Meccanismo (s) dell'azione sottostante l'effetto gastroprotettivo della frazione acetato di etile ottenuto dalla metanolica greggio foglie estratto di Muntingia calabura

Meccanismo (s) di azione alla base dell'effetto gastroprotettori della frazione di acetato di etile ottenuto dal metanolo greggio estratto di foglie di Muntingia calabura
astratta
sfondo
Muntingia calabura
L. (famiglia Muntingiaceae), comunemente noto come ciliegia giamaicano o kerukup Siam
in Malesia, è usato tradizionalmente per il trattamento di vari disturbi. Lo scopo di questo studio è quello di chiarire i possibili meccanismi sottostanti gastroprotettori della frazione acetato di etile (EAF) di Muntingia calabura
metanolica foglie estratto (MEMC).
Metodi
MEMC e sue frazioni sono stati sottoposti ad analisi HPLC a identificare e quantificare la presenza dei suoi fito-costituenti. Il meccanismo di gastroptotection di EAF è stato ulteriormente studiato usando piloro modello legatura indotta lesione gastrica di ratto (100, 250, e 500 mg /kg). analisi macroscopica dello stomaco, valutazione dei parametri contenuti gastrici quali volume, pH, acidità libera e totale, la stima di proteine, e la quantificazione di muco sono state effettuate. La partecipazione di ossido nitrico (NO) e composti (SH) sulfidrilici è stata valutata ed il superossido dismutasi (SOD), gluthathione (GSH), catalasi (CAT), malondialdeide (MDA), prostaglandina E 2 (PGE 2) e NO livello nel etanolo indotta omogeneizzato tessuto dello stomaco è stata determinata.
Risultati
analisi HPLC confermato la presenza di quercetina e acido gallico in EAF. Nel modello di piloro-legatura, EAF significativamente (p
< 0,001) prevenire la formazione della lesione gastrica. Volume di contenuto gastrico e proteine ​​totali ridotta significativamente (p
< 0,01 e p
< 0,05 rispettivamente), mentre acidità libera e totale ridotto nelle dosi di 250 e 500 mg /kg (p
< 0,001 ep
< 0,05 rispettivamente). EAF anche aumentato il contenuto di muco in modo significativo (p
< 0,001). Il pre-trattamento con N-nitro-L-arginina metil estere (L-NAME) o N-etilmaleimmide (NEM) ha invertito l'attività gastroprotettiva di EAF. trattamento EAF marcatamente migliorato la SOD, GSH e l'attività CAT e PGE 2 e NO livello, mentre attenuando livello MDA, rispetto al gruppo di veicoli
. Conclusioni
In conclusione, i meccanismi sottostanti gastroprotettori di EAF potrebbero essere associate con il antisecretorio, la partecipazione di muco, antiperoxidative, il miglioramento dello stato antiossidante, la modulazione di composti NO e SH, la stimolazione della PGE 2, così come la presenza di quercetina e acido gallico.
Parole
Muntingia calabura
Frazione ossido di ulcera gastrica antisecretori Antiossidante nitrico sulfidrilici composto prostaglandina quercetina gallico sfondo acido
ulcera gastrica è uno dei principali disturbi gastrointestinali che colpiscono numero considerevole di persone in tutto il mondo, durante la crescita in presenza e diffusione a livello mondiale [1]. Alcuni autori riferiscono alle ulcere gastriche come il nuovo "peste" del 21 [2] secolo. E 'stato previsto che 14,5 milioni della popolazione in tutto il mondo sono affetti da ulcere gastriche, con un tasso di mortalità di 4,08 milioni [3]. La fisiopatologia dell'ulcera gastrica è associata con lo squilibrio tra fattori aggressivi e protettivi nello stomaco. Gastrico danno della mucosa si verifica quando fattori nocivi "sopraffare" una difesa della mucosa intatta, o l'indebolimento dei meccanismi di difesa della mucosa [4]. I fattori nocivi, in questo contesto includono l'ingestione di alcol, la secrezione di acido e pepsina, la cattiva alimentazione, stress, specie reattive dell'ossigeno (ROS), l'uso di farmaci non steroidei anti-infiammatori (FANS) e Helicobacter pylori
infezione [5, 6]. D'altra parte, i fattori chiave della difesa e meccanismi che offrono difesa mucosale includono sufficiente secrezione di muco e il flusso ematico della mucosa, la secrezione di bicarbonato barriera muco intatta, prostaglandine, superficie fosfolipidi attivi, aumento dei livelli di antiossidanti, l'attività di composti anti-infiammatori e adeguata livelli di ossido nitrico (NO) [6-8].
