effetti anti-infiammatori, gastroprotettivi e anti-ulcerose di alghe rosse Gracilaria changii (Gracilariales, Rhodophyta) estrarre

effetti anti-infiammatori, gastroprotettivi e anti-ulcerose di alghe rosse Gracilaria changii
(Gracilariales, Rhodophyta) estrarre
Abstract
sfondo
Gracilaria changii
(Xia et Abbott) Abbott, Zhang et Xia , un alghe rosse che si trovano comunemente nelle zone costiere della Malaysia è tradizionalmente utilizzato per gli alimenti e per il trattamento di vari disturbi, tra cui l'infiammazione e disturbi gastrici. Lo scopo dello studio è stato quello di indagare anti-infiammatori, gastroprotettivi e anti-ulcerogeno attività di spettrometria di massa standardizzato estratto metanolico di Gracilaria
changii.
Metodi
estratto metanolica di Gracilaria changii
(estratto MeOHGCM6 ) è stata preparata e standardizzato usando la spettrometria di massa (MS). Attività anti-infiammatori di estratto MeOHGCM6 sono stati esaminati trattando U937 cellule durante la sua differenziazione con 10 mg di estratto MeOHGCM6 /ml. fattori-α (TNF-α) livello di risposta e TNF-α e interleuchina-6 (IL-6) genica necrosi tumorale sono stati monitorati e confrontati con quelli trattati con 10 nM betametasone, un farmaco anti-infiammatorio. attività gastroprotettiva e anti-ulcerose di estratto MeOHGCM6 stati esaminati alimentando ratti con estratto MeOHGCM6 da 2,5 a 500 mg /kg di peso corporeo (b.w.) dopo induzione di lesioni gastriche. Produzione di muco e succo gastrico, pH del succo e non proteici sulfidrili gastrici (NP-SH) livelli sono stati determinati e paragonata a quella alimentata da 20 mg /kg b.w. omeprazolo (OMP), un noto farmaco anti-ulcera.
Risultati
analisi MS /MS degli estratti MeOHGCM6 rivelato la presenza di metil-10 hydroxyphaeophorbide un
e 10-hydroxypheophytin un
, nota clorofilla proteine ​​e diverse molecole non identificati. Il trattamento con 10 mg di estratto MeOHGCM6 /ml durante il differenziamento delle cellule U937 inibito significativamente il livello di risposta TNF-α e TNF-α e IL-6 gene espressione. L'effetto inibitorio era paragonabile a quella di betametasone. Nessun effetti citotossici sono stati registrati per le cellule trattate con il /estratto MeOHGCM6 ml 10 mg. I ratti alimentati con MeOHGCM6 estratto a 500 mg /kg b.w. hanno evidenziato una ridotta dimensione delle lesioni gastriche etanolo-indotta assoluti da > 99% (p
< 0,05). Questo effetto protettivo è stato paragonabile a quello conferito da OMP. Il pH del muco gastrico è diminuita in maniera dose-dipendente 5,51-3,82 e non vi è stato un significativo aumento delle concentrazioni di NP-SH.
Conclusioni
I risultati dello studio, suggeriscono che la spettrometria di massa standardizzato estratto metanolico di Gracillaria
changii possiede proprietà anti-infiammatorie, gastroprotettivi e anti-ulcerogeni. Un ulteriore esame del principio attivo dell'estratto e il suo meccanismo d'azione è giustificata in futuro.
Parole
antinfiammatorio anti-ulcerogeno gastroprotettori Gracilaria changii
citochine Betametasone Omeprazolo Alghe Ulcera Sfondo
infiammazione è una caratteristica importante di molte malattie. Essa è caratterizzata da un complesso di interazioni tra orchestrato mediatori dell'infiammazione e cellule infiammatorie dirette verso rimozione irritanti e guarigione delle lesioni dei tessuti [1, 2]. L'infiammazione è un importante meccanismo di difesa dell'ospite. L'infiammazione che si verifica nella mucosa del tratto gastrointestinale, tuttavia, provoca ulcere gastrointestinali [3]. ulcera gastrointestinale è un disturbo importante comune del sistema digerente che colpisce milioni di americani e molti altri in tutto il mondo [4]. La causa più comune di ulcera gastrointestinale sono l'infezione da Helicobacter pylori
(H. pylori
) [5] e l'uso a lungo termine di farmaci anti-infiammatori non steroidei (FANS) come l'aspirina e ibuprofene [6]. L'avvento dei controlli antibiotici contro H. pylori
ha ridotto significativamente il numero di casi di ulcera gastrointestinale nei paesi sviluppati [7]. La malattia tuttavia, è ancora alto in altri paesi e la malattia causata dall'uso di FANS è ancora un problema sanitario nei paesi sviluppati [6, 7].
