Anti-inflammatory, magen und Anti-ulcerogene Wirkung von Rotalgen Gracilaria changii (Gracilariales, Rhodophyta) extract

Entzündungshemmend, magen und Anti-ulcerogene Wirkung von Rotalgen Gracilaria changii
(Gracilariales, Rhodophyta)
Zusammenfassung extrahieren
Hintergrund
Gracilaria changii
(Xia et Abbott) Abbott, Zhang et Xia, eine rote Algen häufig in den Küstengebieten von Malaysia gefunden wird traditionell für Lebensmittel und für die Behandlung von verschiedenen Krankheiten einschließlich Entzündungen und Magenbeschwerden eingesetzt . Das Ziel der Studie war es entzündungshemmende zu untersuchen, magen und anti-ulcerogene Tätigkeit einer Massenspektrometrie methanolischen Extrakt von Gracilaria changii
standardisiert.
Methoden methanolische Extrakt von Gracilaria changii
(MeOHGCM6 Extrakt
) wurde unter Verwendung der Massenspektrometrie (MS) hergestellt und standardisiert. Entzündungshemmenden Aktivitäten von MeOHGCM6 Extrakts wurden durch Behandlung von U937-Zellen während ihrer Differenzierung untersucht mit 10 ug /ml MeOHGCM6 Extrakt. Tumor-Nekrose-Faktoren-α (TNF-α) Reaktionsstufe und TNF-α und Interleukin-6 (IL-6) Genexpression wurden überwacht und im Vergleich zu derjenigen von 10 nM behandelt Betamethason, entzündungshemmendes Medikament. Gastroprotektive und anti ulcerogene Aktivitäten MeOHGCM6 Extrakts wurden 2,5 bis 500 mg /kg Körpergewicht (Körpergewicht) nach der Induktion von Läsionen des Magens hin durch Einspeisen von Ratten mit MeOHGCM6 Extrakt untersucht. Produktion von Schleim und Magensaft, pH des Magensaftes und Nicht-Protein-Sulfhydrylgruppen (NP-SH) -Spiegel wurden bestimmt und verglichen mit dem fed von 20 mg /kg b.w. Omeprazol (OMP), einem bekannten Anti-Ulkus Droge.
Ergebnisse | MS /MS-Analyse der MeOHGCM6 Extrakte zeigte die Anwesenheit von Methyl 10-hydroxyphaeophorbide ein
und 10-hydroxypheophytin ein
, bekannt Chlorophyll Proteine ​​und einige nicht identifizierte Moleküle. Die Behandlung mit 10 ug /ml MeOHGCM6 Extrakt während der Differenzierung von U937-Zellen signifikant gehemmt TNF-α Ansprechschwelle und TNF-α und IL-6-Genexpression. Die inhibitorische Wirkung war vergleichbar mit der von Betamethason. Keine zytotoxischen Wirkungen wurden Zellen mit 10 &mgr; g /ml MeOHGCM6 Extrakt behandelt aufgezeichnet. Ratten mit MeOHGCM6 gespeist Extrakts bei 500 mg /kg b.w. Magen-Läsion Größen absolutem Ethanol-induzierten >zeigte reduziert; 99% (p
< 0,05). Dieser schützende Effekt war vergleichbar mit jener von OMP verliehen. Der pH-Wert des Magenschleim verringert in dosisabhängiger Weise von 5,51 bis 3,82, und es gab einen signifikanten Anstieg in NP-SH-Konzentrationen.
Schlussfolgerungen
Die Ergebnisse der Studie legen nahe, dass die Massenspektrometrie methanolischen Extrakt von Gracillaria standardisiert changii
besitzt entzündungshemmende, magen und anti-ulcerogene Eigenschaften. Eine weitere Untersuchung des aktiven Bestandteils des Extrakts und dessen Wirkungsmechanismus in der Zukunft gewährleistet.
Schlüsselwörter Anti-inflammatory Anti-ulcerogene Gastroprotektiver Gracilaria changii
Cytokine Betamethason Omeprazole Seaweeds Ulcer Hintergrund
Entzündung ist ein wichtiges Merkmal vieler Krankheiten. Es wird durch einen Komplex von Wechselwirkungen zwischen orchestriert Mediatoren von Entzündung und Entzündungszellen zu entfernen Reizstoffen und Heilung von Gewebeverletzungen gerichtet gekennzeichnet [1, 2]. Die Entzündung ist ein wichtiger Abwehrmechanismus des Wirts. Entzündung, die in der Schleimhaut des Magen-Darm-Trakt auftritt, verursacht jedoch gastrointestinalen Geschwürs [3]. Magen-Darm-Geschwür ist eine gemeinsame Haupt Störung des Verdauungssystems Millionen von Amerikanern und viele mehr beeinflussen weltweit [4]. Die häufigste Ursache von Magen-Darm-Geschwür Krankheit sind eine Infektion mit Helicobacter pylori
(H. pylori
) [5] und die langfristige Verwendung von nicht-steroidalen Antirheumatika (NSAIDs) wie Aspirin und Ibuprofen [6]. Das Aufkommen der Antibiotika-Kontrollen gegen H. pylori
hat, die Zahl der Magen-Darm-Geschwür Fälle in den entwickelten Ländern [7] reduziert. Die Krankheit ist jedoch, immer noch hoch in anderen Ländern und die durch die Anwendung von NSAR verursachte Krankheit ist immer noch ein großes Gesundheitsproblem in den entwickelten Ländern [6, 7].
