Mekanismi (t), taustalla gastroprotektiivinen vaikutus etyyliasetaattifraktiosta saatu raakatuote metanolipitoista poistuu uutetta Muntingia calabura

mekanismi (t), taustalla gastroprotektiivinen vaikutus etyyliasetaattifraktiosta saatu raakatuote metanolipitoista poistuu uutetta Muntingia calabura

tiivistelmä
tausta
Muntingia calabura
L. (perhe muntingiaceae), joka tunnetaan yleisesti nimellä Jamaikan kirsikka tai kerukup siam
Malesiassa, käytetään perinteisesti hoitoon eri vaivoihin. Tavoitteena Tämän tutkimuksen tarkoituksena on selvittää mahdolliset taustalla gastroprotektiivinen mekanismeja etyyliasetaattifraktiosta (EAF) ja Muntingia calabura
metanolipitoista poistuu uutetta (MEMC).
Menetelmät
MEMC ja sen jakeet tehtiin HPLC-analyysi tunnistamaan ja määrittämään läsnäolo sen kasvien ainesosia. Mekanismi gastroptotection EAF tutkittiin edelleen käyttämällä mahaportin ligaation indusoiman maha- vaurion rottamallissa (100, 250, ja 500 mg /kg). Makroskooppinen analyysi vatsaan, arviointia mahalaukun sisällön parametreja kuten äänenvoimakkuutta, pH, vapaa ja kokonaishappopitoisuus, proteiinin arviointi ja kvantifiointi liman tehtiin. Osallistuminen typpioksidin (NO) ja sulfhydryl (SH) yhdisteet arvioitiin ja superoksididismutaasi (SOD), gluthathione (GSH), katalaasin (CAT), malonidialdehydi (MDA), prostaglandiini E 2 (PGE 2) ja NO tasolla etanolin aiheuttamaa mahalaukun kudoshomogenaatti määritettiin.
tulokset
HPLC-analyysi vahvisti läsnäolo quercetin ja galliinihapon in EAF. In pylorus-ligaation mallia, EAF merkitsevästi (p
< 0,001) estää mahalaukun leesionmuodostus. Volume mahalaukun sisällön ja kokonaisproteiinipitoisuus vähensi merkitsevästi (p
< 0,01 ja p
< 0,05, vastaavasti), kun taas vapaa ja kokonaishappopitoisuus pienentynyt annoksilla 250 ja 500 mg /kg (p
< 0,001 ja p
< 0,05, vastaavasti). EAF myös täydensi limapitoisuudessa merkitsevästi (p
< 0,001). Esikäsittely N-nitro-L-arginiini-metyyliesteri (L-NAME) tai Netyylimaleimidin (NEM) käänteinen gastroprotektiivinen aktiivisuutta EAF. EAF hoito selvästi parantaisivat SOD, GSH ja CAT-aktiivisuus ja PGE 2 ja NO tasolla samalla vaimentaen MDA tasolla ajoneuvon suhteen ryhmään.
Johtopäätökset
Johtopäätöksenä taustalla gastroprotektiivinen mekanismeja EAF saattaa liittyä kanssa eritystä, osallistuminen limaa, antiperoxidative parantaminen Antioksidanttistatuksen, modulaatio NO ja SH yhdisteitä, stimulaatio PGE 2 sekä läsnäolo quercetin ja galliinihapon.
avainsanat
Muntingia calabura
Fraction mahahaava antisekretoriset Antioksidantit Typpioksidi sulfhydryyliyhdiste Prostaglandiini Quercetin Gallushappo Background
mahahaava on yksi tärkeimmistä ruoansulatuskanavan häiriöt, jotka vaikuttavat huomattavan suuri määrä ihmisiä ympäri maailmaa, ja kasvaa samalla esiintyminen ja yleisyys maailmanlaajuisesti [1]. Jotkut kirjoittajat viittaavat mahahaavat uudeksi "rutto" 21. vuosisadan [2]. On ennustettu, että 14,5 miljoonaa maailman väestöstä kärsii mahahaavan jossa kuolleisuus on 4080000 [3]. Patofysiologiaan mahahaava liittyy epätasapaino aggressiivinen ja suojaavia tekijöitä vatsassa. Mahalaukun limakalvon vaurio tapahtuu, kun haitalliset tekijät "hukuttaa" ehjä limakalvon puolustus, tai heikkeneminen limakalvon suojamekanismit [4]. Myrkylliset tekijöitä tässä yhteydessä kuuluvat alkoholi nieleminen, hapon ja pepsiinin erittymistä, huono ruokavalio, stressi, reaktiivisia happiradikaaleja (ROS), käyttö steroideihin kuulumattomia tulehduskipulääkkeitä (NSAID) ja Helicobacter pylori
infektion [5, 6]. Toisaalta, avain puolustus tekijöitä ja mekanismeja, varaa limakalvon puolustuksen sisältävät riittävät liman eritystä ja limakalvon verenkiertoa, bikarbonaatin eritystä, ehjä limaa este, prostaglandiinit, pinta-aktiivisia fosfolipidejä, lisääntynyt antioksidantit, aktiivisuuden tulehdusta yhdisteitä ja riittävä typpioksidin (NO) [6-8].