Trattamento dell'infiammazione in generale, lo scopo di inibire la sia attività delle cellule infiammatorie o inibire la produzione di mediatori infiammatori [8]. Il seguito può essere realizzato utilizzando farmaci come i FANS e corticosteroidi [9]. Il trattamento per l'ulcera gastrointestinale, in generale, si rivolge sia a eliminare H. pylori
infezione o ridurre e inibire i livelli di produzione di acido gastrico responsabili l'erosione dello strato protettivo gastrointestinali [10, 11]. Il seguito può essere realizzato utilizzando farmaci come l'istamina (H 2) bloccanti, inibitori della pompa acidi e delle mucose farmaci protettivi [9]. Tuttavia, sono stati descritti i vari effetti collaterali di uso a lungo termine di questi farmaci [9]. Inoltre, antiinfiammatorie e farmaci anti-ulcerose sono utilizzati principalmente per alleviare i sintomi della malattia senza effettivamente curare o prevenire i processi infiammatori e ulcerogeni.
Sviluppo di farmaci anti-infiammatori e anti-ulcerose è recentemente focalizzata sulla scoperta l'applicazione favorevole estratti di origine vegetale vegetali che sono potenti e sicuri da usare. Le alghe trovato crescere in abbondanza al largo delle zone costiere di molte parti del mondo, rappresentano un potenziale ancora non sfruttato enorme per la nuova fonte di terapie [12, 13]. L'alga rossa, per esempio è stato segnalato per contenere composti attivi che possono contribuire a migliorare l'infiammazione del tratto alimentare [14], prevenire o curare le ulcere gastriche e tumori causati dallo stress ossidativo [15, 16], inibire le attività infiammatoria sopprimendo la produzione di mediatori infiammatori [17-19] e inducono l'apoptosi delle cellule del cancro allo stomaco [20] e del colon [21]. Composti naturali derivati ​​dalle alghe commestibili potrebbero essere più sicuri da utilizzare come anti-infiammatori e gastrica terapie anti-ulcerose come sono state prese come cibo e utilizzata nella medicina tradizionale da tempo immemorabile [13].
Le alghe rosse, Gracilaria changii
(Xia et Abbott) Abbott, Zhang et Xia trovato crescere al largo delle coste della Malesia rappresenta una potenziale fonte locale di questa terapie di derivazione naturale. Attualmente, le alghe sono commercialmente raccolte solo per il suo contenuto colloidale agar e prelibatezze alimentari locali. Queste alghe sono ampiamente applicati come medicina popolare per il trattamento di vari disturbi, tra cui l'infiammazione e disturbi gastrici. Il presente studio si propone di valutare le potenziali attività anti-infiammatoria, gastroprotettivi e anti-ulcerose di queste alghe rosse malese, Gracilaria
changii
. Metodi
alghe estrarre preparazione
Gracilaria changii
(Xia et Abbott) Abbott, Zhang et Xia sono stati raccolti dalle acque costiere di Morib, Selangor, Malesia (N2 ° 44 '908 ", E101 ° 26' 590"), alla fine di febbraio 2003 [22-24]. Le alghe sono stati identificati dal Prof. Dr. Phang Siew Moi, direttore dell'Istituto di Oceano e Scienze della Terra, Istituto di Scienze Biologiche, Facoltà di Scienze, Università della Malaysia, dove sono stati mantenuti gli esemplari di voucher (erbario n. PSM 6320 e PSM 6321 ). Le alghe sono state lavate in acqua di mare sterile con un risciacquo finale in acqua distillata sterile come precedentemente descritto [22]. Le alghe sono stati poi sonicato in un bagno sonicatore acqua e mantenuti a -70 ° C. estratto metanolico di Gracilaria
changii (estratto MeOHGCM6) è stato preparato presso l'Università di Malesia Terengganu (UMT), secondo le modalità descritte [25]. L'estratto MeOHGCM6 è stato mantenuto a -20 ° C prima dell'uso.