Behandlung von Entzündungen im Allgemeinen richtet sich entweder an der Hemmung Aktivität von Entzündungszellen oder die Produktion von Entzündungsmediatoren inhibierende [8]. Die später kann mit Medikamenten erreicht werden, wie NSAIDs und Kortikosteroide [9]. Die Behandlung von Magen-Darm-Geschwür im allgemeinen, richtet sich an entweder H. pylori
Infektion beseitigen oder zu verringern und die Höhe der Magensäureproduktion verantwortlich für die Erosion der Magen-Darm-Schutzschicht Hemmung [10, 11]. Die später kann erreicht werden unter Verwendung von Drogen wie Histamin (H 2) -Blocker, Säurepumpenhemmer und Schleimhaut schützenden Medikamente [9]. Allerdings haben verschiedene Nebenwirkungen der langfristige Verwendung dieser Medikamente beschrieben worden ist [9]. Darüber hinaus sind entzündungshemmende und anti-ulcerogene Drogen verwendet in erster Linie um die Symptome der Krankheit zu lindern, ohne tatsächlich die Behandlung oder die entzündlichen und ulcerogenic Prozesse zu verhindern.
Entwicklung von entzündungshemmenden und anti-ulcerogene Drogen konzentriert sich vor kurzem auf die Entdeckung die günstige Anwendung von pflanzlichen pflanzlichen Extrakten, die starke und sicherer zu bedienen sind. Algen gefunden in Hülle und Fülle wachsen aus den Küstengebieten von vielen Teilen der Welt eine riesige noch ungenutztes Potenzial für neue Quelle von Therapeutika darstellen [12, 13]. Die rote Algen zum Beispiel wurde berichtet, Wirkstoffe zu enthalten, die eine Entzündung des Verdauungstraktes zu lindern helfen kann [14], zu verhindern oder Magengeschwüre und Krebs durch oxidativen Stress verursacht zu behandeln [15, 16], entzündliche Aktivitäten hemmen, indem sie die Produktion der Unterdrückung Entzündungsmediatoren [17-19] und Krebszellapoptose in Magen [20] und Kolon [21] zu induzieren. Natürliche Verbindungen, die aus den essbaren Algen abgeleitet könnten sicherer sein, die zur Verwendung als entzündungshemmende und Magen-Anti-ulcerogene Therapeutika, wie sie in der traditionellen Medizin seit der Zeit als Nahrung und verwendet undenklichen Zeiten genommen wurden [13].
Die Rotalgen, Gracilaria changii
(Xia et Abbott) Abbott, Zhang et Xia fand die Küstengebiete von Malaysia wächst aus einer potentiellen lokalen Quelle dieser natürlich gewonnenen Therapeutika dar. Gegenwärtig werden die Algen im Handel nur für seine kolloidalen Agargehalt und als lokale Delikatessen geerntet. Diese Algen sind weit verbreitet als Volksmedizin für die Behandlung von verschiedenen Krankheiten einschließlich Entzündungen und Magenbeschwerden angewendet. Die vorliegende Studie hat zum Ziel, die potenziellen antientzündliches, magen und anti-ulcerogene Aktivitäten dieser Malaysian Rotalgen, Gracilaria changii
zu bewerten.
Methoden
Algen Vorbereitung extrahieren
Gracilaria changii
(Xia et Abbott) Abbott, Zhang et Xia wurden aus der Küstengewässer von Morib, Selangor, Malaysia (N2 ° 44 '908 ", E101 ° 26' 590") Ende Februar 2003 gesammelt [22-24]. Die Algen wurden von Professor Dr. Phang Siew Moi, Direktor des Instituts für Ozean und Geowissenschaften, Institut für Biologische Wissenschaften, Fakultät für Informatik, Universität Malaya identifiziert, in denen die Belegexemplare beibehalten wurden (Herbarium Nr. PSM 6320 und PSM 6321 ). Die Algen wurden in sterilem Meerwasser mit einer Endspülung in sterilem destilliertem Wasser gewaschen, wie zuvor beschrieben [22]. Die Algen wurden dann in einem Wasserbad Sonicator und gehalten bei -70 ° C mit Ultraschall behandelt. Methanolische Extrakt von Gracilaria changii
(MeOHGCM6 Extrakt) wurde an der Universität von Malaysia Terengganu (UMT) gemäß den Verfahren beschrieben [25] hergestellt. Der MeOHGCM6 Extrakt wurde bei -20 ° C gehalten, bevor zu verwenden.