nykyisin ehkäisyyn ja hoitoon mahahaavan on saanut paljon kiinnostusta ja siitä tuli sekä tärkeä haaste kohtaaminen lääketieteen nykyään. Tähän mennessä, on olemassa muutamia lähestymistapoja käytetään estämään mahalaukun haavaumia, jotka sisältävät voimistumisen limakalvon puolustuksen yhdessä vähentäminen hapon eritystä ja sen neutralointi, stimulaatio mahan musiinia synteesin parantamiseksi antioksidantti tasot vatsassa, ja inhibitio Helicobacter pylori
kasvua [9]. Mahahapon eritystä uskotaan olevan keskeinen osatekijä mahahaavan läsnäolosta huolimatta monista aiheuttavat tekijät [7] ja siksi, mahahapon eritystä yleensä avain terapeuttinen kohde haavauma sairauksiin [10]. Toisaalta, toinen avaintekijä synnyssä mahahaavan on reaktiivisten hapen lajien (ROS). Tuotanto ROS ja samanaikaista alenemista antioksidanttien vahingoittaa olennaisten soluaineksista, jotka ovat proteiineja, lipidejä ja nukleiinihapot, jolloin muodostuu myrkyllisiä yhdisteitä ja aiheuttaa solukuoleman johtuu niiden äärimmäisen reaktiivisuus [8, 11]. Siksi ohjaamalla ROS muodostumista ja mahahapon eritystä ovat välttämättömiä hoitoon näiden patologioiden [12].
Nykyinen lääkehoito Mahahaavan ovat happo lääkkeet, jotka vähentävät hapon eritystä, protonipumpun estäjät, antibiootit hävittämiseksi Helicobacter pylori
ja kudosten limakalvon suoja-aineita, kuten sukralfaatti ja vismutti kolinergit [13, 14]. Vaikkei näitä lääkkeitä ovat vähentäneet sairastuvuutta, mutta ne ovat usein liittyy ei-toivottuja haittavaikutuksia, kuten yliherkkyyttä, impotenssi, rytmihäiriö, hematopoieettiset häiriöt, gynekomastia ja antibioottiresistenssi pitkällä aikavälillä [15, 16]. Lisäksi nämä lääkkeille on myös paljon relapseja, alhainen teho mahahaavan hoidossa ja ovat usein kalliita [5, 9, 10]. Näin ollen on suuri tarve löytää tehokkaampi ja turvallinen vaihtoehto hoitomuotoja mahahaavan. Tässä yhteydessä lääkekasvien käyttö on saavuttanut kiinnostusta ja kiinni huomiota monien tutkijoiden. Kasviuutteet voivat olla arvokkaita ja toimia uutena lähteenä terapeuttisia hoidossa mahahaavan jolloin eritystä estävää, soluja suojaavat ja antioksidantti toimintaa, eristetty tai yhdistelmänä, ovat kolme päätehtävää on gastroprotective ainetta, joka avainasemassa mahalaukun limakalvon suojelu [17].
tehdas Muntingia calabura
L. (perhe muntingiaceae), joka tunnetaan yleisesti nimellä Jamaikan kirsikka tai kerukup siam
Malesiassa, on laajalti koko lämmin alueilla Aasian alueella [18]. Useat lääkkeet käyttötavat on dokumentoitu eri osissa puu Itä- ja Kaakkois-Aasiassa sekä trooppiset Amerikassa. Muntingia calabura n
lehtiä, kukkia, haukkuu ja juuria on käytetty folk korjata päänsäryn hoitoon, kuume ja alkava kylmä. Mukaan Perun kansanperinne, lehtiä käytetään tarjoamaan helpotusta mahahaavan ja vähentää turvotusta eturauhanen [19]. Lisäksi ne käytetään myös antiseptinen, kouristuksia, ja antidyspeptic agentti [20, 21].