MeOHGCM6 estrarre
analisi Profilo dell'estratto MeOHGCM6 è stato eseguito su un Shimadzu ultra-veloce cromatografia liquida (UFLC) sistema dotato di fotodiodi raggi ultravioletti (UV PDA ) rivelatore e tempo a trappola ionica dello spettrometro di volo (TOF) di massa (Shimadzu, Giappone). La separazione è stata realizzata su una colonna Waters XBridge C18 (50 mm x 2,1 millimetri, diametro delle particelle di 2,5 micron) (Acqua, USA) a 40 ° C. La fase mobile consisteva di acqua [0,1% di acido formico (BDH materiale di laboratorio, Inghilterra)]: acetonitrile (accessori per la BDH laboratorio, Inghilterra) (0,1% di acido formico) ad una velocità di flusso di 0,50 ml /min con un volume di iniezione di 10 ml . modalità di ionizzazione elettrospray (ESI) con commutazione positivo /negativo ed esterno di riferimento è stato utilizzato per spettrometria di massa (MS). Dictionary of Natural Products (CRC Press), con alta risoluzione MS e informazioni strutturali è stato utilizzato per analizzare gli spettri di ioni positivi e negativi insieme a informazioni MS /MS per l'identificazione di componenti simili.
Linea cellulare umana promonocytic (U937)
U937 cellule sono state acquistate dalla American Type Culture Collection (ATTC, USA) e coltivate in Roswell Park Memorial Institute-1640 (media RPMI-1640) (FlowLab, Australia) [supplementato con 1% di 10 mm aminoacido non essenziale (NEAA) (FlowLab, Australia) e l'1% di 10 mm L-glutammina (L-Glu) (FlowLab, Australia)] contenente il 10% di siero di calore-inattivato fetale bovino (FBS) (FlowLab, Australia). Le cellule sono state incubate a 37 ° C in un incubatore umidificato con 5% di CO 2.
Differenziazione di cellule U937
U937 cellule sono state seminate in piastre da 96 pozzetti di coltura cellulare (Falcon, USA) ad una densità di 2 × 10 4 cellule /pozzetto con RPMI-1640 contenente 2% FBS e mantenuti a 37 ° C in un incubatore umidificato con 5% di CO 2. Il giorno seguente, terreno contenente forbolo 12-miristato 13-acetato (PMA) (Sigma-Aldrich, USA) a concentrazioni comprese 0-50 nM sono stati aggiunti alle cellule monocitiche U937 di indurre il differenziamento per 24 e 48 ore. Piano contenente solo diluenti PMA [dimetilsolfossido (DMSO) soluzione (Sigma-Aldrich, USA)] sono stati aggiunti in parallelo ed utilizzato come controllo del veicolo. Alla fine del punto di tempo indicato, le cellule sono stati valutati per l'espressione marcatore di superficie cellulare macrofago-specifica differenziazione e la vitalità cellulare.
Espressione del CD11b, marcatore di superficie delle cellule macrofago-specifica differenziazione è stata determinata colorando le cellule come precedentemente descritto [26 , 27]. La vitalità cellulare è stata determinata con il trypan colorante blu (Sigma, USA) saggio di esclusione come descritto in precedenza [28].
Citotossicità saggio
U937 sono state seminate in piastre da 96 pozzetti di coltura cellulare ad una densità di 2 × 10 4 cellule /pozzetto con RPMI-1640 contenente 2% FBS e mantenuti a 37 ° C in un incubatore umidificato con 5% di CO 2. sono stati aggiunti Il giorno seguente, terreno contenente MeOHGCM6 estratto (a concentrazioni comprese 0-100 mg /ml) e betametasone (Sigma, USA) (a concentrazioni comprese 0-100 nM). Piano contenente solo il MeOHGCM6 estrarre e diluenti betametasone [etanolo (EtOH) (BDH Laboratory Supplies, Inghilterra) e DMSO rispettivamente] sono stati aggiunti in parallelo ed utilizzato come controllo del veicolo. Un post-trattamento giorno, il tasso di proliferazione delle cellule U937 è stato determinato utilizzando il kit CellTiter 96® non radioattivo Cell Proliferation (Promega, USA) seguendo rigorosamente il protocollo consigliato dal produttore.