MeOHGCM6
Profil-Analyse des Extraktes MeOHGCM6 Extrakt wurde mit Photodiodenarray ultraviolettem (UV PDA ausgestattet auf einem Shimadzu ultra-schnelle Flüssigchromatographie (UFLC) System durchgeführt ) Detektor und Ionenfalle Flugzeit (TOF) Massenspektrometers (Shimadzu, Japan). Die Trennung wurde bei 40 ° C auf einer Waters Xbridge C18-Säule (50 mm × 2,1 mm, Teilchendurchmesser von 2,5 &mgr; m) (Wasser, USA) erreicht. Die mobile Phase bestand aus Wasser [0,1% Ameisensäure (BDH Laboratory Supplies, England)]: Acetonitril (BDH Laboratory Supplies, England) (0,1% Ameisensäure) bei einer Fließgeschwindigkeit von 0,50 ml /min mit einem Injektionsvolumen von 10 ul . Elektrospray-Ionisation (ESI) Modus mit positiver /negativer Schalt und externe Referenz wurde für die Massenspektrometrie (MS) eingesetzt. Das Wörterbuch der Natural Products (CRC Press) mit hoher Auflösung MS-Spektren und Strukturinformationen verwendet, um die positiven und negativen Ionenspektren zu analysieren zusammen mit MS /MS-Informationen zur Identifizierung von ähnlichen Komponenten.
Menschliche promonocytic Zelllinie (U937-Zellen)
U937-Zellen wurden von der American Type Culture Collection (ATTC, USA) erworben und kultiviert in Roswell Park Memorial Institute-1640 (RPMI-1640-Medium) (Flowlab, Australien) [mit 1% 10 mM nicht-essentiellen Aminosäuren supplementiert (NEAA) (Flowlab, Australien) und 1% von 10 mM L-Glutamin (L-Glu) (Flowlab, Australien)], enthaltend 10% hitzeinaktiviertes fötales Rinderserum (FBS) (Flowlab, Australien). Zellen wurden bei 37 ° C in einem befeuchteten Inkubator mit 5% CO 2 inkubiert.
Differenzierung der U937-Zellen U937
Zellen in 96-well-Zellkulturplatten (Falcon, USA) in einer Dichte ausgesät von 2 x 10 4 Zellen /Vertiefung mit RPMI-1640-Medium, das 2% FBS und gehalten bei 37 ° C in einem befeuchteten Inkubator mit 5% CO 2. Am folgenden Tag-Medium mit Phorbol-12-Myristat-13-acetat (PMA) (Sigma-Aldrich, USA) bei Konzentrationen im Bereich von 0-50 nM wurden den monozytischen U937-Zellen gegeben Differenzierung für 24 und 48 Stunden zu induzieren. Medium nur PMA Verdünnungsmittel [Dimethylsulfoxid (DMSO) -Lösung (Sigma-Aldrich, USA)] wurden in parallel hinzugefügt und als Fahrzeugsteuerung enthält. Am Ende des angegebenen Zeitpunkt wurden für differenzierungsspezifische Makrophagenzelloberfläche ausgewertet Zellen Markerexpression und die Lebensfähigkeit der Zellen.
Expression des CD11b, differenzierungsspezifische Makrophagenzelloberflächenmarker wurde durch Anfärben der Zellen bestimmt, wie zuvor beschrieben [26 , 27]. Die Lebensfähigkeit der Zellen wurde unter Verwendung des Trypan-Blau-Farbstoff (Sigma, USA) Ausschluss-Assay, wie oben beschrieben, bestimmt [28].
Zytotoxizitätstest
U937-Zellen wurden bei einer Dichte von 2 in 96-well-Zellkulturplatten ausgesät × 10 4 Zellen /Vertiefung mit RPMI-1640-Medium, das 2% FBS und gehalten bei 37 ° C in einem befeuchteten Inkubator mit 5% CO 2. Am folgenden Tag-Medium, enthaltend MeOHGCM6 (bei Konzentrationen von 0-100 ug /ml reichen) und Betamethason (Sigma, USA) (bei Konzentrationen von 0-100 nM) Extrakt zugegeben. haltiges Medium die MeOHGCM6 nur extrahieren und Betamethason Verdünnungsmittel [Ethanol (EtOH) (BDH Laboratory Supplies, England) und DMSO enthielt] wurden parallel und als Fahrzeugsteuerung hinzugefügt. Einen Tag nach der Behandlung wurde die U937-Zellen Proliferationsrate streng nach den empfohlenen Protokoll des Herstellers mit dem CellTiter 96® nicht-radioaktive Cell Proliferation Kit (Promega, USA) bestimmt.