Attualmente, la prevenzione e il trattamento delle ulcere gastriche ha guadagnato un sacco di interesse ed è diventato e sfida importante affrontare la medicina al giorno d'oggi. Ad oggi, ci sono un paio di approcci utilizzati per prevenire ulcere gastriche, che comprendono il potenziamento della difesa della mucosa insieme con la riduzione della secrezione acida e della sua neutralizzazione, la stimolazione della sintesi mucina gastrica, aumento dei livelli di antiossidanti nello stomaco, e l'inibizione di Helicobacter pylori
crescita [9]. La secrezione di acido gastrico è ritenuta essere il componente centrale di ulcere gastriche nonostante la presenza di molti fattori causali [7] e quindi, l'inibizione della secrezione acida gastrica tendono ad essere il bersaglio terapeutico chiave per le malattie ulcera [10]. D'altra parte, un altro fattore chiave nella patogenesi delle ulcere gastriche è la produzione di specie reattive dell'ossigeno (ROS). La produzione di ROS ed una concomitante riduzione della capacità antiossidante provoca danni ai costituenti cellulari essenziali, che sono proteine, lipidi e acidi nucleici, con conseguente formazione di composti tossici e provoca la morte cellulare a causa della loro estrema reattività [8, 11]. Pertanto, il controllo della formazione di ROS e la secrezione acida gastrica sono essenziali per il trattamento di queste patologie [12].
L'attuale trattamento medico delle ulcere gastriche includono bloccanti degli acidi che riducono la secrezione acida, inibitori della pompa protonica, antibiotici per sradicare Helicobacter pylori
e fodera di tessuto proteggere agenti come sucralfato e colinergici bismuto [13, 14]. Benche 'questi farmaci sono diminuiti i tassi di morbilità, ma sono spesso associati ad effetti avversi indesiderati, come l'ipersensibilità, l'impotenza, aritmia, disturbi ematopoietici, ginecomastia e la resistenza agli antibiotici nel lungo periodo [15, 16]. Inoltre, questi farmaci disponibili hanno anche elevato tasso di recidiva, scarsa efficacia nel trattamento di ulcere gastriche e sono spesso costosi [5, 9, 10]. Quindi, vi è un urgente bisogno di scoprire un più efficaci e sicuri terapie alternative per il trattamento di ulcere gastriche. In questo contesto, l'uso di piante medicinali ha guadagnato interesse e catturato l'attenzione di molti ricercatori. Estratti vegetali possono essere utili e servire come una nuova fonte di terapie per il trattamento di ulcere gastriche cui antisecretorio, attività citoprotettivi ed antiossidanti, isolati o in combinazione, sono le tre funzioni principali di un agente gastroprotettivi, che svolgono un ruolo chiave nella mucosa gastrica protezione [17].
L'impianto Muntingia calabura
L. (famiglia Muntingiaceae), comunemente noto come ciliegia giamaicano o kerukup Siam
in Malesia, è ampiamente distribuita in tutte le aree calde della regione asiatica [18]. Diversi usi medicinali sono stati documentati su varie parti di questo albero in Oriente e Sud-Est asiatico e l'America tropicale. di Muntingia calabura
foglie, fiori, cortecce e radici sono stati utilizzati come un rimedio popolare per il trattamento di mal di testa, febbre e freddo incipiente. Secondo il folklore peruviano, le foglie sono utilizzati per fornire sollievo da ulcere gastriche e per ridurre il gonfiore della ghiandola prostatica [19]. Inoltre, sono anche impiegati come agente antisettico, antispasmodico, e antidyspeptic [20, 21].