MeOHGCM6 estrarre il trattamento delle cellule U937
U937 cellule sono state seminate in piastre di coltura cellulare di 24 pozzetti (Falcon, USA) ad una densità di 2 × 10 5 cellule /pozzetto con RPMI-1640 contenente 2% FBS e incubato a 37 ° C in un incubatore umidificato con 5% CO 2. Il giorno seguente, le cellule U937 sono state indotte a differenziare con 10 nM PMA per 24 ore. Durante la differenziazione, le cellule U937 sono state trattate con l'estratto MeOHGCM6 o betametasone alla concentrazione fisiologica. A 0, 8, 16 e 24 ore dopo il trattamento, supernatante e le cellule sono state raccolte e saggiate per TNF-α livello di risposta e TNF-α e IL-6 espressione genica.
Livello di risposta TNF-α
TNF α livello è stata misurata utilizzando la BD OptEIA ™ TNF umano (TNF-α) kit ELISA II (BD Biosciences, USA) secondo il protocollo del produttore.
TNF-α e iL-6 espressione genica
RNA totale dal colture di cellule sono state isolate con il TRI Reagent® (Centro di ricerca molecolare, Inc., USA) e trattati con DNasi (Promega, USA). RNA è stato retrotrascritto (cDNA) utilizzando la SuperScript ™ II della trascrittasi inversa (Invitrogen, USA). Il cDNA è stato poi utilizzato per eseguire quantitativa real-time PCR utilizzando SYBR® Verde PCR Master Mix (Qiagen, Germania) sul DNA Engine Opticon II® (MJ Research, Bio-Rad, Stati Uniti d'America), come descritto in precedenza [29]. I primer oligonucleotidi utilizzati sono stati avanti 5'AAGAGTTCCCCAGGGACCTC e invertire 5'GCTTGAGGGTTTGCTACAAC per il TNF-α; avanti 5'GAAAGGAGACATGTAACAAG e invertire 5'CCAGGCAAGTCTCCTCATTG per IL-6; e inoltrare 5'GCGAGAAGATGACCCAGATC e invertire 5'GGATAGCACAGCCTGGATAG per il beta-actina (β-actina) (riferimento interno).
Animali
ratti femmina adulta Sprague-Dawley di età compresa tra 7 a 8 settimane e del peso di 160-200 g erano utilizzato per lo studio. Il protocollo per la sperimentazione animale è stato approvato dal Comitato istituzionale per l'etica nella sperimentazione animale dell'Università di Malaya [numero di approvazione: MP /08/06/2010 /SMH (R)]. Gli animali sono stati ottenuti da Università Putra Malaysia (UPM). Gli animali sono stati alloggiati individualmente in gabbie con fondo in filo a maglie larghe per evitare coprofagia. Sono stati tenuti in una camera a temperatura controllata che era ben ventilata, con cibo e acqua, su un /buio ciclo 12 ore di luce durante lo studio. Tutti i ratti sono stati privati ​​di cibo per 48 ore, ma aveva libero accesso all'acqua potabile fino a 2 ore prima di sottoporli alle ulcerogens.
