Lactobacillus acidophilus aminora H. pylori inflamación gástrica inducida por inactivación de las vías de Smad7 y NFkB

Lactobacillus acidophilus
aminora H. pylori
inflamación gástrica inducida por inactivación de las vías de Smad7 y NFkB
Resumen Antecedentes

H. pylori
puede desencadenar Smad7 y NFkB expresión en el estómago , mientras que los probióticos promover la salud gastrointestinal y mejorar la inflamación intestinal causada por patógenos. Este estudio examina si los probióticos pueden mejorar H. pylori
inflamación gástrica inducida por inactivación de las vías de Smad7 y NFkB.
Resultados
Challenge con H. pylori
aumento de expresiones de TNF-α IL-8 y pero no TGF-β1 en las células MKN45. Los niveles de ARN de Smad7 en células AGS aumentaron después de H. pylori
infección de una manera dependiente de la dosis. Una dosis más alta (MOI 100) de L. acidophilus
pre-tratamiento atenúa los H. pylori
inducida por IL-8 expresiones, pero no TGF-β1. Tal efecto antiinflamatorio fue mediada a través de aumento de la I? B? Citoplasmática y el agotamiento de NFkB nuclear. L. acidophilus
también inhibió H. pylori
inducida por la transcripción de Smad7 mediante la inactivación de las vías JAK1 y Stat1, lo que podría activar la ruta /Smad TGF-β1. L. acidophilus
pretratamiento mejorado nivel de traducción Smad7 inducida por IFN-γ y posteriormente se reduce la producción nuclear NF-kB, detectada por Western Blot.
Conclusiones
H. pylori induce
Smad7, NFkB, IL-8 y TNF-α producción in vitro
. Las dosis más altas de L. acidophilus
pretratamiento reducir el H. pylori
la inflamación inducida por la inactivación de las vías de Smad7 y NFkB.
Antecedentes
Helicobacter pylori
infección se considera un factor importante la inducción de la gastritis crónica, úlcera péptica y cáncer gástrico, incluso en los seres humanos [1-3]. En los ratones y los estudios en humanos, la mucosa gástrica de H. pylori
sujetos infectados muestran hasta reguladas ruta de NF-kB y respuestas Th1 tipo de citoquinas [4-9], lo que puede perturbar la integridad de la barrera epitelial intestinal [10 ]. En consecuencia, la inactivación de la ruta de NF-kB y sus cascadas inmunes aguas abajo puede ser útil en la prevención de H. pylori
complicaciones inducidas graves.
Los probióticos son conocidos para inhibir patógenos entéricos le gusta Salmonella, Shigella
, y Citrobacter rodentium Hoteles en tanto in vitro y en animales modelos
[11-13]. Sus beneficios clínicos potenciales en la prevención o resolución de las enfermedades gastrointestinales se han puesto de relieve [14, 15]. Hay varios ¿Cuáles son los mecanismos por los que proporcionan protección intestino, incluyendo la disminución del valor del pH luminal mediante la producción de ácido láctico [16, 17] o al competir con los patógenos intestinales de receptores de la superficie de acogida [18]. No obstante, Coconnier et al. han demostrado que los probióticos pueden inhibir H. pylori
crecimiento independiente de pH y niveles de ácido láctico [19] mientras Tien et al. informar que Lactobacillus casei
puede regular a la baja Shigella flexneri
inducida por citoquinas proinflamatorias, quimiocinas y moléculas de adhesión mediante la inhibición de la ruta de NF-kB [12]. Otro mecanismo crítico que involucra los probióticos se refiere a los cambios en las respuestas del huésped inmune a la infección a través de reducción de TNF-α e IL-8, pero aumentó IL-10 [20, 21]. En cuanto a la breve contacto entre la flora de probióticos y el epitelio gástrico, una ingesta de probióticos por H. pylori
pacientes infectados tiene beneficios anti-inflamación resultante de un cambio en las respuestas inmunitarias del huésped.