MeOHGCM6 Behandlung von U937-Zellen extrahieren
U937-Zellen in 24-well-Zellkulturplatten (Falcon, USA) bei einer Dichte von 2 wurden ausgesät × 10 5 Zellen /Vertiefung mit RPMI-1640-Medium, enthaltend 2% FBS und bei 37 ° C in einem befeuchteten Inkubator mit 5% inkubiert CO 2. Am folgenden Tag wurden die U937-Zellen induziert, für 24 Stunden mit 10 nM PMA zu differenzieren. Während der Differenzierung wurden die U937-Zellen mit dem MeOHGCM6 Extrakt oder Betamethason bei physiologischen Konzentration behandelt. Bei 0, 8, 16 und 24 Stunden nach der Behandlung, Überstand und die Zellen wurden geerntet und für TNF-α Ansprechschwelle und TNF-α und IL-6 Gen-Expression getestet.
TNF-α Ansprechschwelle
TNF- α-Ebene wurde mit der BD OptEIA ™ Human-TNF (TNF-α) ELISA Kit nach II (BD Biosciences, USA) gemessen, dem Protokoll des Herstellers.
TNF-α und IL-6-Genexpression
Gesamt-RNA aus dem Zellkulturen wurden unter Verwendung des TRI Reagent® (Molecular Research Centre, Inc., USA) aufgenommen und mit DNase (Promega, USA) isoliert. RNA wurde revers transkribiert (cDNA) unter Verwendung des Superscript ™ II Reverse Transkriptase (Invitrogen, USA). Die cDNA wurde dann verwendet, quantitative Echtzeit-PCR unter Verwendung von SYBR® Green PCR Master-Mix (Qiagen, Deutschland) auf DNA-Engine Opticon II® (MJ Research, Bio-Rad, USA) durchgeführt, wie zuvor beschrieben [29]. Die Oligonukleotid-Primer wurden nach vorn 5'AAGAGTTCCCCAGGGACCTC und Reverse 5'GCTTGAGGGTTTGCTACAAC für TNF-α; weiterleiten 5'GAAAGGAGACATGTAACAAG und Reverse 5'CCAGGCAAGTCTCCTCATTG für IL-6; und 5'GCGAGAAGATGACCCAGATC Vorwärts- und Rückwärts 5'GGATAGCACAGCCTGGATAG für Beta-Actin (β-Aktin) (interne Referenz).
Tiere
Erwachsene weibliche Sprague-Dawley-Ratten, die zwischen 7 bis 8 Wochen alt und mit einem Gewicht von 160-200 g wurden für die Studie verwendet. Das Protokoll für Tierversuche wurde vom Institutionellen Ausschuss für Ethik in der Tierversuche der Universität Malaya [: MP /08/06/2010 /SMH (R) Zulassungsnummer] genehmigt. Die Tiere wurden von der Universität Putra Malaysia (UPM) erhalten. Die Tiere wurden einzeln in Käfige mit weitmaschigen Drahtboden coprophagy zu verhindern untergebracht. Sie wurden in einem temperierten Raum gehalten, der gut belüftet wurde, mit Nahrung und Wasser, auf einem 12-stündigen Hell /Dunkel-Zyklus während der gesamten Studie. Alle Ratten wurden 48 Stunden lang die Nahrung entzogen, aber hatten freien Zugang zu Trinkwasser bis 2 Stunden vor ihnen auf die ulcerogens ausgesetzt wird.