Lesioni gastriche indotte EtOH
I ratti sono stati divisi casualmente in 7 gruppi con ogni gruppo composto da 6 ratti. Gruppo 1 è stato somministrato con il 10% di Tween 20 (diluenti estratto) (Laboratory Supplies BDH, Inghilterra) e servito come gruppo di controllo negativo. Gruppo 2 è stato dato 500 mg /kg b.w. dell'estratto vegetale estraneo estratto equivalente MeOHGCM6 simile preparata in parallelo, come estrarre MeOHGCM6 per servire come il gruppo di controllo non specifico estratti vegetali (NSPE). Gruppo 3 è stato trattato con OMP (Chemical Company della Malesia, Malesia) a 20 mg /kg b.w. ed è stato il gruppo di controllo trattamento positivo. Il restante gruppo 4, 5, 6 e 7 ricevuto 4 differenti concentrazioni dell'estratto MeOHGCM6 da 2,5 -, 500 mg /kg b.w. rispettivamente. Dopo 30 minuti di pre-trattamento, tutti gli animali sono stati somministrati con EtOH assoluto per via orale. Un'ora dopo la somministrazione, gli animali sono stati sacrificati da loro over-dosaggio con etere dietilico (BDH Chemicals Ltd., Inghilterra). addome del ratto è stato dissezionato e l'esofago vicina al cardias e lo stomaco disteso sul sfintere piloro stato immediatamente legato in un nodo con una stringa per evitare la fuoriuscita del contenuto gastrico. Lo stomaco è stato rapidamente rimosso e immerso in acqua.
Misura della secrezione gastrica
Il contenuto gastrico dello stomaco di ogni ratto è stato aspirato e delicatamente raschiato con una spatola. Il succo stomaco contenente particelle di cibo è stata scartata. Il muco gastrico raccolto è stato pesato con bilancia elettronica (Mettler Toledo, Svizzera). La quantità di gastrico succo è stata misurata utilizzando un cilindro graduato. Il pH del contenuto gastrico è stata misurata con un pH-metro digitale (CRISON INSTRUMENTS, SA, Spagna).
Valutazione delle lesioni gastriche lordi
Dopo la raccolta, lo stomaco è stato immediatamente lavata con soluzione salina ed esaminato al microscopio da dissezione (1,8 ×), con un oculare griglia quadrata. La porzione ghiandolare dello stomaco è stata valutata per la formazione di ulcera. La superficie ulcerating totale (UA) delle lesioni emorragiche per ogni stomaco è stata misurata mediante plannimetry (mm 2) e la percentuale di inibizione è stata calcolata usando la seguente formula: Inibizione %
=
UA
controllo -
UA
/
UA
controllo trattato ×
100
Determinazione della produzione di sulfidrili non proteici (NP-SH)
Gastric mucosa livello NP-SH è stata misurata come precedentemente descritto [30] con lievi modifiche. In breve, lo stomaco ghiandolare è stato pesato ed omogeneizzato in provette contenenti 0,02 M di acido ghiacciata etilendiamminotetraacetico (EDTA) (GibcoBRL Life Technologies, USA) (pH 8,9). Aliquote dei omogenati sono stati mescolati con acqua distillata e 50% di acido tricloroacetico (Sigma Chemical Co., USA). La miscela è stata incubata con agitazione costante per 10 minuti a 4 ° C e quindi centrifugata a 3000 xg per 15 minuti. La miscela è stata poi saggiato per il livello NP-SH utilizzando un kit di test glutatione (Sigma Chemical Co., USA) secondo il protocollo del produttore.
Analisi statistica
Tutti i dati sono stati espressi come media ± deviazione standard (SD) o mediana (25% e 75% quartile) da due o tre esperimenti indipendenti per studi anti-infiammatori e sette esperimenti indipendenti per studi gastroprotettivi e anti-ulcerogeni. ANOVA (analisi della varianza ad una via e due vie analisi della varianza) è stato utilizzato per il confronto tra i gruppi e per riportare la significatività statistica 'p
' rispetto al gruppo di controllo. Il valore di p
< 0.05 è stato considerato statisticamente significativo. Tutte le analisi statistiche sono state effettuate utilizzando il software GraphPad Prism 4.0 (USA) e SPSS versione 16.0 del software (SPSS Inc., Chicago), rispettivamente,
. Risultati
standardizzato MeOHGCM6 estrarre il profilo