Toisaalta, Muntingia calabura
on raportoitu olevan monenlaisia ​​farmakologisia aktiivisuuksia, jotka ovat osoittautuneet tieteellisesti. Tämä sisältää antitumor [20, 22], antibakteerinen [23], antinosiseptio [19, 24, 25], anti-inflammatorisia, kuumetta alentavia [25], antioksidantti ja antiproliferatiivinen [26] toimintaa näytteillä lehdistä Muntingia calabura
, kun useita yhdisteitä on eristetty ja tunnistettu lehdet, juuret ja varsi kuoria Muntingia calabura
[20-22, 27, 28]. Erilaisia ​​fytokemikaaleja on havaittu lehdet Muntingia calabura
, kuten flavonoideja, saponiinit, tanniinit ja triterpeenit [29].
Edellisessä tutkimuksessa olemme raportoineet gastroprotektiivinen aktiivisuus useita fraktioita saadaan raakaa metanolia uutteen Muntingia calabura
(MEMC) jättää vapaaksi etanolin aiheuttamia mahalaukun vaurio rotilla [30]. Meidän tutkimus, olemme havainneet, että etyyliasetaatti osa merkittävästi parantaa mahahaava ja aiheuttivat tehokkaan suojan verrattuna muut jakeet. Näin ollen, esillä oleva Tutkimuksen tarkoituksena oli määrittää vaikutusmekanismia taustalla ennalta ehkäisevään vaikutukseen etyyliasetaattifraktiosta peräisin MEMC vastaan ​​mahalaukun vaurioita rotilla.
Pylorus-ligaatiolla mallia käytettiin tässä tutkimuksessa on yksi laajimmin käytetyistä malleista tutkimaan vaikutusta huumeiden mahahapon ja liman eritystä. Haavaumat kehittänyt ligoimalla mahanportin lopussa vatsan johtuvat kasvusta mahalaukun suolahappoa (HCl) eritystä ja /tai pysähtymiseen happoa, mikä auto ruoansulatusta mahalaukun limakalvon ja jakautuminen mahalaukun limakalvon [31]. Näin ollen aineet, jotka voivat lisätä liman eritystä (soluja suojaavat) ja /tai vähentää mahahapon aggressiivisten tekijöiden, kuten pepsiini ja happamat ovat tehokkaita mahalaukun limakalvoa aineet [32]. Toisaalta, etanoli aiheuttama haava malli on käyttökelpoinen tutkittaessa tehokkuutta mahdollisten lääkkeiden tai testaamiseksi aineita, jotka ovat soluja suojaavat ja /tai antioksidantti toimintaa [33].
Menetelmät
Kemikaalit
käytetyt kemikaalit tutkimuksen ovat analyyttisiä laadut ja oli laadittu juuri ennen käyttöä. Seuraavia lääkkeitä käytettiin: ranitidiinin (Sigma Aldrich, USA), absoluuttista etanolia (Fischer Scientific, USA), N-etyylimaleimidi (NEM) (Sigma-Aldrich, USA), N G-nitro-l-arginiini metyyliesterit (L-NAME) (Sigma-Aldrich, USA), karbenoksoloni (CBX) (Sigma-Aldrich, USA) ja dietyylieetteriä (Fischer Scientific, USA).
Kasviaines
Muntingia calabura
lehdet kerättiin niiden luonnollinen elinympäristö on Shah Alam, Selangor, Malesia, touko-elokuussa 2010. tehdas tunnistettiin kasvitieteilijä instituutista Bioscience (IBS), Universiti Putra Malesia (UPM), Serdang, Selangor. Tosite yksilö, SK 2466/14, on talletettu UPM IBS Laboratory of Natural Products Herbarium.
Extraction ja fraktiointi Muntingia calabura
lähtee
kuvanneet Zakaria et al. [26] ja Sufian et ai. [28] käytettiin valmistamiseksi raakauutetta Muntingia calabura
lehdet ja sen jakeet, vastaavasti. Viisisataa grammaa kypsynyt lehtiä ilmakuivataan huoneenlämpötilassa (27 ±
2 ° C) 1-2 viikon ajan ja jauhetaan hienoksi jauheeksi. Metanoli (MeOH) käytettiin liuottimena uuttamisen. Jauhe liotettiin MeOH suhteessa 01:20 (w /v) 72 tuntia. Seos suodatettiin käyttäen suodatinsuppiloon, puuvillaa ja Whatman n: o 1 suodatinpaperia. Liotuksen ja suodatus toistettiin jäännös kahdesti. Suodos kerätään jokaisen uuton yhdistettiin ja haihdutettiin pyöröhaihduttimessa 40 ° C: ssa alennetussa paineessa, jolloin saatiin metanolia, uute Muntingia calabura
(MEMC). Kuivattu Raaka uute suspendoitiin MeOH: hon ja tislattua vettä (dH 2O) vettä suhteessa 1: 2, jolloin saatiin vesipitoinen MeOH ratkaisu. Seosta pestiin peräkkäin jaettiin eri liuottimia, jotka olivat petrolieetterissä ja etyyliasetaatilla, jolloin saatiin petrolieetterillä osa (PEF), etyyliasetaatti osa (EAF). Fraktiot suodatettiin ja haihdutettiin kuiviin vakuumissa pyöröhaihduttimella. MEMC, PEF ja EAF alistettiin HPLC määrittää kiinnostuksen kohteena olevaa yhdistettä, joka voisi liittyä uutteen gastroprotektiivisen vaikutus.