Factor de crecimiento transformante (TGF ) -β1 regula negativamente células Th1 /tal que los ratones deficientes en TGF-beta 1 desarrollan espontáneamente la gastritis [22, 23]. Es bien aceptado que la vía de señalización de TGF-β1 está regulada positivamente por Smad asociada al receptor 2/3, pero negativamente por Smad7 [24, 25]. Según los informes, la infección por H. pylori
se asocia con una mayor expresión de Smad7 gástrico, pero los resultados controvertidos en los niveles de TGF-β1 [26, 27]. Estos sugieren que el TGF-β1 /Smad vía de señalización juega un papel importante en la inflamación intestinal. Sin embargo, el mecanismo exacto de los probióticos reductores H. pylori
inflamación gástrica inducida sigue sin estar claro. Por lo tanto, este estudio tuvo como objetivo examinar si los probióticos podrían regular la Smad- y mediada por NFkB vías de señalización para reducir la producción de citoquinas inflamatorias-aguas abajo después de la infección por H. pylori
.
Métodos
Líneas celulares y condiciones de cultivo
Este estudio fue aprobado por el Comité ético del hospital de la Universidad Nacional Cheng Kung (ER-98-208). Dos líneas celulares de cáncer epitelial gástrico humano (MKN45 y AGS) se obtuvieron de la investigación de la ciencia Banco de Recursos de Salud en Japón y mantuvieron en medio RPMI 1640 (GIBCO BRL, Grand Island, NY) y F-12 (Gibco BRL, Grand Island, NY) que contiene 10% de FBS a 37 ° C en una atmósfera humidificada (95%) con 5% de CO 2. Las células se subcultivaron cada dos días. Antes del estudio infección bacteriana, las células se incubaron en RPMI libres de antibióticos 1640 medio que contiene 10% de FBS durante una noche a 37 ° C en 5% de CO 2.
Bacterias y condiciones de cultivo
cepa bacteriana (HP238 se utilizó) aislado de un paciente clínico. El HP238 expresó proteínas CagA, VacA, y Baba en estudios anteriores [28, 29]. Las bacterias se mantuvieron en una placa de agar Brucella que contiene 10% de suero de caballo y se incubaron en condiciones de micro-aerophilic (10% de CO 2, 5% de O 2 y 85% N 2) para 24 a 48 horas. Las bacterias se transfirieron a PBS antes de infectar las células. densidad de crecimiento se midió espectrofotométricamente a 600 nm. La dosis infecciosa de bacterias fue de 1 × 10 8 bacterias /ml a una DO de
1. Las células MKN45 se infectaron con una multiplicidad de infección (MOI) 1-100 para diferentes períodos de tiempo. Una cepa probiótica, que figura en AB-yogur, Lactobacillus acidophilus gratis (LA5 ®, se originó en el Chr. Hansen, Dinamarca, proporcionada por el Presidente Corp., Tainan, Taiwán) se utilizó. Las bacterias se mantuvieron en un agar Brucella, se incubaron en condiciones anaerobias, y después se recogieron y se suspendieron en solución salina tamponada con fosfato (PBS) antes de la infección. La densidad viable de L. acidophilus
fue de 1 × 10 8 bacterias /ml a una DO de 1.
MKN45 viabilidad de las células después de la exposición a H. pylori Opiniones y L. acidophilus

La citotoxicidad de la exposición de células MKN45 a H. pylori Opiniones y L. acidophilus
se determinó por el porcentaje de lactato deshidrogenasa (LDH) fuga (Ensayo de citotoxicidad, Promega Co., Madison, WI, EE.UU.) y mediante la evaluación de células viables utilizando azul de cuenta no manchado de tripano. El sobrenadante del cultivo y las células restantes MKN45 se recogieron después de la incubación con dosis variables (MOI 1-1000) de L. acidophilus
y H. pylori
(MOI 100) durante 8 horas y 4, respectivamente. Los cultivos de células sin infección bacteriana sirvieron como controles. Los procedimientos se realizaron de acuerdo con los manuales de instrucciones y las células después de la infección con tinción con azul tripán no teñidas fueron contados directamente.