D'altra parte, Muntingia calabura
è segnalato per avere una vasta gamma di attività farmacologiche, che sono stati dimostrati scientificamente. Questo include antitumorale [20, 22], antibatterico [23], antinocicezione [19, 24, 25], anti-infiammatori, antipiretici [25], antiossidanti e anti-proliferativi [26] attività esposte dalle foglie di Muntingia calabura
, mentre diversi tipi di composti sono stati isolati e identificati dalle foglie, radici e gambo cortecce di Muntingia calabura
[20-22, 27, 28]. Diverse sostanze fitochimiche sono stati rilevati nelle foglie di Muntingia calabura
come i flavonoidi, saponine, tannini e triterpeni [29].
Nel nostro studio precedente, abbiamo riportato l'attività gastroprotettiva di diverse frazioni ottenute da greggio estratto metanolo di Muntingia calabura
(MEMC) lascia contro etanolo-indotta lesione gastrica nel ratto [30]. Dal nostro studio, abbiamo trovato quella frazione acetato di etile marcatamente ameliorate ulcera gastrica e esercitato la protezione più efficace rispetto alle altre frazioni. Pertanto, il presente studio aveva lo scopo di determinare il meccanismo di azione sottostante l'effetto profilattico della frazione acetato di etile derivata da MEMC contro le lesioni gastriche in ratti.
Modello piloro-legatura utilizzato in questo studio è uno dei modelli più diffusi per studiare l'effetto dei farmaci sulla acido gastrico e secrezione di muco. Ulcere sviluppati legando l'estremità pilorica dello stomaco sono causate da aumento della secrezione gastrica e /o la stasi di acido cloridrico (HCl), portando ad auto digestione della mucosa gastrica e la rottura della barriera mucosa gastrica [31]. Pertanto, agenti che sono in grado di aumentare la secrezione di muco (citoprotettivo) e /o ridurre la secrezione di fattori aggressivi gastrici come pepsina ed acido sono gastroprotettivi efficaci [32]. D'altra parte, il modello di ulcera etanolo-indotta è utile per studiare l'efficacia di potenziali farmaci o testare gli agenti che hanno /o le attività citoprotettive e antiossidanti [33].
Metodi
chimiche
I prodotti chimici utilizzati in questo studio sono di gradi analitici ed era stata preparata immediatamente prima dell'uso. I seguenti farmaci sono stati utilizzati: ranitidina (Sigma Aldrich, Stati Uniti d'America), etanolo assoluto (Fischer Scientific, Stati Uniti d'America), N-etilmaleimmide (NEM) (Sigma-Aldrich, Stati Uniti d'America), N G-nitro-L-arginina esteri metilici (L-NAME) (Sigma-Aldrich, stati Uniti d'America), carbenoxolone (CBX) (Sigma-Aldrich, USA) ed etere etilico (Fischer Scientific, USA). materiale
impianto
Muntingia calabura
foglie sono state raccolte dal loro habitat naturale a Shah Alam, Selangor, Malesia, tra maggio e agosto 2010. l'impianto è stato identificato da un botanico presso l'Institute of Bioscience (IBS), Universiti Putra Malaysia (UPM), Serdang, Selangor. Un campione di voucher, SK 2466/14, sono stati depositati presso la UPM IBS Laboratorio di prodotti naturali Herbarium.
Estrazione e frazionamento di Muntingia calabura
lascia
metodo descritto da Zakaria et al. [26] e Sufian et al. [28] è stato impiegato per preparare l'estratto grezzo di Muntingia calabura
foglie e sue frazioni, rispettivamente. Cinquecento grammi di foglie maturate sono state aria essiccata a temperatura ambiente (27 ±
2 ° C) per 1-2 settimane e macinati in polvere fine. Metanolo (MeOH) è stato utilizzato come solvente per l'estrazione. La polvere era imbevuto di MeOH al rapporto 1:20 (w /v) per 72 h. La miscela è stata filtrata con imbuto filtrante, cotone e Whatman carta da filtro No. 1. La macerazione e filtrazione sono state ripetute sul residuo per due volte. Il filtrato raccolto da ciascun estrazione sia riunito ed evaporata in evaporatore rotante a 40 ° C sotto pressione ridotta per ottenere estratto metanolico di Muntingia calabura
(MEMC). L'estratto grezzo essiccato è stato sospeso in MeOH e acqua distillata (DH 2O) acqua in rapporto di 1: 2 di permettersi una soluzione acquosa MeOH. La miscela è stata sequenzialmente partizionato con differenti solventi, che erano etere di petrolio e acetato di etile, ottenendo petrolio frazione etere (PEF), frazione etilacetato (EAF). Le frazioni sono state filtrate ed evaporate a secchezza sotto vuoto usando evaporatore rotante. MEMC, PEF e EAF sono stati sottoposti a HPLC per quantificare il composto di interesse, che può essere associata con effetto gastroprotettivo del estratto.