Tunnistaminen ja määrän phytoconstituents läsnä EAF HPLC
menetelmä on kuvattu Zakaria et al. [34] pieniä muutoksia on sovitettu suorittamaan HPLC-analyysissä EAF. Lyhyesti, 10 mg näytettä suspendoitiin 1 ml: aan metanolia. Liuokset suodatettiin suodattimen läpi patruunan (huokoskoko 0,45 um) ennen käyttöä. Näyte analysoitiin käyttämällä HPLC-järjestelmää (Waters Delta 600 600 Controller) kanssa valodiodirividetektoria (PDA) (Waters 996). A C 18 pylväs (4,6 mm sisähalkaisija x 250 mm) pakattu 5 um läpimitaltaan hiukkasia käytettiin. Liikkuva faasi oli vettä, joka sisälsi 0,1% muurahaishappoa (A) ja asetonitriili (B). Alkuehdot oli 85% A: ta ja 15% B: n lineaarisella gradientilla saavuttaa 25% B t
= 12 min. Tämä ehto pidettiin yllä 10 min. B alennettiin takaisin 15%, ensimmäinen ehto, ja pidettiin yllä kunnes t
= 35 min. T
= 25 min, ohjelma palautetaan alkuperäiseen liuottimen koostumus. Virtausnopeus oli 1,0 ml /min, injektiotilavuus oli 10 ui ja aallonpituus olivat 280 nm galliinihapon ja 330 nm quercetin. Kolonniuunin oli asetettu 27 ° C: ssa. Kantaliuokset standardien viittaukset valmistettiin metanolissa konsentraatio 1 mg /ml. Kromatografieluaatti piikit varmistettiin vertaamalla sen retentioaika kuin viitestandardien ja vastaavilla UV-spektri. Kalibrointikäyrä galliinihapon oli Y = 29562x + 102777 (R 2 = 0,9969) ja quercetin oli Y = 43236x - 81458 (R 2 = 0,999). Kaikki kromatografia operaatiot suoritettiin ympäristön lämpötilassa ja kolmena kappaleena. HPLC-analyysi suoritettiin laboratoriossa Phytomedicine, lääkekasvien Division, Metsäntutkimuslaitos Malesian (frim), Kepong, Malesia.
UHPLC-ESI analyysi
UHPLC järjestelmä suoritettiin Dionex 3000 UHPLC järjestelmä hankitut Thermo Fisher Scientific (USA), joka koostui autosamplerista varustettu kolonniuuni, lokero lokero jäähdytin, ja binäärisen pumppu rakennettu liuottimella kaasunpoistolaite. Kromatografinen erotus suoritettiin beh C18 UHPLC pylväs, 100 mm x 2,5 um, 1,7 um (WATERS) virtausnopeudella 0,3 ml /min. Liikkuvat faasit käytettiin (A) 0,1% muurahaishappo vedessä ja (B) 0,1% muurahaishappoa asetonitriilissä. Gradientti alkoi 10%: liikkuva faasi B ja oli 20% liikkuvaa faasia B 5 min, 60% liikkuva faasi B 17,0 minuutin kuluttua, isokraattinen eluointi 90% B 3 minuuttia. Gradientti saavutti alkuehdot pidettiin 2 minuuttia koska uudelleen tasapainotusvaihe. Injektiotilavuus oli 10 ui, ja kolonnin lämpötila pidettiin 40 ° C: ssa. UHPLC järjestelmä kytkettiin lineaarista ioni-trap-Orbitrap massaspektrometri Q Exactive Thermo Fisher Scientific (U.S.A.), joka on varustettu sähkösumutus (ESI) lähde. Massa havaitseminen suoritettiin alueella 150-1500 m /z. ESI lähde oli toiminut negatiivisten ionien tilassa kohdassa seuraavat erityiset edellytykset: source jännite, 3,2 kV; tuppi kaasu, 35 mielivaltaista yksikköä; apukaasua, 15 mielivaltainen yksikkö; lakaista kaasu, 10 mielivaltainen yksikkö; ja kapillaari lämpötila, 320 ° C: ssa. Typpi (> 99,98%) työskenteli tuppi kaasu, apu- ja lakaista kaasua. Väyläohjainten ja tiedonkeruu suoritettiin Chameleon 6.8 ohjelmistojen ja Xcalibur 2,2 ohjelmisto (Thermo Fisher Scientific).
