Verband der verminderten Expression von RASSF1A mit Promotor-Methylierung in primären Magenkrebs von Patienten mit zentralen China

Vereinigung der verminderten Expression von RASSF1A mit Promotor-Methylierung in primären Magenkrebs von Patienten von zentralen China
Zusammenfassung
Hintergrund
Obwohl methylation- vermittelte Inaktivierung der Expression von RASSF1A, einem Gen Kandidaten Tumorsuppressor, wurde in mehreren menschlichen Krebsarten beobachtet wurde, sind die Daten über die Änderung des RASSF1A Expression und Methylierung in Chinese primären Magenkrebs selten. Darüber hinaus fehlt es den Zusammenhang zwischen Proteinexpression von RASSF1A und primären humanen Krebserkrankungen direkten Beweis zeigt. Das Ziel dieser Studie war es RASSF1A Expression in Gewebe von primären Magenkrebs (GC) auf mRNA und Protein-Ebene zu untersuchen und die mögliche Beziehung zwischen DNA-Methylierungsstatus und Proteinexpression von RASSF1A in Chinesisch.
Methoden zu etablieren
vierundfünfzig Patienten mit primärem Magenkrebs wurden in der Studie von RASSF1A mRNA-Expression und Methylierungsstatus zwischen dem Krebsgewebe und dem entsprechenden benachbarten normalen Gewebe eingeschlossen. 20 von 54 Patienten wurden für die Studie von RASSF1A Proteinexpression enthalten. Die Expression von RASSF1A an mRNA und Protein-Spiegel wurde durch RT-PCR und Western-Blotting bestimmt, respectively. Die RASSF1A Promotor-Methylierung wurde durch Methylierung-spezifische PCR nachgewiesen
Ergebnisse | RASSF1A mRNA und Proteinexpression in GC waren signifikant mit Vergleich zu den entsprechenden normalen Geweben (OD-Wert reduziert. 0,2589 ± 0,2407 vs 0,5448 ± 0,2971, P
< 0,0001; 0,1874 ± 0,0737 vs 0,6654 ± 0,2201, P
< 0,0001, respectively). Methylierungshäufigkeit RASSF1A in primären GC ist höher als die in den entsprechenden normalen Geweben (66,7% vs. 14,8%, P
< 0,0001). Weiterhin wurde RASSF1A mRNA-Expression in Methylierungs Gruppe von GC weiter reduziert im Vergleich zu dem unmethylation Gruppe von GC (0,1384 ± 0,1142 0,5018 ± 0,2463 vs., P
< 0,0001)
Schlussfolgerung
Expression von RASSF1A. in Gewebe von GC wurde an mRNA und Protein-Niveau reduziert. Verminderte Expression von RASSF1A wurde mit dem Promotor-Methylierung in Verbindung gebracht.
Hintergrund
Magenkrebs (GC) ist eine der häufigsten bösartigen Erkrankungen bei Magen-Darm-Erkrankungen ist. Obwohl Inzidenz von GC ist in den entwickelten Bezirken rückläufig ist, ist es immer noch eine der häufigsten Todesursachen von Krebserkrankungen in den meisten Entwicklungsländern. Sowohl genetische und Umweltfaktoren, einschließlich H. pylori Infektion
wurden zur Entwicklung der GC beizutragen betrachtet. Kürzlich haben mehrere Studien gezeigt, dass die Stille von Tumorsuppressorgenen von epigenetischen Modifikation ein grundlegender Mechanismus zur Inaktivierung von krebsbezogenen Genen in der Pathogenese von Krebs beim Menschen [1]. Des Besonders bemerkenswert ist die Tatsache, dass Promotor hypermethylation eine wesentliche Rolle in der Funktionsverlust von Tumorsuppressorgenen spielt.