LC /MS analisi dei diversi lotti di estratto MeOHGCM6 sono stati eseguiti per garantire la riproducibilità e la coerenza dei metodi di estrazione. Batch 1 e 2 di estratto MeOHGCM6 utilizzata nello studio mostravano altamente simili profili spettrali di massa e quantità dei principali masse (Figura 1A-C). L'analisi degli spettri e confronto al Dictionary of Natural Products, CRC Press ha identificato le masse distintivi come 457,405, 645,280 e 887,579. La massa identificato nello spettro ione positivo di m /z 457,405, aveva frammenti di 398,327 (picco di base), 380,316 e 158,082. La perdita neutro di 59,077 di massa era probabilmente indicativo della perdita di trimetilammina. Ciò suggerisce che il composto può contenere una frazione trimetilammonio. Gli MS e MS /MS dati ad alta risoluzione non potevano definitivamente individuare eventuali composti noti dal Dizionario di prodotti naturali. Le masse di m /z 645 e 887, invece, hanno mostrato una associazione distinta per due clorofille noti, metil-10 hydroxyphaeophorbide un
e 10-Hydroxypheophytin un
con gli assorbimenti UV appropriati osservato nell'analisi PDA (Tabella 1 ). Figura 1 Profiling dei diversi lotti di estratto MeOHGCM6. modalità ESI con commutazione positivo /negativo ed esterno di riferimento è stato utilizzato per la MS utilizzando un sistema Shimadzu UFLC. Totale spettri ione positivo analizzati per l'identificazione di componenti simili da due diversi lotti dell'estratto MeOHGCM6 utilizzato nello studio. (A) MeOHGCM6 estratto (Lotto 1; M6-1). (B) estratto MeOHGCM6 (lotto 2; M6-2). (C) Confronto dell'intensità delle masse più abbondanti delle due MeOHGCM6 estratto di lotti utilizzato nello studio.
Tabella 1 Struttura identificazioni dei più significativi massa presente nell'estratto MeOHGCM6 utilizzando LC /MS
massa (ione)
Trovato in lotti
Possibili ID
417,298
1, 2
Molto probabilmente contaminante
457,405 *
1, 2
non identificato
461,326
1, 2
Molto probabilmente contaminante
505,353
1, 2
Molto probabilmente contaminante
573,256
1, 2
non identificato 645,280
1, 2
Metil-10 hydroxyphaeophorbide un
743,636
1, 2
non identificato
887,579
1, 2
10-Hydroxypheophytin un
Dictionary of Natural Products, CRC Press con alta risoluzione MS sono stati utilizzati per analizzare gli spettri totale di ioni positivi per l'individuazione di eventuali componenti chimici.
* MS /MS (intensità relative%) 457,405 398,327 → ( 100%), 380,316 (50%), 158,082 (40%).
specifici Differenziazione espressione marcatore di superficie delle cellule macrofagi sulle cellule U937
cellule differenziate U937 si distinguono per l'espressione dei monociti /macrofagi-lignaggio specifico CD11b , marcatore superficie proteica [26]. Nel nostro studio, l'espressione del CD11b è stato segnato con un intenso etichettatura blu marrone sulla superficie cellulare [27]. L'espressione del CD11b stata notevolmente aumentata quando le cellule U937 sono state indotte a differenziare con concentrazioni crescenti di PMA (1, 10 e 50 nM) (Figura 2, Figura 3A). La scoperta suggerisce che il trattamento con 10 o 50 nM PMA per 24 o 1 nM PMA nelle 48 ore, le cellule U937 differenziate era ben al di sopra del 50% della coltura cellulare. Figura 2 L'espressione del marcatore superficie cellulare dei macrofagi differenziazione specifica sulle cellule monociti U937 differenziate. cellule monociti U937 sono state indotte a differenziare con (A) 0 ns PMA per 24 ore; (B) 0 ns PMA per 48 ore; (C) 1 nM PMA per 24 ore; (D) 1 nM PMA per 48 ore; (E) 10 nM PMA per 24 ore; (F) 10 nM PMA per 48 ore; (G) 50 nM PMA per 24 ore e (H) 50 nM PMA per 48 ore. Le cellule sono state colorate con colorazione immunoistochimica per identificare la presenza di CD11b, un marcatore di superficie cellulare macrofagica. cellule monociti differenziata U937 sono stati identificati dalla intensa macchia blu marrone sulla superficie cellulare delle cellule differenziate. Le cellule sono state viste a 20 × ingrandimenti in campo chiaro utilizzando un microscopio invertito e fotografato con una D70 fotocamera Nikon (Nikon, Giappone). Una serie di fotografie archetipo da tre esperimenti separati sono mostrati.
