secreción de factores agresivos gástricos tales como la pepsina y el ácido son agentes gastroprotectores eficaces [32]. Por otro lado, el modelo de úlcera inducida por etanol es útil para estudiar la eficacia de los fármacos potenciales o probar agentes que tienen y /o actividad antioxidante citoprotectores [33].
Métodos Químicos

los productos químicos utilizados en este estudio son de los grados de análisis y se había preparado inmediatamente antes de su uso. Se utilizaron los siguientes fármacos: ranitidina (Sigma Aldrich, EE.UU.), etanol absoluto (Fischer Scientific, EE.UU.), N-etilmaleimida (NEM) (Sigma-Aldrich, EE.UU.), N G-nitro-L-arginina ésteres metílicos (L-NAME) (Sigma-Aldrich, EE.UU.), carbenoxolona (CBX) (Sigma-Aldrich, EE.UU.) y éter dietílico (Fischer Scientific, EE.UU.).
material de plantas
Muntingia calabura se recogieron hojas
de su hábitat natural en Shah Alam, Selangor, Malasia, entre mayo y agosto de 2010. la planta fue identificada por un botánico del Instituto de Biociencias (SII), la Universidad Putra Malaysia (UPM), Serdang, Selangor. Un ejemplar de muestra, SK 2466/14, ha sido depositado en el SII Laboratorio UPM de Productos Naturales Herbario.
Extracción y fraccionamiento de Muntingia calabura
deja
método descrito por Zakaria et al. [26] y Sufian et al. [28] se empleó para preparar el extracto crudo de Muntingia calabura
hojas y sus fracciones, respectivamente. Quinientos gramos de hojas maduras se secaron al aire a temperatura ambiente (27 ±
2 ° C) durante 1-2 semanas y se muele en polvo fino. El metanol (MeOH) se utilizó como el disolvente para la extracción. El polvo se empapó en MeOH en una proporción de 1:20 (w /v) durante 72 h. La mezcla se filtró usando un embudo de filtro, algodón y papel de filtro Whatman No. 1. El remojo y la filtración se repitieron en el residuo de dos veces. El filtrado recogido de cada extracción se reunieron y se evaporaron en un evaporador rotatorio a 40 ° C bajo presión reducida para obtener extracto de metanol de Muntingia calabura
(MEMC). El extracto bruto secado se suspendió en MeOH y agua destilada (dH 2O) agua en la proporción de 1: 2 para dar una solución acuosa de MeOH. La mezcla se repartió secuencialmente con diferentes disolventes, que eran éter de petróleo y acetato de etilo, produciendo petróleo fracción éter (PEF), fracción de acetato de etilo (EEP). Las fracciones se filtraron y se evaporaron a sequedad a vacío usando un evaporador rotatorio. MEMC, PEF y EAF se sometieron a HPLC para cuantificar el compuesto de interés, que podría estar asociada con efecto gastroprotector del extracto.
Identificación y cuantificación de fitoconstituyentes presentes en EAF por HPLC
método descrito por Zakaria et al. [34], con ligeras modificaciones fue adaptado para llevar a cabo el análisis de HPLC del EEP. Brevemente, se suspendió 10 mg de muestra en 1 ml de metanol. Las soluciones se filtraron a través de un cartucho de filtro (tamaño de poro de 0,45 micras) antes de su uso. La muestra se analizó usando un sistema de HPLC (Waters Delta 600 con 600 Controller) con detector de matriz de fotodiodos (PDA) (Waters 996). Se utilizó un C 18 columna (4,6 mm de diámetro interno x 250 mm) empaquetada con partículas de 5 micras de diámetro. La fase móvil fue agua que contiene 0,1% de ácido fórmico (A) y acetonitrilo (B). Las condiciones iniciales eran 85% de A y 15% B con un gradiente lineal de llegar a 25% de B en t
= 12 min. Esta condición se mantuvo durante 10 min. B se redujo de nuevo a 15%, la condición inicial, y se mantuvo hasta que t = 35 min
. En t = 25 min
, el programa vuelve a la composición del disolvente inicial. El caudal fue de 1,0 ml /min, volumen de inyección fue de 10 l y la longitud de onda eran 280 nm para el ácido gálico y 330 nm para la quercetina. El horno de la columna se fijó en 27 ° C. Las soluciones madre de los estándares referencias se prepararon en metanol a una concentración de 1 mg /ml. Los picos de cromatografía fueron confirmadas mediante la comparación de su tiempo de retención con los de patrones de referencia y por los espectros de UV respectivo. Curva de calibración para el ácido gálico fue Y = 29562x + 102777 (R 2 = 0,9969) y la quercetina fue Y = 43236x - 81458 (R 2 = 0,999). Todas las operaciones de cromatografía se llevaron a cabo a temperatura ambiente y por triplicado. El análisis por HPLC se llevó a cabo en el Laboratorio de Fitomedicina, plantas medicinales División, Instituto de Investigación Forestal de Malasia (FRIM), Kepong, Malasia.