EtOH-induzierten Läsionen des Magens
Die Ratten zufällig mit jeder Gruppe in 7 Gruppen eingeteilt bestehend aus 6 Ratten. Gruppe 1 wurde mit 10% Tween 20 (Extrakt Verdünnungsmittel) (BDH Laboratory Supplies, England) und dienten als negative Kontrollgruppe verabreicht. Gruppe 2 gegeben wurde 500 mg /kg b.w. des MeOHGCM6 Extrakt-Äquivalent nicht verwandten Pflanzenextrakt in ähnlicher Weise parallel hergestellt, wie MeOHGCM6 als nicht-spezifische Pflanzenextrakt (NSPE) Kontrollgruppe dienen extrahieren. Gruppe 3 wurde mit OMP (Chemical Company of Malaysia, Malaysia) bei 20 mg /kg Körpergewicht behandelt und als die positive Behandlung Kontrollgruppe diente. Die verbleibende Gruppe 4, 5, 6 und 7 erhielt 4 verschiedenen Konzentrationen des Extrakts MeOHGCM6 Bereich von 2,5 bis 500 mg /kg Körpergewicht, respectively. Nach 30 Minuten Vorbehandlung wurden alle Tiere mit absolutem EtOH durch den oralen Weg verabreicht. Eine Stunde nach Verabreichung wurden die Tiere geopfert durch Überdosierung sie mit Diethylether (BDH Chemicals Ltd., England). Der Bauch wurde die Ratte seziert und die Speiseröhre am nächsten an der Cardia und dem aufgeblähten Bauch auf dem Magenpförtner wurde sofort in einem Knoten gebunden mit Hilfe einer Schnur Leckage des Mageninhalts zu vermeiden. Der Magen wurde schnell entfernt und in Wasser.
Messung der Magensekretion
Der Mageninhalt jeder Ratte Magen abgesaugt wurde getaucht und kratzte vorsichtig mit einem Spachtel. Der magensafthaltige Speisereste wurde verworfen. Das geerntete Magenschleim wurde mit elektronischen Waage (Mettler Toledo, Schweiz) gewogen. Die Menge an Magensaft wurde mit einem Meßzylinder gemessen. Der pH-Wert des Mageninhalt wurde eine digitale pH-Meter (Crison Instruments, SA, Spanien) gemessen.
Bewertung der Bruttomagenläsionen
der Ernte wurde der Magen sofort mit Kochsalzlösung gespült und unter einem Binokular untersucht (1,8 ×) mit einem quadratischen Raster Okular. Der Drüsenteil des Magens wurde für die Bildung von Geschwüren beurteilt. Die Gesamt ulcerating Bereich (UA) der hämorrhagische Läsionen für jeden Magen wurde von plannimetry gemessen (mm 2) und der Prozentsatz der Hemmung wurde mit der folgenden Formel berechnet: Inhibition %
=
UA
Kontrolle -
UA
behandelt /
UA
Kontrolle ×
100
Bestimmung der Produktion von nicht-Protein sulfhydryls (NP-SH)
Magenschleimhaut NP-SH-Ebene wurde wie zuvor beschrieben gemessen [30] mit geringen Modifikationen. Kurz gesagt wurde das Drüsenmagen gewogen und in Röhrchen eiskaltem 0,02 M Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) (GibcoBRL Life Technologies, USA) (pH 8,9) enthält. Aliquote der Homogenate wurden mit destilliertem Wasser und 50% Trichloressigsäure (Sigma Chemical Co., USA) gemischt. Die Mischung wurde für 10 Minuten bei 4 ° C unter konstantem Rühren inkubiert und dann bei 3000 × g für 15 Minuten zentrifugiert. Das Gemisch wurde dann für NP-SH-Ebene untersucht, eine Glutathion-Assay-Kits (Sigma Chemical Co., USA) unter Verwendung von nach dem Protokoll des Herstellers. Die statistische Analyse
Alle Daten als Mittelwert ± Standardabweichung (SD) ausgedrückt wurden, oder Median (25% und 75% Quartil) von zwei oder drei unabhängigen Experimenten für entzündungshemmende Studien und sieben unabhängigen Experimenten für gastroprotektive und anti ulcerogene Studien. ANOVA (Einweg-Analyse der Varianz und Zweiweg-Varianzanalyse) wurde für den Vergleich zwischen den Gruppen und für die Berichterstattung über die statistische Signifikanz "p
'in Bezug auf die Kontrollgruppe verwendet. Der Wert von p
< 0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen. Alle statistischen Analysen wurden unter Verwendung der GraphPad Prism 4.0 Software (USA) und SPSS Version 16.0 Software (SPSS Inc, Chicago) durchgeführt sind.