Figura 3-specific Differenziazione U937 cellule monociti determinazione espressione marcatore e la vitalità delle cellule superficie cellulare dei macrofagi. cellule monocitiche U937 sono state indotte a differenziare varie concentrazioni di PMA per 24 e 48 ore. (A) Le percentuali di cellule differenziate stati segnati dalla presenza di CD11b sulla superficie cellulare. (B) Le percentuali di cellule vitali sono stati segnati con trypan saggio di esclusione blu. La percentuale di cellule differenziate o vitali per cellule totali è uguale prima dell'esperimento utilizzando diverse concentrazioni di PMA e il periodo di incubazione. I dati sono presentati come media ± S.D. da tre esperimenti indipendenti con '*', pag
< 0.05 rappresentano differenza importanza rispetto al gruppo che non sono state indotte a differenziarsi. Determinazione vitalità
cellulare sulle cellule U937 differenziate
Le cellule U937 differenziate vitali sono stati segnati con il saggio di esclusione del colorante blu trypan. U937 redditività mostrato una significativa riduzione dose-dipendente della percentuale di cellule vitali quando indotte a differenziare con 1, 10 e 50 nM PMA (Figura 3B). La scoperta suggerisce che il 90% delle cellule U937 differenziate erano ancora vitale in seguito al trattamento con 1 o 10 nM PMA per 24 ore o 1 nM PMA per 48 ore
. Citotossicità di MeOHGCM6 estratto sulle cellule U937
Gli effetti citotossici di l'estratto MeOHGCM6 e betametasone sulle cellule U937 sono state determinate calcolando il tasso di proliferazione delle cellule. U937 trattate con l'estratto di MeOHGCM6 a 0,05, 0,5, 1 e 5 mg /ml esposti raffiche proliferative di 117.39% (108.48%, 122.10%), 152.04% (149.36%, 154.72%) (p
< 0,05) , 145.60% (137.48%, 149.11%) (p
< 0,05) e 118.49% (112.01%, 133.28%), rispettivamente (Figura 4A). Il trattamento con MeOHGCM6 estratto a 10 ug /ml hanno ridotto il tasso di proliferazione cellulare al 87.00% (82.43%, 89.62%). U937 trattate con il betametasone hanno mostrato una significativa riduzione dose-dipendente nella loro tasso di proliferazione (Figura 4B). A concentrazioni più basse di betametasone (0,1, 1, 5 e 10 nm), il tasso di proliferazione delle cellule è 110.35% (92.20%, 115,83%), 113.75% (89.56%, 122.98%), 94.59% (85.56%, 101.93%) e il 80.48% (77.78%, 110.48%), rispettivamente. Effetti Figura 4 citotossicità delle varie concentrazioni di estratto MeOHGCM6 e betametasone sulle cellule monocitica U937. Il tasso di proliferazione delle cellule monocitiche U937 trattate con concentrazioni crescenti di (A) estratto MeOHGCM6 e (B) betametasone è stato determinato su un periodo di 24 ore effettuando test MTT. La percentuale di proliferazione cellulare è relativo al numero di cellule seminate prima amministrare le diverse dosi di estratto MeOHGCM6 e betametasone. Le concentrazioni di estratto MeOHGCM6 che hanno causato il 30% (G130), 50% (G150) e 70% (G170) di inibizione della proliferazione cellulare sono stati estrapolati dal terreno (indicato da una freccia). I risultati sono stati espressi come mediana (25% e 75% quartile) di due esperimenti indipendenti.
Effetti del MeOHGCM6 estrarre trattamento sul livello di risposta TNF-α nel differenziamento delle cellule U937
Gli effetti del trattamento sulla MeOHGCM6 estratto la regolazione del livello di risposta TNF-α durante la differenziazione delle cellule U937 è stata studiata usando ELISA. Il livello di risposta TNF-α raggiunto un livello massimo di 43.28 ± 5.15 pg /ml a 8 ore quando le cellule U937 sono state indotte a differenziare (Figura 5A). In presenza di estratto MeOHGCM6 10 ug /ml durante il differenziamento delle cellule U937, il livello di risposta TNF-α significativamente diminuita fino a 8 ore [0.14 ± 0.28 pg /ml (p
< 0,001)] ed è stato paragonabile a quello osservato in presenza di betametasone [0,28 ± 0,56 pg /ml (p
< 0,001)]. Figura 5 MeOHGCM6 estrarre trattamento sul livello di risposta TNF-α e TNF-α e IL-6 genica durante il differenziamento delle cellule monocitiche U937. Le cellule monociti U937 sono state indotte a differenziarsi con 10 nM PMA. Durante la differenziazione, le cellule monociti U937 sono state trattate con l'estratto MeOHGCM6. (A) Il livello di risposta TNF-α sono stati quantificati mediante ELISA. L'(B) TNF-α e livelli di espressione (C) IL-6 gene sono stati quantificati tramite qRT-PCR. I risultati sono stati espressi come media ± S.D. da saggi quadruplicato.