Allelische Verlust auf Chromosom 3p21.3 ist eine der häufigsten genetischen Veränderungen, die in verschiedenen Arten von menschlichen Krebserkrankungen [2 ]. In den späten 90er Jahren, Dammann [3] und Burbee [4] et al identifiziert RASSF1A, ein neues Gen aus dem gemeinsamen homozygote Deletion Bereich bei 3p21.3. Dieses Gen Homologie zu Säugetier-RAS-Effektoren. Es gibt sieben RASSF1 Isoformen (A bis G) erzeugt durch alternatives Spleißen RASSF1A gezeigt wurde Tumorigenität in vivo zu reduzieren und wird in einer Vielzahl von primären humanen Tumoren häufig inaktiviert. Genetische Mutationen in dieser Isoform sind selten. Es wird, dass epigenetische silencing of RASSF1A assoziiert mit CpG islands Methylierung der Promotorregion bekannt. Bisulfate DNA-Sequenzierung hat gezeigt, dass Hypermethylierung der Promotorregion RASSF1A Expression in den wichtigsten Krebserkrankungen des Menschen inaktiviert. Dies wird durch die Beobachtung von re-expression of RASSF1A in verschiedenen Krebszelllinien, behandelt mit Demethylierungsagenzien unterstützt [4-7]. Bis heute haben mehrere Studien die Anwesenheit von anomalen Promotor-Methylierung von RASSF1A und Verlust oder abnormal niedrige Expression von RASSF1A in primären GC gezeigt, was darauf hindeutet, dass die Inaktivierung von RASSF1A Expression eng mit dem Promotor-Methylierung [5, 8-10] verbunden ist. Nach unserem Kenntnisstand, über keine Daten, die die Expression von RASSF1A und Methylierungsstatus in GC in der chinesischen Bevölkerung zur Verfügung. In der vorliegenden Studie haben wir die Expression von RASSF1A sowohl auf mRNA und Protein-Ebene bestimmt, und ihre Verbindung mit RASSF1A Methylierungsstatus in der chinesischen primären GC im zentralen China fördern.
Methods
Patienten
Vierundfünfzig Patienten mit primären GC wurden in der Wuhan Universität Zhongnan Hospital und der Provinz Hubei Cancer Hospital von Dezember 2003 bis Juni 2005 registriert und alle Patienten kurative Resektion mit systematischer Lymphknotendissektion unterzogen. GC Gewebe und entsprechenden angrenzenden normalen Magengewebe wurden aus dem operativen Geschäft vor der Chemotherapie erhalten. Die eingeschlossenen Patienten 35 Männer und 19 Frauen, Alter 57,6 ± 13,7 Jahre (Bereich 30 bis 85 Jahre) bedeuten. Diagnose und Differenzierungen von GC wurden durch histopathologische Untersuchungen und der TNM-Klassifikation bestimmt. Die demographischen und klinisch-pathologischen Daten der Patienten sind in Tabelle 1 Unter 54 Patienten mit GC zusammengefasst, 20 Fälle wurden für die Studie der Proteinexpression von RASSF1A enthalten. Das Protokoll der Studie wurde von der Ethikkommission der Universität Wuhan Zhongnan Krankenhaus genehmigt. Tumor und benachbarten normalen Geweben zum Zeitpunkt der Operation erhalten wurden, schockgefroren in flüssigem N 2 und bei -80 ° C bis zur Verwendung gelagert. E und wurden von zwei erfahrenen pathologists.Table 1 Verband der RASSF1A Methylierung des Gens mit Demografie und klinisch-pathologischen Eigenschaften von primären Magenkrebs untersucht (n = 54)
<; Probenabschnitte wurden in H &gefärbt col>
Methylierungs
P-Wert
OR (95% CI)

Ja
Nein


Geschlecht
männlich
24
11
0.766
1,273 (0.393 ~ 4.117)
weiblich
12
7
Alter
< 60
17
13
0.145
0.344 (0.101 ~ 1.167)
≥ 60
19
5
Tumorstellen
Antrum
14
7
Körper und Herz-
22
11
1.000
1.000 (0.313 ~ 3.192)
frühen Stadien
1 2
0,255
0,229 (0,019 ~ 2,708) auf
35 fortgeschrittene
16
Lymphknotenmetastase
ja
22
7
0.154
2,469 (0,774 ~ 7,882 )
keine
14
11
Fernmetastasen
ja
5 seite 1 von 0.651
2.742 (0.296 ~ 25.424)
kein
31
17
Differenzierungen
gut und moderate
18
12
0.384
0,500 (0,154 ~ 1,624)
schlecht
18
6
Lauren
intestinalen Typ
12 10
0.148
0,400 (0,125 ~ 1,275)
Typ Diffuse
24
8 DNA und RNA-Extrakt
DNA aus gefrorenen Geweben wurde durch Phenol /Chloroform und Ethanolfällung gereinigt und in 50 ul destilliertem Wasser und gelagert bei -20 ° C bis zur Verwendung gelöst. Die Gesamt-RNA wurde unter Verwendung der Trizol-Kits (Molecular Research Center Inc., Cincinnati, USA) isoliert nach den Anweisungen des Herstellers.