Análisis UHPLC-ESI Francia El sistema UHPLC se llevó a cabo en un sistema UHPLC Dionex 3000 adquirido de Thermo Fisher Scientific (EE.UU.), que consistía en un muestreador automático equipado con un horno de columna, un enfriador de compartimiento de la bandeja, y una bomba binaria con desgasificador construido en disolvente. La separación cromatográfica se realizó en una columna BEH C18 UHPLC, 100 mm x 2,5 m, 1,7 m (Waters) a una velocidad de flujo de 0,3 mL /min. Las fases móviles utilizadas fueron (A) 0,1% de ácido fórmico en agua y (B) 0,1% de ácido fórmico en acetonitrilo. El gradiente se inició con 10% de fase móvil B, llegando a 20% de fase móvil B en 5 min, 60% de fase móvil B en 17,0 min, en elución isocrática de 90% de B durante 3 min. El gradiente alcanzó se llevaron a cabo las condiciones iniciales durante 2 minutos como un paso re-equilibrio. El volumen de inyección fue de 10 l y la temperatura de la columna se mantuvo a 40 ° C. El sistema UHPLC se acopló a un espectrómetro de masas de iones-trampa-Orbitrap lineal Q Exactive de Thermo Fisher Scientific (U.S.A.) equipado con una fuente de ionización electrospray (ESI). La detección de masas se realizó en un intervalo de 150 a 1.500 m /z. La fuente ESI fue operado en modo de iones negativos en las siguientes condiciones específicas: voltaje de la fuente, 3,2 kV; gas vaina, 35 unidades arbitrarias; gas auxiliar, 15 unidad arbitraria; barrer gas, 10 unidad arbitraria; y la temperatura del capilar, 320 ° C. El nitrógeno (> 99,98%) fue empleado como gas envolvente, auxiliar y de gas de barrido. control de instrumentos y la adquisición de datos se realizaron con el software camaleón 6.8 y el software Xcalibur 2.2 (Thermo Fisher Scientific)
Animales
Los experimentos se realizaron en ratas Sprague Dawley. (180-200 g; 8-10 semanas de edad). Ellos fueron obtenidos de la Unidad Animal de la Facultad de Medicina y Ciencias de la Salud, UPM, Malasia. Los animales se mantuvieron en jaulas de polipropileno con virutas de madera, alimentados con pellet estándar y permite el acceso libre al agua. Se mantuvieron en la temperatura ambiente (27 ± 2 0C; 70-80% de humedad; 12 h de luz /oscuridad ciclo) en la Unidad de concentración del ganado (UPM). Antes de todos los ensayos, se mantuvieron en ayunas las ratas. medicamentos estándar y MEMC se administraron oralmente (p.o.) por sonda con 8% de Tween 80 (10 ml /kg) como vehículo. El uso de animales en este estudio fue aprobado por el Comité de Cuidado de Animales y de ocasión (ACUC) de la UPM (Número de Registro: UPM /FPSK /PADS /BR-UUH /00474)
Determinación del mecanismo subyacente a la actividad de gastroprotectores. EEP
ligadura pilórica
Método de Shay et al. [35], con ligeras modificaciones fue empleado para realizar la ligadura de píloro. Las ratas se dividieron al azar en 5 grupos, con seis ratas en cada grupo. Grupo-I fue el grupo de control administrado con 8% de Tween 80 (vehículo) por vía oral (po), Grupo-II fue el control positivo administrado con ranitidina en 100 mg /kg (po), mientras que para el Grupo-III, -IV y- V, las ratas se administraron con EAF (100, 250 y 500 mg /kg, respectivamente). Píloro ligadura se realizó en 48 h en ayunas ratas 1 h después de la administración de los compuestos de ensayo. Bajo anestesia inducida por la luz usando HCl de ketamina (100 mg /kg, intramuscular) y HCl xilazina (16 mg /kg, intramuscular), se realizó una incisión abdominal 2 cm de largo línea media, justo debajo del esternón. La porción pilórica del estómago fue movilizada suavemente y con cuidado se ligó con una ligadura de seda alrededor del esfínter pilórico en un nudo apretado. Cuidado en atar el nudo para evitar la interferencia con el suministro de sangre gástrico. La incisión abdominal se suturó, la piel se limpió de cualquier mancha de sangre o sangrado y los animales se les permitió recuperarse de la anestesia.