Identificazione e quantificazione di phytoconstituents presenti in EAF mediante HPLC
metodo descritto da Zakaria et al. [34] con lievi modifiche è stato adattato per effettuare l'analisi HPLC del EAF. Brevemente, 10 mg di campione è stato sospeso in 1 ml di metanolo. Le soluzioni sono state filtrate attraverso una cartuccia filtrante (dimensione dei pori di 0,45 micron) prima dell'uso. Il campione è stato analizzato utilizzando un sistema HPLC (Waters Delta 600 con 600 Controller) con rivelatore a serie di fotodiodi (PDA) (Waters 996). Un C 18 colonne (4,6 millimetri di diametro interno × 250 mm), imballata con 5 micron di diametro delle particelle è stato utilizzato. La fase mobile era acqua contenente acido formico 0,1% (A) e acetonitrile (B). Condizioni iniziali erano 85% A e B del 15% con un gradiente lineare di raggiungere il 25% B al tempo t =
12 min. Questa condizione è stata mantenuta per 10 min. B è stato ridotto torna al 15%, la condizione iniziale, ed è stato mantenuto fino t
= 35 min. A t =
25 min, il programma restituito alla composizione del solvente iniziale. Il flusso era di 1,0 ml /min, volume di iniezione era di 10 microlitri e la lunghezza d'onda erano 280 nm per l'acido gallico e 330 nm per quercetina. Il forno colonna è stata fissata a 27 ° C. Le soluzioni madre di standard di riferimento sono stati preparati in metanolo in concentrazione 1 mg /ml. I picchi cromatografici sono stati confermati confrontando suo tempo di ritenzione con quelli degli standard di riferimento e dalla rispettiva spettri UV. Curva di calibrazione per l'acido gallico era Y = 29562x + 102777 (R 2 = 0,9969) e la quercetina è Y = 43236x - 81.458 (R 2 = 0,999). Tutte le operazioni cromatografiche sono state effettuate a temperatura ambiente e in triplicato. L'analisi HPLC è stata condotta presso il Laboratorio di fitomedicina, piante medicinali Division, Forest Research Institute of Malaysia (FRIM), Kepong, Malesia.
Analisi UHPLC-ESI
Il sistema UHPLC è stata effettuata su un Dionex 3000 sistema UHPLC acquisito da Thermo Fisher Scientific (USA) che consisteva di un autocampionatore dotato di un forno a colonna, un dispositivo di raffreddamento dello scomparto del vassoio, e una pompa binaria con costruito nel degasatore. La separazione cromatografica è stata eseguita su una colonna BEH C18 UHPLC 100 mm x 2,5 micron, 1,7 micron (Waters) ad un flusso di 0,3 mL /min. Le fasi mobili utilizzati erano (A) 0,1% di acido formico in acqua e (B) 0,1% di acido formico in acetonitrile. Il gradiente è iniziato con il 10% fase mobile B, raggiungendo il 20% fase mobile B a 5 min, 60% fase mobile B a 17,0 min, a eluizione isocratica del 90% B per 3 min. Il gradiente ha raggiunto le condizioni iniziali sono stati tenuti per 2 minuti come un passo riequilibrio. Il volume di iniezione era di 10 microlitri e la temperatura della colonna è stata mantenuta a 40 ° C. Il sistema UHPLC è stato accoppiato ad uno spettrometro di massa di ioni-trap-Orbitrap lineare Q Exactive da Thermo Fisher Scientific (U.S.A) dotato di una sorgente di ionizzazione elettrospray (ESI). La rilevazione di masse è stata effettuata in un intervallo di 150-1500 m /z. La sorgente ESI è stato operato in modalità negativa alle seguenti condizioni specifiche: tensione di sorgente, 3,2 kV; gas guaina, 35 unità arbitrarie; gas ausiliario, 15 unità arbitrarie; spazzare il gas, 10 unità arbitrarie; e la temperatura capillare, 320 ° C. Azoto (> 99,98%) è stato impiegato come gas guaina, ausiliario e spazzare gas. controllo dello strumento e acquisizione dati sono stati eseguiti con il software Chameleon 6.8 e il software Xcalibur 2.2 (Thermo Fisher Scientific)