Ergebnisse
Standardisierte MeOHGCM6 Profil für LC extrahieren /MS-Analysen der verschiedenen Chargen von MeOHGCM6 Extrakt wurden durchgeführt, Reproduzierbarkeit und Konsistenz der Extraktionsverfahren zu gewährleisten. Charge 1 und 2 der MeOHGCM6 Extrakt in der Studie zeigten sehr ähnliche Massenspektralanalyse Profile und die Menge der großen Massen (1A-C). Die Analyse der Spektren und der Vergleich mit dem Dictionary of Natural Products, identifiziert CRC Press die charakteristischen Massen als 457,405, 645,280 und 887,579. Die identifizierte Masse im positiven Ionenspektrum m /z 457,405, hatte Fragmente von 398,327 (Basispeak), 380,316 und 158,082. Der neutrale Verlust von 59,077 Masse war möglicherweise bezeichnend für Trimethylamin verloren. Dies legt nahe, dass die Verbindung eine trimethylammonium-Einheit enthalten kann. Die hochauflösenden MS und MS /MS-Daten konnten nicht endgültig alle bekannten Verbindungen aus dem Dictionary of Natural Products identifizieren. Die Massen von m /z 645 und 887, zeigte jedoch eine deutliche Assoziation zu zwei bekannten Chlorophylle, Methyl 10-hydroxyphaeophorbide ein
und 10-Hydroxypheophytin ein
mit den entsprechenden UV-Absorption in der PDA-Analyse beobachtet (Tabelle 1 ). Figur 1 Profilierung der verschiedenen Chargen von MeOHGCM6 Extrakt. ESI-Modus mit positiver /negativer Schalt und externe Referenz wurde für die MS unter Verwendung eines Shimadzu UFLC-System verwendet. Insgesamt positive Ionenspektren zur Identifizierung von ähnlichen Komponenten aus den zwei verschiedenen Chargen des MeOHGCM6 Extrakt verwendet in der Studie untersucht. (A) MeOHGCM6 Extrakt (Charge 1; M6-1). (B) MeOHGCM6 Extrakt (Batch 2; M6-2). (C) Vergleich der Intensität der am häufigsten vorkommenden Massen der beiden MeOHGCM6 Extrakt Chargen in der Studie.
Tabelle 1 Struktur Identifikationen der bedeutendsten Masse in MeOHGCM6 Extrakt unter Verwendung von LC /MS
Masse (ion)
im Batch gefunden
Mögliche ID
417,298
1, 2
wahrscheinlich Verunreinigung
457,405 *
1, 2
Unidentified
461,326
1, 2
wahrscheinlich Verunreinigung
505,353
1, 2
wahrscheinlich Verunreinigung
573,256
1, 2
Unidentified
645,280
1, 2
Methyl 10-hydroxyphaeophorbide a
743,636
1, 2
Unidentified
887,579
1, 2
10-Hydroxypheophytin a
Dictionary of Natural Products, CRC Press mit hoher Auflösung MS-Spektren wurden verwendet, um die gesamte positive Ionenspektren zur Identifizierung von möglichen chemischen Bestandteile zu analysieren.
* MS /MS (relativen Intensitäten%) 457,405 → 398,327 ( 100%), 380,316 (50%), 158,082 (40%).
differenzierungsspezifische Makrophagenzelloberflächenmarker-Expression auf U937 Zellen
Differentiated U937-Zellen durch die Expression der Monozyten /Makrophagen-Linie spezifische CD11b auszeichnen , Oberflächenmarkerprotein [26]. In unserer Studie wurde die Expression des CD11b mit einem intensiven bräunlich blauen Markierung auf der Zelloberfläche markiert [27]. Die Expression des CD11b wurde stark erhöht, wenn die U937-Zellen mit zunehmender Konzentration von PMA (1, 10 und 50 nM) (Figur 2, 3A) zur Differenzierung induziert wurden. Die Feststellung vorgeschlagen, dass die Behandlung mit 10 oder 50 nM PMA für 24 Stunden oder 1 nM PMA für 48 Stunden, differenzierten U937-Zellen deutlich über 50% der Zellkultur. Abbildung 2 Expression der Differenzierungsspezifischen Makrophagen-Zelloberflächenmarker auf differenzierten U937 monozytären Zellen. U937 wurden monozytären Zellen induziert für 24 Stunden mit (A) 0 nM PMA zu differenzieren; (B) 0 nM PMA 48 Stunden; (C) 1 nM PMA für 24 Stunden; (D) 1 nM PMA für 48 Stunden; (E) 10 nM PMA für 24 Stunden; (F) 10 nM PMA für 48 Stunden; (G) 50 nM PMA für 24 Stunden und (H) 50 nM PMA für 48 Stunden. Zellen wurden unter Verwendung immunhistochemischer Färbung gefärbt, um die Anwesenheit von CD11b, einer Makrophagenzelloberflächenmarker zu identifizieren. Differentiated monozytischen U937-Zellen wurden durch die intensive bräunlich blaue Flecken auf der Zelloberfläche der differenzierten Zellen identifiziert. Die Zellen wurden bei 20 × Vergrößerungen unter Hell mit einem inversen Mikroskop und fotografiert mit einer Nikon D70 Kamera (Nikon, Japan) angesehen. Eine archetypische Reihe von Fotografien aus drei getrennten Experimenten gezeigt.