Semi-quantitative RT-PCR
Drei Mikrogramm Gesamt-RNA wurden revers transkribiert unter Verwendung von RevertAid ™ ersten Strang cDNA-Synthese-Kit (Fermentas Inc., Vilnius, Litauen). Alle Gesamt-RNA wurden durch DNase behandelt Kontamination von genomischer DNA zu vermeiden. und GAPDH-Gens (GenBank Accession #: NM_002046): Die Primer für RASSF1A und Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase (GAPDH) wurden basierend auf RASSF1A Gens (GenBank Accession # NM_007182) ausgelegt. Die Primer für RASSF1A waren 5'-CTT TTA CCT GCC CAA GGA TGC-3 'und 5'-CAC CTC CCC AGA GTC ATT TTC C-3'. Die Primer für GAPDH (5'-CAT GAC TTT AAC GGT ATC GTG-3 'und 5'-GTG TCG CTG TTG AAG TCG TCA GA-3') wurden als interne Kontrolle verwendet. Die thermischen Zyklen waren: 94 ° C für 5 min, gefolgt von 35 Zyklen von 94 ° C für 30 Sekunden, 55 ° C für 45 s und 72 ° C für 60 Sekunden und schließlich 72 ° C für 5 Minuten zur Verlängerung. Die PCR-Produkte wurden in 2% Agarose-Gel-Elektrophorese in und visualisiert Anfärbung mit Ethidiumbromid getrennt und quantifiziert, ein Bildanalysesystem (UVP Bioimaing Systems, USA) verwendet. Die erzeugten PCR-Produkte wurden 265bp für RASSF1A und 370 bp für GAPDH. Die optische Dichte (OD) Wert der mRNA-Expression wurde berechnet.
Bisulfat Modifikation
DNA von Tumorgewebe und entsprechenden benachbarten normalen Geweben wurden Bisulfat Behandlung unterzogen nach Herman et al [11]. 2 &mgr; g genomischer DNA in 50 ul suspendiert kurz, destilliertes Wasser, denaturiert mit 0,2 M NaOH für 10 min bei 37 ° C und fügte 30 ul frisch hergestelltem 3 M Natriumhydrogensulfat (pH 5,0). Die Proben wurden über mit Mineralöl überlagert Oberfläche der wässrigen Phase zu bedecken, und 16 ~ 20 h bei 50 ° C inkubiert. Die DNA-Probe wurde durch eine Säule von Wizard DNA-Reinigungssystem (Promega, Wisconsin, USA) entsalzt nach den Anweisungen des Herstellers. Die Proben wurden mit 0,3 M NaOH für 5 min bei Raumtemperatur und mit Ethanol präzipitiert behandelt. Das Hydrogensulfat-modifizierte genomische DNA wurde in 50 ul TE-Puffer (10 mM Tris · Cl, 1 mM EDTA, pH 7,6) und bei -80 ° C zum Einsatz.
Methylierungsspezifische PCR (MSP) resuspendiert
der Methylierungsstatus von RASSF1A wurde von MSP bestimmt. Hydrogensulfat Behandlung von genomischer DNA wandelt in Uracil Cytosin aber keinen Einfluss auf Methylcytosin hat. Die spezifische PCR wurde dann zwischen methylierten und nicht-methylierten DNA-Sequenzen in einer HotStar TaqE PCR-Maschine (Takara Bio, Co., Ltd., Tokyo, Japan) zu unterscheiden, verwendet. Die Primer für die methylierte Form waren 5'-GGG TTT TGC GAG AGC GCG-3 'und 5'-GAT AAC AAA CGC GAA CCG-3' und die Primer für die nicht-methylierte Form waren 5'-GGG GTT TTG TGA GAG TGTG -3 'und 5'-ACT AAC AAA CAC AAA CCA AAC-3' (Gene Bank Beitritt: AC002481). Die PCR-Bedingungen bestanden aus einer Inkubation von 15 min bei 95 ° C, gefolgt von 40 Zyklen einer 30 Sekunden Denaturierung bei 94 ° C, 50 sec bei einer Annealing-Temperatur (64 ° C für methylierte und 59 ° C für unmethylierte spezifische Primer) und eine 30 Sekunden Verlängerung bei 72 ° C und eine abschließende Extension bei 72 ° C für 10 min. PCR-Produkte wurden in 8% Polyacrylamid-Gelen in der Elektrophorese getrennt. Genomische DNA, in vitro methyliert durch CpG-Methyltransferase (SSS I) nach den Anweisungen des Herstellers (New England BioLabs, Inc., Beverly, MA), wurde als positive Kontrolle verwendet. Leerwert wurde als negative Kontrolle verwendet. Jeder Primer-Set erzeugt ein 169 bp-Produkt.