Eläimet
Kokeet suoritettiin Sprague Dawley rottia (180-200 g; 8-10 viikkoa vanhoja). Ne saatiin Animal yksikkö, Lääketieteellinen tiedekunta ja Health Sciences, UPM, Malesia. Eläimiä pidettiin polypropeenia häkeissä kanssa puulastubriketit, ruokitaan standardin pelletti- ja annettiin vapaasti vettä. Ne pidettiin huoneenlämmössä (27 ± 2 0C; 70-80% kosteus, 12 tunnin valo /pimeys sykli) eläintautien Holding Unit (UPM). Ennen kaikki määritykset, rotat paastosivat. Vakiolääkkeen ja MEMC annettiin suun kautta (p.o.) letkuruokinnalla 8% Tween 80 (10 ml /kg), kun ajoneuvo. Eläinten käyttö tässä tutkimuksessa hyväksyi Animal Care ja Käytettyjä komitea (ACUC) UPM (Hyväksyntä nro: UPM /FPSK /PADS /BR-Uuh /00474).
Määrittäminen mekanismin taustalla gastroprotektiivinen aktiivisuutta EAF
Mahaportin ligaatiolla
Method Shay et al. [35] pieniä muutoksia, jotta suoritettiin mahanportin ligaatio. Rotat jaettiin satunnaisesti 5 ryhmään, jossa on kuusi rottaa jokaisessa ryhmässä. Ryhmä-olin kontrolliryhmä annettiin 8% Tween 80 (ajoneuvo) suun kautta (po), ryhmä II oli positiivinen kontrolli annettiin ranitidiini 100 mg /kg (po), kun taas ryhmä III, -IV ja- V, rotille annettiin EAF (100, 250 ja 500 mg /kg, vastaavasti). Pylorus ligaatio suoritettiin 48 h paastolla rotille 1 h antamisen jälkeen testiyhdisteiden. Kevyessä anestesiassa indusoitiin käyttämällä ketamiini HCl: ää (100 mg /kg, lihakseen) ja ksylatsiinia HCl: llä (16 mg /kg, lihakseen), 2 cm pitkä keskilinjan vatsan aukaisu on suoritettu, alapuolella rintalastan. Mahanportin osa vatsa oli kevyesti käyttöönotetut ja huolellisesti ligatoitiin silkki sidelanka ympärille mahaportin sulkijalihaksen tiukka solmu. Pidettiin huolta, kun sitominen solmu häiriöiden välttämiseksi mahalaukun verenkiertoa. Vatsan viilto ommeltiin, iho puhdistettiin tahansa veren täplät tai verenvuotoa, ja eläinten annettiin toipua nukutuksesta.
Arviointi mahalaukun limakalvon vaurion
Eläimet tapettiin 6 h kuluttua ligaation altistumisesta dietyylieetterillä ja kohdunkaulan sijoiltaan. Mahat poistettiin, ja sisällöt valutettu pois, kerätään ja sentrifugoidaan. Vatsa avattiin suurempaa kaarta pitkin määrittää vaurion vahinkoja, kuten ovat kuvanneet Balaniin et al. [36]. Prosenttiosuus suoja laskettiin käyttäen seuraavaa kaavaa: $$ \\ mathrm {Suojaus} \\ \\ vasemmalle (\\% \\ right) = \\ frac {\\ left (\\ mathrm {U} \\ mathrm {A} \\ \\ mathrm {ohjaus} \\ \\ hbox {-} \\ \\ mathrm {U} \\ mathrm {A} \\ \\ mathrm {p} \\ mathrm {r} \\ mathrm {e} \\ hbox {-} \\ mathrm {käsitelty} \\ \\ mathrm {ryhmä} \\ oikea)} {\\ left (\\ mathrm {U} \\ mathrm {A} \\ \\ mathrm {ohjaus} \\ right)} \\ kertaa 100 \\% $$ määritys tilavuus, pH, vapaa ja kokonaishappopitoisuus mahalaukun sisällön