Animali
Gli esperimenti sono stati eseguiti su ratti maschi Sprague Dawley. (180-200 g; 8-10 settimane). Essi sono stati ottenuti dall'unità di animali, Facoltà di Medicina e Scienze della Salute, UPM, Malesia. Gli animali sono stati tenuti in gabbie in polipropilene con Truciolo, alimentati con pellet di serie e ha permesso il libero accesso all'acqua. Sono stati tenuti in temperatura ambiente (27 ± 2 0 ° C; 70-80% di umidità; 12 h luce /buio ciclo) nella holding Unità animali (UPM). Prima di tutti i saggi, i ratti sono stati tenuti a digiuno. farmaci standard e MEMC sono stati somministrati per via orale (per via orale) mediante sonda gastrica con 8% Tween 80 (10 ml /kg) del veicolo. L'uso di animali in questo studio è stato approvato dalla cura degli animali e del Comitato Usato (ACUC) di UPM (N. di omologazione: UPM /FPSK /pad /BR-UUH /00474)
Determinazione del meccanismo alla base l'attività gastroprotettiva di. EAF
legatura pilorica
Metodo da Shay et al. [35] con lievi modifiche è stato impiegato per eseguire la legatura del piloro. I ratti sono stati divisi casualmente in 5 gruppi, con sei topi in ciascun gruppo. Gruppo-I è stato il gruppo di controllo somministrato con l'8% di Tween 80 (veicolo) per via orale (po), Gruppo-II è stato il controllo positivo somministrato con ranitidina a 100 mg /kg (PO), mentre per il gruppo-III, -IV e- V, i ratti sono stati somministrati con EAF (100, 250 e 500 mg /kg, rispettivamente). Piloro legatura è stata eseguita su 48 ore di digiuno ratti 1 h dopo la somministrazione dei composti in esame. Sotto anestesia luce indotta usando ketamina HCl (100 mg /kg, intramuscolare) e xilazina HCl (16 mg /kg, intramuscolare), una incisione addominale 2 cm linea mediana è stata eseguita, appena sotto lo sterno. La porzione pilorica dello stomaco era delicatamente mobilitata e con attenzione legatura con una legatura di seta intorno lo sfintere pilorico in un nodo stretto. Cura è stata presa mentre sposarsi per evitare interferenze con apporto di sangue gastrica. L'incisione addominale è stata suturata, la pelle è stata pulita di eventuali macchie di sangue o emorragie e gli animali sono stati autorizzati a recuperare da anestesia.
Valutazione della lesione gastrica mucosa
Gli animali sono stati sacrificati 6 ore dopo la legatura da esposizione a etere etilico e dislocazione cervicale. Gli stomaci sono stati rimossi, e il contenuto sono stati drenati fuori, raccolti e centrifugati. Lo stomaco è stato aperto lungo la grande curvatura per determinare il danno lesione come descritto da Balan et al. [36]. La protezione percentuale è stata calcolata utilizzando la seguente formula: $$ \\ mathrm {Protezione} \\ \\ left (\\% \\ right) = \\ frac {\\ left (\\ mathrm {U} \\ mathrm {A} \\ \\ mathrm {} di controllo \\ \\ hbox {-} \\ \\ mathrm {U} \\ mathrm {A} \\ \\ mathrm {p} \\ mathrm {r} \\ mathrm {e} \\ hbox {-} \\ mathrm {trattati} \\ \\ mathrm {gruppo} \\ a destra)} {\\ left (\\ mathrm {U} \\ mathrm {A} \\ \\ mathrm {controllo} \\ right)} \\ volte al 100 \\% $$ Determinazione del volume, il pH, la connessione e l'acidità totale di