Effetti del MeOHGCM6 estrarre trattamento sul TNF-α e IL-6 genica durante il differenziamento delle cellule U937
La regolazione di TNF-α e IL-6 da MeOHGCM6 Estratto di trattamento durante le cellule U937 differenziazione è stato ulteriormente approfondito a livello di espressione genica mediante qRT-PCR. Il livello di espressione del gene del TNF-α picco dopo 6 ore (3,16 ± 0,48 copie /actina) del U937 differenziazione (Figura 5B). TNF-α livello di espressione del gene diminuito durante le prime 6 ore [0,52 ± 0,28 copie /actina (p
< 0,001)] di differenziazione delle cellule U937 in presenza di 10 mg /ml di estratto MeOHGCM6. La diminuzione del livello di espressione del gene del TNF-α delle cellule U937 durante la differenziazione quando vengono trattati con 10 mg /ml MeOHGCM6 era paragonabile o superiore a quella dei risultati del trattamento con 10 nM betametasone [0,55 ± 0,42 copie /actina (p
< 0,001)]. Il livello di espressione del gene IL-6 ha mostrato un aumento significativo e ha alzato a 0,68 ± 0,09 copie /actina dopo 12 ore di cellule U937 differenziazione (Figura 5C). Diminuzione del livello di espressione del gene IL-6 è stato osservato per essere 0,10 ± 0,01 copie /actina, 0,23 ± 0,02 copie /actina (p
< 0,01), 0,37 ± 0,04 copie /actina (p
< 0,001 a 3, 6, 9 e 12 ore 0,001), rispettivamente, quando le cellule U937 durante la differenziazione sono stati trattati con 10 ug /ml di estratto MeOHGCM6;) e 0,45 ± 0,05 copie /actina (p
<. L'inibizione dei livelli di espressione del gene di IL-6 in presenza dell'estratto MeOHGCM6 era paragonabile a quella di betametasone.
Effetti trattamento profilattico di MeOHGCM6 estraggono sui ratti contenuto gastrico seguenti EtOH indotta lesioni della mucosa gastrica acuta
gastrico muco secrezione, il volume succo gastrico e pH muco gastrico sono stati determinati il ​​contenuto gastrico dello stomaco di ratto pre-trattato con estratto MeOHGCM6 seguente alimentazione EtOH. 2,45 ± 0,25 g di muco gastrico e 1.75 ± 0.20 ml di succo gastrico sono stati recuperati dallo stomaco di ratti alimentati con solo il diluente estratto (Tabella 2). 1,54 ± 0,31 g di muco gastrico e 0,96 ± 0,25 ml di succo gastrico e 1,68 ± 0,19 g di muco gastrico e 0,96 ± 0,16 ml di succo gastrico sono stati recuperati da ratti pretrattati con 250 e 500 mg /kg b.w. di MeOHGCM6 estrarre rispettivamente. In confronto, 2,31 ± 0,42 g di muco gastrico e 1,15 ± 0,36 ml di succo gastrico è stato recuperato da ratti pretrattati con 20 mg /kg b.w OMP. 2,75 ± 0,49 g di muco gastrico e 1,75 ± 0,28 ml di succo gastrico sono stati recuperati da ratti alimentati con estratti vegetali estranei simile preparato che è servito come il controllo NSPE. Questo gruppo di controllo produce elevate quantità di muco gastrico e succo gastrico significativamente rispetto ai ratti trattati con l'estratto MeOHGCM6. Tutti gli autori hanno letto e approvato il manoscritto finale.

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