Western-Blot
Fünfzig mg Proben wurden homogenisiert und für 10-15 min in eiskaltem 50 mM HEPES-Puffer (pH 7,4), der 150 mM NaCl bei 12.000-15.000 g zentrifugiert , 50 mM Tris · Cl (pH 8,0), 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 2 mM PMSF, 5 ug /ml Leupeptin, 1% NP-40 und 10% Glycerin. Überstand wurde gesammelt und die Proteinkonzentration wurde dann BSA als Standard nach dem BCA Protein Assay Reagent gemessen (Pierce Biotechnology., Inc., Rockford, USA). Gleiche Mengen (100 &mgr; g) des Gesamtproteins aus Gewebe wurden auf SDS-Polyacrylamidgelen (10% Gel) und an Polyvinylidendifluorid (PVDF) Filtermembranen für 30 min bysemi-dry blotting elektrophoresiert. 100 Verdünnung des: Die Membranen wurden für 2 h bei Raumtemperatur mit der Blocklösung in dem ECL-Kit (Protein Detector LumiGLO Reserve ™ Western Blotting Kit, KPL, Maryland, USA), und dann inkubiert für 45 min mit einem 1 vorgesehen blockiert primäre Antikörper an RASSF1A. Der primäre Antikörper für Western-Blot-Analyse verwendet wurde, war eine affinitätsgereinigtem Ziege polyklonalen Antikörper gegen RASSF1A, C-12 (SC-18724, Santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz, Calif., USA). Die PVDF-Membranen wurden dann für 30 min gewaschen, wobei eine Waschlösung, gefolgt von einer 1 h Inkubation mit anti-Ziegen-Antikörper, konjugiert an Meerrettichperoxidase in Blocklösung (Kaninchen anti-Ziege-IgG, Chemicon Internation, Inc., Temecula, Kalifornien, USA ). ThePVDF Membranen wurden wieder gewaschen, und die immunreaktiven Banden wurden durch verstärkte Chemilumineszenz nachgewiesen und durch Bildanalysesystem visualisiert (Bio-Rad Laboratories, Inc. Hercules, CA, USA). GAPDH (Abcam Biotechnology, Cambridge, UK) wurde als Kontrolle verwendet.
Statistische Analyse
Statistische Analysen der SPSS11.5 Software durchgeführt wurden unter Verwendung von (SPSS Inc., Chicago, IL). Die Unterschiede zwischen den Variablen wurden durch Chi-Quadrat-Test oder t-Tests beurteilt die Daten nach. Die statistische Signifikanz der Unterschiede wurde als P
<gesetzt; 0,05.
Ergebnisse
RASSF1A mRNA-Expression in Magenkrebs
RASSF1A mRNA-Expression in 54 GC Gewebe betrug 50% derjenigen in den benachbarten entsprechenden normalen Gewebe, die deutlich gegen reduziert war in Tumoren mRNA-Expression zeigte, mit der die normalen Gewebe, wie in gezeigt. 1. Abbildung 1 Expression von mRNA in RAASF1A primären Magenkrebs (T) und die entsprechenden normalen Gewebe (N). RT-PCR-Produkte für RASSF1A quantifiziert wurden durch densitometrische Abtastung von in Ethidiumbromid-gefärbten Gelen im Vergleich mit GAPDH.