contenuto gastrico Il contenuto gastrico drenato stato centrifugato per 10 min a 2500 rpm per rimuovere eventuali residui solidi. Il volume e pH del succo gastrico è stata misurata. Il succo gastrico è stato anche sottoposto alla stima acidità libera e totale secondo il metodo descritto da Srivastava et al. [37]. Titolazione con NaOH 0,01 N con il reagente metilarancio stata effettuata finché il colore della soluzione diventa giallastra per determinare l'acidità libera. La quantità di alcali aggiunto è stato osservato. Poi, due o tre gocce di fenolftaleina è stato aggiunto alla soluzione. La soluzione è stata titolata fino a quando appaiono riflessi rossi definiti. Il volume totale di NaOH aggiunto è stato osservato. Questo volume corrisponde ad acidità totale. L'acidità è stato calcolato con la seguente formula: $$ \\ mathrm {Acidità} = \\ frac {\\ mathrm {volume} \\ \\ mathrm {} di \\ \\ mathrm {NaOH} \\ times \\ mathrm {normalità} \\ \\ mathrm {} di \\ \\ mathrm {NaOH} \\ times 100} {0,1} \\ mathrm {m} \\ mathrm {e} \\ mathrm {q} /\\ mathrm {l} $$ stima di proteine ​​
Il contenuto totale di proteine ​​nel succo gastrico è stato stimato con il metodo di Lowry, adattato da Lowry et al. [38] con il reagente di rame alcalino e reattivo di Folin. Il colore sviluppato è stata letta a 660 nm. Il contenuto proteico è stata calcolata dalla curva standard preparata con concentrazione di albumina sierica e proteine ​​bovine è stata espressa come mg /ml di succo gastrico.
Stima del gastrica parete muco contenuto
metodo descritto da Corne et al. [39] con lievi modifiche è stato impiegato per determinare il contenuto parete muco gastrico. Lo stomaco è stato aperto lungo la grande curvatura, pesato, ed immerso in 10 ml di blu 0,1% Alcian (0.16 M saccarosio 0,05 M acetato di sodio, pH 5,8) per 2 ore. Lo stomaco è stato poi risciacquato due volte in 0,25 M soluzione di saccarosio (15 min ciascuna) per rimuovere il colorante in eccesso. Il restante colorante che complessato con il muco gastrico è stata estratta con 0,5 M MgCl 2. Il segmento ghiandolare rimasto in questa soluzione per 2 ore con agitazione intermittente per 1 min in ogni intervallo di 30 min. L'estratto blu risultante è stata poi agitata vigorosamente con un volume uguale di etere etilico fino alla formazione di una emulsione. L'emulsione ottenuta è stata centrifugata per 10 min a 3600 rpm. L'assorbanza dello strato acquoso è stata letta a 580 nm utilizzando uno spettrofotometro. La concentrazione di blu Alcian è stato calcolato attraverso una curva standard ed i risultati sono stati espressi in mg di Alcian blu /g di tessuto bagnato.
Etanolo-indotta gastrica lesione della mucosa a L-NAME o NEM pre-trattati ratti
Il ruolo endogena NO e il coinvolgimento di sulfidrilici (SH) composti nella effetto gastroprotettivo di EAF state valutate usando il metodo descritto da Takayama et al. [40]. I ratti maschi sono stati divisi in 9 gruppi e pretrattati (ip) con soluzione salina, L-NAME (N-nitro-L-arginina metilestere, 70 mg /kg) un inibitore della sintesi di NO o NEM (N-etilmaleimmide, 10 mg /kg) un composto bloccante SH. Trenta minuti dopo il pre-trattamento, gli animali sono stati somministrati (per via orale) veicolo (8% Tween 80), carbenoxolone (100 mg /kg) o EAF (500 mg /Kg). Sessanta minuti dopo, tutte le ricevute etanolo assoluto (5 ml /kg, p.o) per indurre ulcere gastriche. Tutti i ratti sono stati sacrificati dopo 1 ora dalla somministrazione di etanolo mediante esposizione a etere etilico e dislocazione cervicale. Lo stomaco è stato rimosso e danno gastrico è stata determinata come descritto sopra. Poiché EAF esibito un effetto dose-dipendente e esercitata notevole azione protettiva contro mucosa gastrica nel modello ulcera gastrica indotta etanolo, la dose efficace più alta (500 mg /kg) è stata utilizzata per questo studio.