3 Differenzierung spezifische U937 Monozyten-Makrophagen-Zelloberflächenmarker Ausdruck und die Lebensfähigkeit der Zellen Bestimmung. U937 wurden monozytären Zellen induziert mit verschiedenen Konzentrationen von PMA für 24 und 48 Stunden zu differenzieren. (A) Die Prozentsätze von differenzierten Zellen wurden durch die Anwesenheit von CD11b auf der Zelloberfläche erzielt. (B) Die Prozentsätze der lebenden Zellen wurden erzielt Trypanblau-Ausschluss-Assay verwendet wird. Der Prozentsatz der differenzierten oder lebensfähige Zellen pro Gesamtzellen ist die gleiche vor dem Versuch, die verschiedenen Konzentrationen von PMA und Inkubationszeit verwendet. Daten sind als Mittelwert ± S.D. präsentiert aus drei unabhängigen Experimenten mit '*', p
< 0,05 repräsentieren Bedeutung Unterschied im Vergleich zu der Gruppe, die nicht induziert wurden zu differenzieren.
Die Lebensfähigkeit der Zellen Bestimmung auf differenzierten U937-Zellen
Die Lebend differenzierten U937-Zellen wurden die Trypanblaufarbstoff Ausschluss-Assay erzielt werden. U937 Zellen Lebensfähigkeit zeigten eine signifikante dosisabhängige Reduktion des Prozentsatzes an lebensfähigen Zellen induziert, wenn mit 1, 10 und 50 nM PMA (3B) zu differenzieren. Der Befund, schlug vor, dass 90% der differenzierten U937-Zellen mit 1 oder 10 nM PMA für 24 Stunde oder 1 nM PMA für 48 Stunden nach der Behandlung immer noch lebensfähig waren.
Zytotoxizität von MeOHGCM6 auf U937-Zellen extrahieren
Die zytotoxische Wirkung von die MeOHGCM6 Extrakt und Betamethason auf den U937-Zellen wurden durch die Berechnung der Zellproliferationsrate bestimmt. Behandelten U937-Zellen mit dem MeOHGCM6 bei 0,05 extrahieren, 0,5, 1 und 5 &mgr; g /ml zeigte proliferative Bursts von 117,39% (108,48% 122,10%), 152,04% (149,36% 154,72%) (p
< 0,05) , 145.60% (137,48% 149,11%) (p
< 0,05) und 118,49% (112,01% 133,28%), bzw. (4A). Die Behandlung mit MeOHGCM6 Extrakt bei 10 ug /ml die Zellproliferationsrate auf 87,00% reduziert (82,43%, 89,62%). Behandelten U937-Zellen mit dem Betamethason zeigten signifikante dosisabhängige Verringerung in ihrer Proliferationsrate (4B). Bei niedrigeren Konzentrationen von Betamethason (0,1, 1, 5 und 10 nM), wobei die Zellproliferationsrate betrug 110,35% (92,20% 115,83%), 113.75% (89,56% 122,98%), 94,59% (85,56% 101,93%) und 80,48% (77,78%, 110,48%) sind. Figur 4 Zytotoxizität Wirkungen der verschiedenen Konzentrationen von MeOHGCM6 Extrakt und Betamethason auf U937-Monocytenzellen. Die Proliferationsrate von monozytischen U937-behandelten Zellen mit Konzentrationen von (A) MeOHGCM6 Extrakt und (B) Betamethason Erhöhung wurde durch Durchführen einer MTT-Assay über einen Zeitraum von 24 Stunden bestimmt. Der Prozentsatz der Zellproliferation ist vor der Anzahl der Zellen beimpft relativ die verschiedenen Dosen von MeOHGCM6 Extrakt und Betamethason zu verwalten. Die Konzentrationen von MeOHGCM6 Extrakt, der 30% (G130) verursacht werden, 50% (G150) und 70% (G170) von Zellproliferationshemmung wurden aus dem Grundstück (durch einen Pfeil angezeigt) hochgerechnet. Die Ergebnisse wurden als Median (25% und 75% Quartil) ausgedrückt aus zwei unabhängigen Experimenten.
Auswirkungen von MeOHGCM6 extrahieren Behandlung auf die TNF-α-Antwort-Ebene während der Differenzierung der U937-Zellen
Die Auswirkungen von MeOHGCM6 extrahieren Behandlung auf die Regulation der TNF-α-Antwort-Ebene während der Differenzierung U937 Zellen wurde mittels ELISA untersucht. Die TNF-α-Antwort Niveau erreicht einen Höchstwert von 43,28 ± 5,15 pg /ml bei 8 Stunden, wenn die U937-Zellen (5A) zu unterscheiden, induziert wurden. In Gegenwart von 10 ug /ml MeOHGCM6 Extrakt während der Differenzierung von U937-Zellen verringerte sich die TNF-α-Antwort Niveau signifikant bis 8 Stunden [0,14 ± 0,28 pg /ml (p
< 0,001)] und war vergleichbar mit jener beobachtet in Gegenwart von Betamethason [0,28 ± 0,56 pg /ml (p
< 0,001)]. Figur 5 MeOHGCM6 extrahieren Behandlung auf TNF-α Ansprechschwelle und TNF-α und IL-6-Gen-Expression während der Differenzierung der U937-Monocytenzellen. Die monozytischen U937-Zellen wurden induziert mit 10 nM PMA zu differenzieren. Während der Differenzierung wurden monozytären U937-Zellen mit MeOHGCM6 Extrakt behandelt. (A) Die TNF-α-Antwort-Ebene wurden unter Verwendung von ELISA quantifiziert. Die (B) TNF-α und (C) IL-6-Gen-Expressionsniveaus wurden mit qRT-PCR quantifiziert. Die Ergebnisse wurden als der Mittelwert ± S. D. ausgedrückt von quadruplicate Assays.