Evaluación de la lesión de la mucosa gástrica
Los animales se sacrificaron 6 horas después de la ligadura por la exposición al éter dietílico y dislocación cervical. Los estómagos se retiraron, y el contenido se drena, se recogió y se centrifugó. El estómago se abrió a lo largo de la curvatura mayor para determinar el daño de la lesión como se describe por Balan et al. [36]. El porcentaje de protección se calculó utilizando la siguiente fórmula: $$ \\ mathrm {Protección} \\ \\ left (\\% \\ right) = \\ frac {\\ left (\\ mathrm {T} \\ mathrm {A} \\ \\ mathrm {Control} \\ \\ hbox {-} \\ \\ mathrm {T} \\ mathrm {A} \\ \\ mathrm {p} \\ mathrm {r} \\ mathrm {e} \\ hbox {-} \\ mathrm {tratado} \\ \\ mathrm {grupo} \\ derecha)} {\\ left (\\ mathrm {T} \\ mathrm {A} \\ \\ mathrm {Control} \\ right)} \\ tiempos 100 \\% $$ Determinación del volumen, el pH, la acidez libre y total de contenido gástrico
El contenido gástrico drenado se centrifugó durante 10 min a 2500 rpm para eliminar los residuos sólidos. Se midió el volumen y el pH del jugo gástrico. El jugo gástrico se sometió también a la estimación de la acidez libre y total de acuerdo al método descrito por Srivastava et al. [37]. La valoración con NaOH 0,01 N con el reactivo naranja de metilo se llevó a cabo hasta que el color de la solución se volvió de color amarillento con el fin de determinar la acidez libre. El volumen de álcali añadido se indique lo contrario. Después, se añadieron dos a tres gotas de fenolftaleína a la solución. La solución se ajustó hasta que aparezcan definidos reflejos rojos. El volumen total de NaOH añadido se indique lo contrario. Este volumen corresponde a la acidez total. La acidez se calculó utilizando la siguiente fórmula: $$ \\ mathrm {acidez} = \\ frac {\\ mathrm {volumen} \\ \\ mathrm {de} \\ \\ mathrm {NaOH} \\ times \\ mathrm {normalidad} \\ \\ mathrm {de} \\ \\ mathrm {NaOH} \\ tiempos 100} {0,1} \\ mathrm {m} \\ mathrm {e} \\ mathrm {q} /\\ mathrm {l} $$ Estimación de proteína
se estimó que el contenido total de proteínas en el jugo gástrico por el método de Lowry, adaptado de Lowry et al. [38] usando el reactivo de cobre alcalino y reactivo de Folin. El color desarrollado se leyó a 660 nm. El contenido de proteína se calculó a partir de la curva estándar preparada con la concentración de albúmina en suero y proteína bovina se expresó como mg /ml de jugo gástrico.
Estimación de gástrico pared moco contenido
método descrito por Corne et al. se empleó [39], con ligeras modificaciones para determinar el contenido de la pared mucosa gástrica. El estómago se abrió a lo largo de la curvatura mayor, se pesó, y se sumergió en 10 ml de 0,1% de azul de Alcian (0,16 M de sacarosa en acetato de sodio 0,05 M, pH 5,8) durante 2 h. A continuación, el estómago se aclaró dos veces en solución 0,25 M de sacarosa (15 min cada uno) para eliminar el tinte en exceso. El colorante restante que complejado con el moco gástrico se extrajo con 0,5 M MgCl 2. El segmento glandular se mantuvo en esta solución durante 2 h con agitación intermitente durante 1 min en cada intervalo de 30 min. El extracto azul resultante se agitó vigorosamente con un volumen igual de éter dietílico hasta que la formación de una emulsión. La emulsión resultante se centrifugó durante 10 min a 3600 rpm. La absorbancia de la capa acuosa se leyó a 580 nm utilizando un espectrofotómetro. La concentración de azul de Alcian se calculó a través de una curva estándar y los resultados se expresaron en mg de azul Alcian /g de tejido húmedo.