Ensayo ligado a enzimas inmuno-sorbente (ELISA) para citoquinas
Para determinar la dosis óptima y la incubación tiempo de varias bacterias, bacterias (H. pylori
y L. acidophilus
) se cultivaron con células MKN45 (MOI 1-100) en un medio RPMI 1640 libre de antibióticos (5 ml) que contenía 10% de FBS a 35 ° C en condiciones micro-aerophilic para un máximo de 8 horas. En el estudio experimental, L. acidophilus
se añadieron a células MKN45 y se incubaron durante 8 horas en las mismas condiciones. Después de PBS lavado y eliminación de los bacilos, un volumen igual de H. pylori
se añadió y se incubaron las células durante otras 4 horas. El sobrenadante de cultivo final se centrifugó a 12.000 rpm durante 5 min para eliminar las bacterias y restos celulares. Las concentraciones de TNF-α, IL-8 (R & D System, Minneapolis, MN), y TGF-β1 (eBioscience, San Diego, CA) se midieron por ELISA de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La absorbancia de cada micro-placa se leyó en un espectrofotómetro utilizando 450 nm como longitud de onda primaria y 570 nm como longitud de onda de referencia. Todos los ensayos se realizaron por triplicado.
Preparación de extractos nucleares y citoplasmáticas
Las células MKN45 y AGS fueron pre-tratados con L. acidophilus
durante 8 horas, seguido de varias dosis de H. pylori para
1 hora; a continuación, los extractos citoplasmáticos y nucleares se aislaron por un extracto Kit Nuclear (Active Motif, Japón). Brevemente, las células se lavaron con inhibidores de la fosfatasa solución salina enfriada con hielo que contienen y se sedimentaron. Los pellets celulares se resuspendieron en un tampón hipotónico y se incubaron durante 15 min en hielo. Ellos se lisaron mediante la adición de detergente y se agitó vigorosamente durante 10 s. Después de que los núcleos se sedimentaron y se resuspendieron en tampón de lisis completa, el tubo se agitó vigorosamente a 4 ° C durante 30 min en una plataforma de agitación. Los extractos nucleares se centrifugaron a continuación y los sobrenadantes se dividen en partes alícuotas y se almacenaron a -80 ° C.
RT-PCR para citoplasmática Smad7
ARN total fue aislado de células MKN45 utilizando un kit comercial (ImProm-ll ™ System transcripción inversa , Promega, EE.UU.) después de H. pylori Opiniones y L. acidophilus
incubación. El RNA se cuantificó mediante la determinación de la absorbancia a 260 nm. Una μ
g de ARN se convierte en cDNA, que se almacenó a -72 ° C hasta su uso. Las secuencias de los cebadores Smad7 humanos eran adelante 5'-CATCACCTTAGCCGACTCTG-3 'y revertir 5'GTCTTCTCCTCCCAGTATGC-3', generando un fragmento de 224 pb [30]. Para Jak1 y Stat1, las secuencias de los cebadores eran adelante 5'-GCAGCCAGCATGATGAGA-3 'y 5'-GTGGACGAGGTTTTGTAAGGA-3' y 5'-revertir CTCGGAAGAAAGGCCTCTG-3 'y 5'-CAGACACAGAAATCAACTC-3', los fragmentos de generación de 607 pb y 518 pb, respectivamente [31, 32]. La condición de la PCR fue el siguiente; 95 ° C durante 5 min, seguido de 25 ciclos de 95 ° C durante 1 min, 56 ° C durante 1 min, y 72 ° C durante 1 min, y finalmente 72 ° C durante 7 min. El primer secuencias de β-actina humana fue adelante 5'-GTCTTCCCCTCCATCGTG-3 'y revertir 5'-GTCATCTTCTCGCGGTTG-3', generando un fragmento de 272 pb. Las condiciones de amplificación fueron las siguientes:. 95 ° C durante 5 min, y luego un ciclo de 20 de 95 ° C durante 1 min, 50 ° C durante 1 min, 72 ° C durante 1 min, y 72 ° C durante 7 min
Western blot para NF-kappa B, I? B-α y Smad7