Auswirkungen von MeOHGCM6 extrahieren Behandlung auf die TNF-α und IL-6-Gen-Expression während der Differenzierung der U937-Zellen
Die Regulation der TNF-α und IL-6 durch MeOHGCM6 Behandlung während der U937-Zellen extrahieren Differenzierung wurde weiter bei der Genexpression Ebene mit qRT-PCR untersucht. Die TNF-α-Gen-Expressionsniveau erreichte nach 6 Stunden (3,16 ± 0,48 Kopien /Aktin) der U937-Zellen Differenzierung (5B). TNF-α-Gen-Expressionsniveau verringerte sich während der ersten 6 Stunden [0,52 ± 0,28 Kopien /Aktin (p
< 0,001)] von U937-Zellen Differenzierung in Gegenwart von 10 ug /ml MeOHGCM6 Extrakt. Die verringerte sich in der TNF-α-Gen-Expressionsniveau von U937-Zellen während der Differenzierung, wenn sie mit 10 ug /ml MeOHGCM6 behandelt wurde, vergleichbar mit oder besser als die Ergebnisse der Behandlung mit 10 nM Betamethason [0,55 ± 0,42 Kopien /Aktin (p
< 0.001)]. Die IL-6-Gen-Expressionsniveau zeigte einen signifikanten Anstieg und erreichte mit 0,68 ± 0,09 Kopien /Aktin nach 12 Stunden der U937-Zellen Differenzierung (5C). Abnahme der IL-6-Gen-Expressionsniveau wurde beobachtet, 0,10 ± 0,01 Kopien sein /Actin, 0,23 ± 0,02 Kopien /Aktin (p
< 0,01), 0,37 ± 0,04 Kopien /Aktin (p
< 0,001 ) und 0,45 ± 0,05 Kopien /Aktin (p
< 0,001) bei 3, 6, 9 und 12 Stunden, jeweils, wenn die U937-Zellen während der Differenzierung mit 10 ug /ml MeOHGCM6 Extrakt behandelt wurden. Die Hemmung der IL-6-Gen-Expressionsniveaus in der Gegenwart des MeOHGCM6 Extrakt war vergleichbar mit der von Betamethason.
Prophylaktische Behandlung Effekte von MeOHGCM6 Extrakt auf den Ratten Mageninhalt folgenden EtOH-induzierten akuten Schädigung der Magenschleimhaut
Magenschleim Sekretion wurden Magensaft Volumen und Magenschleim pH aus dem Mageninhalt von Rattenmagen mit MeOHGCM6 Extrakt folgenden EtOH Fütterungs behandelt vorbestimmt. 2,45 ± 0,25 g Magenschleim und 1,75 ± 0,20 ml Magensaft wurden aus dem Magen von Ratten nur mit dem Extrakt Verdünnungsmittel (Tabelle 2) zugeführt wird zurückgewonnen. 1,54 ± 0,31 g Magenschleim und 0,96 ± 0,25 ml Magensaft und 1,68 ± 0,19 g Magenschleim und 0,96 ± 0,16 ml Magensaft wurden aus Ratten vorbehandelt mit 250 und 500 mg /kg Körpergewicht gewonnen von MeOHGCM6 extrahieren sind. Im Vergleich, 2,31 ± 0,42 g Magenschleim und 1,15 ± 0,36 ml Magensaft wurde aus Ratten gewonnen mit 20 mg /kg b.w OMP vorbehandelt. 2,75 ± 0,49 g Magenschleim und 1,75 ± 0,28 ml Magensaft wurden von Ratten mit ähnlich hergestellten unabhängigen Pflanzenextrakt gewonnen, der als NSPE Kontrolle diente. Alle Autoren gelesen und genehmigt haben das endgültige Manuskript.

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• Genetische Variabilität in CYP3A4 und CYP3A5in primären Leber, Magen-und Darmkrebs-Patienten