Lesión de la mucosa gástrica inducida por etanol en ratas tratadas con NEM pre Francia El L-NAME o papel de NO endógeno y la participación de compuestos de sulfhidrilo (SH) en el efecto gastroprotector de EAF se evaluaron utilizando el método descrito por Takayama et al. [40]. Las ratas macho fueron divididas en 9 grupos y tratados previamente (ip) con (éster de N-nitro-L-arginina metil, 70 mg /kg) de solución salina, L-NAME un inhibidor de la síntesis de NO o NEM (N-etilmaleimida, 10 mg /kg) un compuesto bloqueador de SH. Treinta minutos después de la pre-tratamiento, se administraron a los animales (p.o.) del vehículo (8% de Tween 80), la carbenoxolona (100 mg /kg) o EAF (500 mg /Kg). Sesenta minutos más tarde, todos los grupos recibieron etanol absoluto (5 ml /kg, p.o.) para inducir úlceras gástricas. Todas las ratas se sacrificaron 1 h después de la administración de etanol por la exposición a éter dietílico y dislocación cervical. El estómago se retiró y se determinó el daño gástrico como se describe anteriormente. Desde EAF exhibió un efecto dependiente de la dosis y ejerció acción protectora sustancial contra la mucosa gástrica en el modelo de úlcera gástrica inducida por etanol, se utilizó la dosis efectiva más alta (500 mg /kg) para este estudio.
Análisis bioquímico
Medición de la superóxido dismutasa (SOD), el nivel de glutatión (GSH) y la actividad de la catalasa (CAT)
tejidos del estómago de las ratas tratadas previamente con vehículo (8% de Tween 80), ranitidina (100 mg /kg) o EAF (100, 250 y 500 mg /kg) seguido de la inducción de la úlcera usando etanol absoluto durante 1 h se utilizaron para la determinación de SOD, el nivel de GSH y la actividad CAT. de tejido gástrico se cortó en trozos y se registró el peso exacto. Los tejidos se homogeneizaron con un homogeneizador usando tampón frío apropiado y después se centrifugaron a 10.000 g durante 15 min a 4 ° C. Se utilizaron los sobrenadantes para determinar la actividad de CAT y los niveles de SOD y GSH. La concentración de proteína en los sobrenadantes se midió por el método de Bradford [41] usando albúmina de suero bovino (BSA) como estándar. Los niveles de SOD, GSH y CAT se determinaron usando los kits de ensayo comerciales de acuerdo con las instrucciones del fabricante, respectivamente (superóxido dismutasa Assay Kit, Kit de ensayo glutatión y catalasa Assay Kit, Cayman Chemical Company, Ann Arbor, MI, US).
medición del nivel de malondialdehído (MDA)
niveles de MDA se midieron en los tejidos del estómago obtenidos a partir de la úlcera gástrica inducida por etanol. El tejido del estómago se homogeneizó y se centrifugó como se ha descrito antes y el sobrenadante se utilizó para la determinación de MDA mediante el uso de un kit de ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (USCN Life Science Inc., Atlanta, GA, EE.UU.). Las densidades ópticas se midieron a 450 nm y los resultados se expresaron como ng /mg de proteína.
Determinación de la prostaglandina E2 (PGE2)
PGE 2 se determinaron los niveles en los tejidos del estómago obtenidos de la gástrica inducida por etanol úlcera. El sobrenadante de tejido del estómago homogeneizada y centrifugada se utilizó para la determinación de PGE 2 mediante el uso de prostaglandina E 2 Equipo Express EIA (Cayman Chemical Company, Ann Arbor, MI, EE.UU.). Las densidades ópticas se midieron a 412 nm. Los PGE 2 concentraciones se normalizaron por el contenido de proteína y los resultados se expresaron como proteínas pg /mg.
Determinación del nivel de NO
nivel de NO en la mucosa gástrica se evaluó como el total de los niveles de nitrato /nitrito usando el reactivo de Griess [42]. En breve, se prepararon los homogenados estomacales en tampón de fosfato de potasio 50 mM (pH 7,8). Los homogeneizados se centrifugaron a 4000 rpm durante 10 min a 4 ° C. Cincuenta microlitros de reactivo de Griess (0,1% de N- (1-naftil) etilendiamida diclorhidrato, 1% sulfanilamida en ácido fosfórico al 5%) se añadió a 50 l sobrenadante y se midió la absorbancia a 540 nm después de 10 min. El nitrito de sodio se utiliza como estándar en este ensayo para generar la curva estándar.
El análisis estadístico
Los resultados se expresaron como media ± error estándar media (SEM) y se analizaron mediante análisis de varianza de una sola vía (ANOVA), seguido por post hoc
prueba de Dunnett o la prueba de Newman-Keuls. Los resultados se consideraron significativos cuando p <
0. 05.