valutettu mahalaukun sisältö sentrifugoitiin 10 minuutin ajan 2500 rpm poistamiseksi kiinteää jätettä. Tilavuus ja pH mahanesteen mitattiin. Mahanestettä suoritettiin myös vapaan ja kokonaishappopitoisuus arvio kuvatun menetelmän mukaisesti, jonka Srivastava et al. [37]. Titraus 0,01 N NaOH metyyli oranssi reagenssilla toteutettiin kunnes liuoksen väri muuttui kellertävä, jotta voidaan määrittää vapaata happamuutta. Tilavuus emästä lisätään todettiin. Sitten kahdesta kolmeen tippaa fenolftaleiinia lisättiin liuokseen. Liuos titrattiin kunnes selvästi punaiseksi tinges näkyviin. Kokonaismäärä NaOH lisättiin todettiin. Tämä määrä vastaa kokonaishappopitoisuus. Happamuus laskettiin käyttäen seuraavaa kaavaa: $$ \\ mathrm {happamuus} = \\ frac {\\ mathrm {Volume} \\ \\ mathrm {of} \\ \\ mathrm {NaOH} \\ times \\ mathrm {normaaliuden} \\ \\ mathrm {of} \\ \\ mathrm {NaOH} \\ kertaa 100} {0,1} \\ mathrm {m} \\ mathrm {e} \\ mathrm {q} /\\ mathrm {l} $$ arviointi proteiinin
kokonaisproteiinipitoisuus mahanesteessä arvioitiin Lowry-menetelmällä, joka on sovitettu päässä Lowry et al. [38] käyttäen emäksistä kupari reagenssia ja Folin reagenssi. Kehittynyt väri luettiin 660 nm: ssä. Proteiinipitoisuus laskettiin standardikäyrästä valmistettiin naudan seerumin albumiinin ja proteiinin pitoisuus ilmaistiin mg /ml mahanestettä.
Arviointi mahalaukun seinämän limapitoisuudessa
menetelmä kuvataan Corne et al. [39] pienin muutoksin käytettiin määrittämään mahalaukun seinämän limapitoisuudessa. Vatsa avattiin suurempaa kaarta pitkin, punnittiin ja upotettiin 10 ml: aan 0,1% Alcian blue (0,16 M sakkaroosia 0,05 M natriumasetaatti, pH 5,8) 2 tuntia. Vatsa sitten huuhdeltiin kahdesti 0,25 M sakkaroosin liuokseen (15 min kukin) poistamiseksi liiallisen väriaine. Loput väriaine että kompleksin mahan limaa uutettiin 0,5 M MgCl 2. Rauhasjärjestelmää segmentti pysyi tässä liuoksessa 2 h ajoittainen sekoittaen 1 minuutin ajan 30 minuutin välein välein. Saadun sinisen uute ravistettiin sitten voimakkaasti yhtä suuren tilavuuden kanssa dietyylieetteriä, kunnes Emulsion muodostumisen. Saatu emulsio sentrifugoitiin 10 minuutin ajan 3600 rpm: ssä. Absorbanssi vesikerros luettiin 580 nm: ssä käyttäen spektrofotometriä. Pitoisuus Alcian sininen laskettiin läpi standardikäyrän ja tulokset ilmaistiin mg Alcian-sini /g märkää kudosta.
Etanoli aiheuttaman mahalaukun limakalvon vaurio L-NAME tai NEM pre-käsiteltyjen rottien
roolia endogeenisen NO: n ja osallistumista sulfhydryyli (SH) yhdisteet gastroprotektiivinen vaikutus EAF arvioitiin käyttäen menetelmää, jonka Takayama et ai. [40]. Urosrotat jaettiin 9 ryhmiin ja esikäsiteltiin (ip) ja suolaliuoksella, L-NAME (N-nitro-L-arginiini-metyyliesteri, 70 mg /kg) estäjä NO synteesi tai NEM (N-etyylimaleimidi, 10 mg /kg) SH yhdiste esto. Kolmekymmentä minuuttia sen jälkeen, kun esikäsittelyn, eläimille annettiin (p.o.) ajoneuvon (8% Tween 80), karbenoksoloni (100 mg /kg) tai EAF (500 mg /kg). Kuusikymmentä minuuttia myöhemmin, kaikki ryhmät saivat absoluuttista etanolia (5 ml /kg, p.o.) aiheuttaa mahalaukun haavaumia. Kaikki rotat tapettiin 1 h antamisen jälkeen etanolin altistuminen dietyylieetterillä ja kaula sijoiltaan. Vatsa poistettiin ja mahalaukun vaurioita määritettiin kuten edellä on kuvattu. Koska EAF osoitti annoksesta riippuvainen vaikutus ja aiheuttivat merkittävää suojaava vaikutus vastaan ​​mahalaukun limakalvon etanolin aiheuttamia mahahaavan mallissa, korkein tehokas annos (500 mg /kg), käytettiin tässä tutkimuksessa.