Analisi biochimiche misurazione di superossido dismutasi (SOD), livello di glutatione (GSH) e catalasi (CAT) L'attività
tessuti dello stomaco dei ratti pre-trattati con veicolo (8% Tween 80), ranitidina (100 mg /kg) o EAF (100, 250 e 500 mg /kg) seguita da induzione ulcera utilizzando etanolo assoluto per 1 h sono stati utilizzati per la determinazione di SOD, GSH livello e l'attività CAT. tessuto gastrico è stato tagliato a pezzi ed è stato registrato il peso esatto. I tessuti sono stati omogeneizzati con un omogeneizzatore utilizzando un'adeguata tampone a freddo e poi sono stati centrifugati a 10000 g per 15 min a 4 ° C. I supernatanti sono stati usati per determinare le attività di CAT e livelli di SOD e GSH. La concentrazione delle proteine ​​nei surnatanti è stata misurata mediante il metodo Bradford [41] utilizzando albumina di siero bovino (BSA) come standard. I livelli di SOD, GSH e CAT sono stati determinati utilizzando i kit di analisi commerciali in base alle istruzioni del produttore, rispettivamente (superossido dismutasi Assay Kit, kit di glutatione Assay e catalasi Assay Kit, Cayman Chemical Company, Ann Arbor, MI, USA).
Misurazione di malondialdeide livello (MDA)
livelli di MDA sono stati misurati nei tessuti dello stomaco ottenuti dalla ulcera gastrica etanolo-indotta. Il tessuto dello stomaco è stato omogeneizzato e centrifugato come descritto in precedenza e il surnatante è stato utilizzato per la determinazione della MDA utilizzando un kit di test di immunoassorbimento enzimatico (USCN Life Science Inc., Atlanta, GA, USA). Le densità ottiche sono state misurate a 450 nm ed i risultati sono stati espressi come ng /mg di proteina.
Determinazione della prostaglandina E2 (PGE2)
PGE 2 livelli sono stati determinati nei tessuti dello stomaco ottenuti dalla gastrica indotta etanolo ulcera. Il surnatante di tessuto dello stomaco omogeneizzato e centrifugato è stato utilizzato per la determinazione del PGE 2 utilizzando prostaglandina E 2 Kit espresso EIA (Cayman Chemical Company, Ann Arbor, MI, USA). Le densità ottiche sono state misurate a 412 nm. PGE 2 concentrazioni sono stati normalizzati per il contenuto di proteine ​​ed i risultati sono stati espressi come pg /mg di proteina.
Determinazione NO livello
NO livello nella mucosa gastrica è stata valutata come livelli totali di nitrato /nitriti utilizzando Griess reattivo [42]. In breve, gli omogeneizzati di stomaco è stato redatto in 50 mM tampone fosfato di potassio (pH 7,8). Gli omogenati sono stati centrifugati a 4000 rpm per 10 minuti a 4 ° C. Cinquanta microlitri di Griess reattivo (0,1% N- (1-naftil) ethylenediamide dicloridrato, 1% sulfanilamide in acido fosforico 5%) è stato aggiunto a 50 microlitri surnatante e l'assorbanza è stata misurata a 540 nm dopo 10 min. Il nitrito di sodio è stato utilizzato come standard in questo saggio per generare la curva standard.
Analisi statistica
I risultati sono stati espressi come media ± errore standard medio (SEM) e analizzati utilizzando analisi della varianza ad una via (ANOVA), seguita per post hoc
test di Dunnett o il test di Newman-Keuls. I risultati sono stati considerati significativi quando p <
0.
05.