Resultados
Identificación y cuantificación de ácido gálico y quercetina
HPLC toma de huellas dactilares de MEMC, PEF y EEP reveló la presencia de la gálico ácido a λ max 216,6 a 272,0 nm y quercetina en λ max 255,5 a 370,6 nm (Fig. 1a yb). Rematar de estos compuestos en MEMC, PEF o EAF aumenta el área del pico, que corresponde a la misma valor max λ de los compuestos. El resultado de cuantificación se presenta en la Tabla 1 muestra que el EEP contiene la mayor cantidad de ácido gálico (39.89 ± 0.96 mg /g de extracto) y la quercetina (9,36 ± 0,29 mg /g de extracto), seguido de MEMC y el FEM. Higo. 1 a y b: Análisis por HPLC de MEMC, PEF y EAF lleva a cabo a la longitud de onda 330 nm reveló la presencia de la quercetina en λmax 255,5 a 370,6 nm a TA 3.696 min. Rematar de quercetina con los extractos aumentó el área del pico, que corresponde al mismo valor λmax de los compuestos. c y d: HPLC de huellas dactilares de MEMC, PEF y EAF en la longitud de onda de 280 nm reveló la presencia de la gallicacid en λmax 216,6 a 272,0 nm a TA 4.204 min. Rematar de ácido gálico con los extractos aumentó el área del pico, que corresponde al mismo valor λmax de los compuestos
Tabla 1 galo ácido y la composición de quercetina en MEMC y sus fracciones activas (PEF y EAF) en mg /1 g de extracto. Los resultados se expresan como media ± desviación estándar (DE) de tres determinaciones
compuestos
MEMC
PEF
EEP
ácido gálico (mg /g)
11,97 ± 0,27 3,40 ± 0,01

39.89 ± 0.96
quercetina (mg /g)
4,83 ± 0,16 8,81 ± 0,44

9,36 ± 0,29
identificación de compuestos fenólicos en EAF
EAF se analizó en base a los datos de masa exactas de los iones moleculares, en el que iones detectados fueron tentativamente identificados por su fórmula molecular generado, a través del análisis de datos de software (Xcalibur) que proporcionó la lista de posible elemental fórmulas, junto con el uso de la norma cuando esté disponible y después de un examen exhaustivo de la literatura.
el umbral de exactitud ampliamente aceptado para la confirmación de las composiciones elementales se estableció en 5 ppm. El análisis UHPLC-ESI de EAF reveló la presencia de 22 compuestos fenólicos (Tabla 2), cuya lista el número de pico, tiempo de retención, observado m /z
, la fórmula molecular generado y el compuesto propuesto detectado. La figura 2 corresponde a la cromatograma pico base en ion negativo, con la estructura de la molécula de ermanin, kaempferide, pinobaksin y pinostrobin en la Fig. 3.Table 2 Los compuestos fenólicos identificados en horno eléctrico de arco por UHPLC-MS
Pico No se
tR (min) guía empresas [MH] - Opiniones de viajeros de error (ppm)

Fórmula
identificación
1.
0.45
169.01376
3.433
C7H5O5
ácido gálico
2.
2.34
163.03978
4.964
C9H7O3
ácido protocatechuic
3.
3.10
193.05020
3.443
C10H9O4
El ácido ferúlico
4.
4,53
599.10547
3.879
C28H23O15
quercitrina-2 "-O-galato
5.
4,93
939.11377
4.220
C41H31O26
Pentagalloyl -hexoside II
6.
5.05
447.09421
4.523
C21H19O11
kaempferol-3-O
-galactoside
7.
5,31
317.0308
5.130
C15H9O8
miricetina
8.
6,20
193.08661
3.569
C10H9O4
isoferulic ácido
9.
6,91
583.11053
3.941
C28H23O14
Afzelin-O-galato
10.
7,35
301.03586
4.023
C15H9O7
quercetina
11.
7,42
603.07928
3.894
C30H19O14
quercetina dímero
12.
7,67
255.06636
4.605
C15H11O4
pinocembrina
13.
8,14
593.13116
3.697
C30H25O13
kaempferol-3-glucósido O

14.
8,18
315.05196
6.478
C16H11O7
ramnetina
15.
8,55
271.06094
3.099
C15H12O5
Pinobaksin
16.
8,94
285.04037
3.528
C15H9O6
kaempferol
17.
10.80
253.05063
4.326
C15H9O4
Chyrsin I
18.
11.67
253.05099
5.749
C15H9O4
Chyrsin II
19.
11.91
299.05597
3.195
C16H11O6
kaempferide
20.
12.56
313.07245
5.703
C17H13O6
ermanin I
21
12.78
313.07230
5.224
C17H13O6
ermanin II
22.
13.32
269.08194
4.105
Higo. Higo. Todos los autores leído y aprobado el manuscrito final.

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• importancia clínico-patológica de claudin-4 en el carcinoma gástrico