Biokemiallinen analyysi
Measurement superoksididismutaasin (SOD), glutationia (GSH) tason ja katalaasin (CAT) aktiivisuutta
Vatsa kudoksissa rottien esikäsitelty ajoneuvon (8% Tween 80), ranitidiini (100 mg /kg) tai EAF (100, 250 ja 500 mg /kg) ja sen jälkeen haava induktio absoluuttista etanolia 1 h käytettiin määritettäessä SOD, GSH tason ja CAT-aktiivisuutta. Mahalaukun kudos leikattiin paloiksi ja tarkka paino tallennettiin. Kudokset homogenisoitiin homogenisaattorilla käyttäen sopivia kylmää puskuria ja sitten sentrifugoitiin 10000 g: ssä 15 minuutin ajan 4 ° C: ssa. Supernatantit käytettiin määrittämään toimintaa CAT ja tasot SOD, ja GSH. Pitoisuus proteiinia supernatanteissa mitattiin Bradfordin menetelmällä [41] käyttämällä naudan seerumialbumiinia (BSA) standardina. SOD: n, GSH ja CAT määritettiin käyttäen kaupallista määritystä sarjat mukaisesti valmistajan ohjeiden, vastaavasti (superoksididismutaasi Assay Kit, Glutathione Assay Kit ja katalaasi Assay Kit, Cayman Chemical Company, Ann Arbor, MI, USA).
mittaus malonidialdehydi (MDA) tason
MDA-tasot mitattiin mahan kudoksissa saatu etanolin aiheuttamia mahahaava. Vatsa Kudos homogenoitiin ja sentrifugoitiin kuten edellä on kuvattu, ja supernatanttia käytettiin määrittämiseksi MDA käyttämällä entsyymi-immunologinen määritys kit (USCN Life Science Inc., Atlanta, GA, USA). Optiset tiheydet mitattiin 450 nm: ssä ja tulokset ilmaistiin ng /mg proteiinia.
Määrittäminen prostaglandiini E2 (PGE2) B-PGE 2-tasot määritettiin mahan kudoksissa saatu etanolin aiheuttamia mahalaukun haavauma. Supernatantti Homogenoitujen ja sentrifugoitiin vatsa kudosta käytettiin määritykseen PGE 2 käyttämällä prostaglandiini E 2 Express EIA Kit (Cayman Chemical Company, Ann Arbor, MI, USA). Optiset tiheydet mitattiin 412 nm: ssä. PGE 2 pitoisuudet normalisoitiin valkuaispitoisuuksien ja tulokset ilmaistiin pg /mg proteiinia.
Määritys NO tason
NO tason mahalaukun limakalvon arvioitiin yhteensä nitraatti /nitriitti tasot käyttäen Griessin reagenssia [42]. Lyhyesti, vatsa homogenaatteja valmistettiin 50 mM kaliumfosfaattipuskuria (pH 7,8). Homogenaatteja sentrifugoitiin 4000 rpm: llä 10 minuutin ajan 4 ° C: ssa. Viisikymmentä mikrolitraa Griessin reagenssia (0,1% N- (1-naftyyli) ethylenediamide dihydrokloridi, 1% sulfaniiliamidia 5% fosforihappoa) lisättiin 50 ui supernatanttia ja absorbanssi mitattiin 540 nm: ssä 10 minuutin kuluttua. Natriumnitriittiä käytettiin standardina tässä määrityksessä tuottaa standardikäyrän.
Tilastollinen analyysi
Tulokset ilmaistaan ​​keskiarvona ± keskivirhe keskiarvon (SEM) ja analysoitiin yksisuuntaisella varianssianalyysillä (ANOVA), jota seurasi Dunnettin post hoc
testi tai Newman-Keuls testi. Tulokset pidettiin merkittävinä, kun p <
0.
05.