Risultati
identificazione e la quantificazione di acido gallico e quercetina
HPLC impronte digitali di MEMC, PEF e EAF rivelato la presenza del gallico L'acido a λ max 216,6-272,0 nm e quercetina a λ max 255,5-370,6 nm (Fig. 1a e B). Spiking di questi composti in MEMC, PEF o EAF aumentata l'area del picco corrispondente allo stesso λ valore massimo dei composti. Il risultato quantificazione presentato nella tabella 1 mostra che EAF contiene la più alta quantità di acido gallico (39.89 ± 0.96 mg /g di estratto) e quercetina (9,36 ± 0,29 mg /g di estratto), seguita da MEMC e PEF. Figura. 1 ae b: Analisi HPLC di MEMC, PEF e EAF effettuata alla lunghezza d'onda 330 nm rivelato la presenza della quercetina in λmax 255,5-370,6 nm a RT 3.696 min. Spiking di quercetina con estratti aumentata l'area del picco corrispondente allo stesso valore λmax dei composti. ced: HPLC fingerprinting di MEMC, PEF e EAF alla lunghezza d'onda 280 nm rivelato la presenza del gallicacid a λmax 216,6-272,0 nm a RT 4.204 min. Spiking di acido gallico con gli estratti aumentata l'area del picco corrispondente allo stesso valore λmax dei composti
Table 1 acido e la composizione di quercetina in MEMC e sue frazioni attive (PEF e EAF) in mg /1 g di estratto gallico. I risultati sono espressi come media ± deviazione standard (SDS) di tre determinazioni
Composti
MEMC
PEF
EAF
acido gallico (mg /g)
11.97 ± 0.27
3,40 ± 0,01
39.89 ± 0.96
quercetina (mg /g)
4.83 ± 0.16
8.81 ± 0.44
9.36 ± 0.29
Identificazione di composti fenolici in EAF EAF
stata analizzata sulla base dei dati massa accurata degli ioni molecolari, in cui ioni rilevati sono stati provvisoriamente identificato dal loro formula molecolare generato, attraverso l'analisi software Data (Xcalibur) che ha fornito elenco di possibili elementale formule, unitamente all'utilizzo di standard quando disponibili e dopo un'analisi approfondita della letteratura.
la soglia accuratezza ampiamente accettato per stato stabilito conferma composizioni elementari a 5 ppm. L'analisi UHPLC-ESI della EAF rivelato la presenza di 22 composti fenolici (Tabella 2) che elencano il numero di picco, tempo di ritenzione, ha osservato m /z
, la formula molecolare generato e il composto proposto rilevato. Figura 2 corrisponde al cromatogramma base del picco in ioni negativi, con la struttura molecola di ermanin, kaempferide, pinobaksin e pinostrobin in Fig. 3.Table 2 composti fenolici identificati nel EAF da UHPLC-MS
Peak No
TR (min)
[MH] -
Error (ppm)

Formula
Identificazione
1.
0.45
169,01,376 mila
3.433
C7H5O5
acido gallico
2.
2.34
163,03,978 mila
4.964
C9H7O3
protocatechuic acido
3.
3.10
193,05 mila venti
3.443
C10H9O4
acido ferulico
4.
4.53
599,10,547 mila
3.879
C28H23O15
quercitrina-2 "-O-gallato
5.
4,93
939,11,377 mila
4.220
C41H31O26
Pentagalloyl -hexoside II
6.
5.05
447,09,421 mila
4.523
C21H19O11
Kaempferol-3-O
-galactoside
7.
5.31
317,0308
5.130
C15H9O8
miricetina
8.
6,20
193,08,661 mila
3.569
C10H9O4
Isoferulic acido
9.
6.91
583,11,053 mila
3.941
C28H23O14
Afzelin-O-gallato
10.
7,35
301,03,586 mila
4.023
C15H9O7
quercetina
11.
7.42
603,07,928 mila
3.894
C30H19O14
quercetina dimero
12.
7.67
255,06,636 mila
4.605
C15H11O4
pinocembrina
13.
8.14
593,13,116 mila
3,697
C30H25O13
Kaempferol-3-O
-glucoside
14.
8.18
315,05,196 mila
6,478
C16H11O7
Rhamnetin
15.
8.55
271,06,094 mila
3.099
C15H12O5
Pinobaksin
16.
8.94
285,04,037 mila
3.528
C15H9O6
Kaempferol
17.
10.80
253,05,063 mila
4.326
C15H9O4
Chyrsin I
18.
11.67
253,05,099 mila
5.749
C15H9O4
Chyrsin II
19.
11.91
299,05,597 mila
3.195
C16H11O6
Kaempferide
20.
12.56
313,07,245 mila
5.703
C17H13O6
Ermanin I
21
12.78
313,07,23 mila
5.224
C17H13O6
Ermanin II
22.
13.32
269,08,194 mila
4.105
C16H13O4
Pinostrobin
Fig. Figura. Figura. Tutti gli autori hanno letto e approvato il manoscritto finale.

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