interferón gamma (IFN-γ) (PeproTech Inc., NJ, EE.UU.) 50 l (100 ng /ml) se añadió a cada placa en los estudios experimentales. Los extractos citoplásmicos y nucleares se lavaron con hielo-PBS frío y se lisaron en un ml y tampón de lisis (150 mmol /l de NaCl, 20 mmol /l de Tris, pH 7,5, 0,1% Triton X-100, 1 mmol /l de fenilmetilsulfonilo 0,5 /fluoruro [PMSF] y 10 mg /ml de aprotinina), modificado a partir de los informes de Kim et al. y la Luna et al. [33, 34]. Las concentraciones de proteína en los lisados ​​se determinó utilizando el kit de ensayo de proteínas Pierce BCA (Thermo Scientific, EE.UU.). La proteína /carril 10 mg fue entonces de tamaño fraccionado en un desnaturalizante, no reductor 10% minigel de poliacrilamida y se transfirieron electroforéticamente a fluoruro de polivinilideno (PVDF) (0,45-micras de tamaño de poro) (Millpore Corparation, EE.UU.). Proteínas
específicos fueron detectado a través de conejo antihumano p65 NF-kB, conejo anti-humano de I? B-α (1: 1000, Cell Signaling, Boston, MA, EE.UU.), y Smad7 antihumano de ratón (1: 500, R & D System, EE.UU., MN ) como anticuerpos primarios, y IgG anti-conejo conjugado con peroxidasa, anti-IgG de ratón (1: 10.000) como un anticuerpo secundario. Específicamente peroxidasa unida se detectó por quimioluminiscencia HRP Sustrato (sistema ECL, Millpore Corparation, EE.UU.) y después se expone a los rayos x (GE Healthcare, Reino Unido) durante 10-30 s. El análisis estadístico

de t
prueba y
prueba de t pareada se utilizaron, según corresponda, por las diferencias paramétricas. se aplicó un análisis de una vía de la varianza (ANOVA) con la corrección de Bonferroni para el ensayo múltiple de los datos. Se utilizó la prueba de Mann-Whitney U
prueba de la diferencia entre los datos no paramétricos, mientras que se utilizó χ página 2 la prueba de Pearson para la diferencia de proporciones no paramétrico. Todas las pruebas fueron de dos colas y un P Hotel < 0,05 fue considerado estadísticamente significativo.
Resultados
viabilidad de las células después de la incubación con H. pylori Opiniones y L. acidophilus
The citotoxicidad y la viabilidad de las células MKN45 incubadas con H. pylori gratis ( MOI 100) y L. acidophilus gratis (MOI 1-1000) se determinaron mediante la evaluación del porcentaje de fuga de LDH y azul tripán no manchado en el 4 y 8 º horas, respectivamente (Tabla 1 ). Plasma daño de la membrana evaluada mediante el porcentaje de fuga de LDH de MKN45 después de H. pylori
incubación (18,1%) no fue diferente a las de las células de control (18,0%). Además, el recuento de células viables calculado por azul de tripano no manchado no disminuyen significativamente. Cuando L. acidophilus
se incubó con células MKN45 durante 8 horas, la citotoxicidad y recuento de células viables a MOI 1 a 100 no se vieron afectados significativamente. Sin embargo, LDH fugas y la muerte celular aumentó ligeramente como la incubación con MOI 1,000 durante 8 horas. Por lo tanto, la dosis óptima de las bacterias utilizadas para el estudio experimental se limitó a MOI 100.Table citotoxicidad 1 de la célula y el recuento de células viables de MKN45 después de co-incubación con H. pylori
y L. acidophilus
determinado por el porcentaje de pérdida de LDH (por triplicado) y no manchado azul de tripano (individual)
Las bacterias y MOI
Cytotoxicitya (LDH%) guía empresas de células viables count (× 106) guía empresas celular sólo para 4 y 8 horas
18.0, 18.0
1,36
H. pylori
durante 4 horas
MOI 100
18,1
1.00
Lactobacillus Opiniones de 8 horas
MOI 1

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