Tulokset
tunnistaminen ja kvantifiointi galliinihapon ja quercetin
HPLC sormenjälkien ottaminen MEMC, PEF ja EAF paljasti läsnäolo Gallian happo at λ max 216,6-272,0 nm ja quercetin at λ max 255,5-370,6 nm (Fig. 1a ja b). Lisäystasot näiden yhdisteiden MEMC, PEF tai EAF kasvoi piikin pinta-ala, joka vastaa samaa λ max-arvo yhdisteitä. Kvantifiointia tulos esitetään taulukossa 1 osoittaa, että EAF sisältää suurimman määrän galliinihappoa (39,89 ± 0,96 mg /g uutetta) ja quercetin (9,36 ± 0,29 mg /g uutetta) ja sen jälkeen MEMC ja PEF. Kuva. 1 a ja b: HPLC-analyysi MEMC, PEF ja EAF suorittaa aallonpituudella 330 nm paljasti, että läsnä on kversetiinin on max 255,5-370,6 nm RT 3,696 min. Lisäystasot kersetiinin kanssa uutteet kasvoi piikin pinta-ala, joka vastaa samaa max arvoa yhdisteitä. c ja d: HPLC sormenjälkien ottaminen MEMC, PEF ja EAF on 280 nm: n aallonpituudella paljasti, että läsnä on gallicacid on max 216,6-272,0 nm RT 4,204 min. Lisäystasot ja gallushapon kanssa uutteet kasvoi piikin pinta-ala, joka vastaa samaa max arvo yhdisteiden
Taulukko 1 Gallushappo ja kversetiiniä n koostumus MEMC ja sen aktiiviset fraktiot (PEF ja EAF) on mg /1 g uutetta. Tulokset ilmaistaan ​​keskiarvona ± standardipoikkeamat (SDS) kolmen määrityksen
yhdisteet
MEMC
PEF
EAF
Gallushappo (mg /g) B 11,97 ± 0,27
3,40 ± 0,01
39.89 ± 0,96
Quercetin (mg /g) B 4,83 ± 0,16
8,81 ± 0,44
9,36 ± 0,29
tunnistaminen fenolisten yhdisteiden EAF
EAF analysoitiin perustuen tarkka massa datan molekyyli-ionit, jossa ionit Havaituista alustavasti määrittänyt niiden tuottamat molekyylikaava, ohjelmiston kautta tietojen analysointi (Xcalibur), jossa säädettiin listan mahdollisista alkuaine kaavat yhdessä käyttää tavallisia kun käytettävissä ja jälkeen perusteellisen selvityksen kirjallisuudessa.
laajasti hyväksytty tarkkuus kynnystä vahvistus alkuainekoostumusten vahvistettiin 5 ppm. UHPLC-ESI analyysi EAF paljasti 22 fenoliyhdisteiden (taulukko 2), jotka luetellaan piikin numero, retentioaika, havaittu m /z
, luotu molekyylikaava ja ehdotettu yhdisteen havaittu. Kuvio 2 vastaa peruspiikkiin Kromatogrammi negatiivinen ioni, jossa molekyylin rakennetta ermanin, kaempferide, pinobaksin ja pinostrobin kuvassa. 3.Table 2 fenoliset yhdisteet tunnistettu EAF by UHPLC-MS
Peak Ei
tR (min)
[MH] -
Error (ppm)

Formula
Identification
1.
0,45
169,01376
3,433
C7H5O5
Gallushappo
2.
2,34
163,03978
4,964
C9H7O3
protokatekuhappo
3.
3,10
193,05020
3,443
C10H9O4
ferulahappo-
4.
4.53
599,10547
3,879
C28H23O15
Quercitrin-2 "-O-gallate
5.
4,93
939,11377
4.220
C41H31O26
Pentagalloyl -hexoside II
6.
5,05
447,09421
4,523
C21H19O11
kaempferol-3-O
-galactoside
7.
5,31
317,0308
5.130
C15H9O8
myrisetiiniä
8.
6,20
193,08661
3,569
C10H9O4
Isoferulic happo
9.
6,91
583,11053
3,941
C28H23O14
Afzelin-O-gallate
10.
7,35
301,03586
4,023
C15H9O7
Quercetin
11.
7.42
603,07928
3,894
C30H19O14
Quercetin dimeeri
12.
7,67
255,06636
4,605 ​​
C15H11O4
Pinocembrin
13.
8.14
593,13116
3,697
C30H25O13
kaempferol-3-O
glukosidi
14.
8,18
315,05196
6,478
C16H11O7
Rhamnetin
15.
8,55
271,06094
3,099
C15H12O5
Pinobaksin
16.
8,94
285,04037
3,528
C15H9O6
kaempferol
17.
10,80
253,05063
4,326
C15H9O4
Chyrsin I
18.
11,67
253,05099
5.749
C15H9O4
Chyrsin II
19.
11,91
299,05597
3,195
C16H11O6
Kaempferide
20.
12,56
313,07245
5.703
C17H13O6
Ermanin I
21
12,78
313,07230
5.224
C17H13O6
Ermanin II
22.
13,32
269,08194
4,105
Kuva. Kuva. Kaikki kirjoittajat luettu ja hyväksytty lopullinen käsikirjoitus.

• Nikotiinin vaikutuksia mahalaukun myoelectrical aktiivisuus ICR
• Kliinis merkitys klaudiini-4 in mahakarsinoo-