RASSF1A Proteinexpression in Magenkrebs
Konsistente der Abnahme der mRNA-Expression zeigt 2, dass die Proteinexpression in Tumore war nur 21,4% derjenigen in normalen Geweben, die vorgeschlagen, dass der Proteingehalt von RASSF1A Expression auch mit Vergleich zu den entsprechenden normalen Geweben reduziert wurde. Figur 2 Proteinexpression von RASSF1A in primären Magenkrebs (T) und die entsprechenden normalen Gewebe (N). Proteingehalt von RASSF1A wurde quantifiziert durch Western-Blotting verglichen mit GAPDH.
RASSF1A mRNA-Expression und DNA-Methylierung in Promotor des RASSF1A Gens in primären
Magenkrebs Wie in gezeigt. 3, Methylierung von RASSF1A Frequenz in GC war 3,5-fach höher als die in den entsprechenden normalen Geweben (66,7% gegenüber 14,8%, P < 0,0001). RASSF1A mRNA-Expression zwischen Methylierung und unmethylation Gruppen in GC waren signifikant unterschiedlich, das erstere ist 2,6-fach niedriger als die letztere (0,1384 ± 0,1142 vs 0,5018 ± 0,2463, P
< 0,0001). Die Ergebnisse zeigten, dass hypermethylation in der CpG-Insel in der RASSF1A Promotor stark mit deutlich reduzierten mRNA-Expression von RASSF1A zugeordnet ist. Abbildung 3 Methylierung von RASSFIA in primären Magenkrebs und entsprechenden normalen Gewebe von MSP. Spur 3, 4 und Spur 6, 7 zeigen ein repräsentatives Ergebnis von einem Tumor und normalen Probe, respectively. U: amplifizierte Produkt mit Primer unmethylierten Sequenzen zu erkennen; M: amplifizierte Produkt mit Primer methylierte Sequenzen zu erkennen. Genomische DNA, in vitro methyliert durch CpG-Methylase (SSS I) wurde als positive Kontrolle verwendet. Leerwert wurde als negative Kontrolle verwendet. Die PCR-Produkte wurden auf einem 8% igen Polyacrylamidgelen aufgelöst
Assoziation zwischen Methylierung und klinischen Parametern von Magenkrebs
Die Assoziation zwischen Promotor-Methylierung und relevanten demographischen und klinisch-pathologischen Merkmale wie Geschlecht, Alter, Tumorstelle, Lymphknotenmetastasen, entfernt Metastasierung, Differenzierung, Bühne und Art des Lauren sind in Tabelle 1 Es gab keinen signifikanten Zusammenhang zwischen Promotor-Methylierung und der klinisch-pathologischen Parameter gezeigt.
Diskussion
in der vorliegenden Studie haben wir nachgewiesen, dass RASSF1A Expression in GC wurde auf mRNA reduziert und Protein-Ebene und die Methylierung der Promotorregion des RASSF1A Gens war 3,5-fach häufiger in primären GC als in normalem Gewebe entspricht. Darüber hinaus war die Inzidenz von GC Patienten mit RASSF1A Promotor methyliert über unmethylierte 2-fach höher. Diese legen nahe, dass die Expression in RASSF1A GC wurde stark mit dem Promotor Methylierungsstatus des RASSF1A Gens assoziiert. Um die Beziehung zwischen der Expression von RASSF1A und die Methylierung des Promotors zu bestätigen, verglichen wir RASSF1A mRNA-Expression zwischen Methylierung und unmethylation Geweben in GC, und fanden, dass aberrante Methylierung des RASSF1A Gens Promotorregion ist für die Verminderung oder den Verlust von RASSF1A mRNA Expression in primären GC. Unsere Studie war mit einer Studie im Einklang, die zeigte, dass 45,6% primäre GC hatten keine oder ungewöhnlich niedrige mRNA-Expression von RASSF1A [5]. Unter 30 angepaßten Sätzen von denselben Patienten 73,3% der GC wurde gefunden, reduziert RASSF1A Expression zu haben [5]. Nach unserem Kenntnisstand keine Studie von RASSF1A Proteinexpression in GC wurde berichtet. Wir analysierten weiter RASSF1A Expression auf Proteinebene mittels Western-Blot in 20 GC-Patienten und gefunden, daß die Protein-Expression in Tumoren nur 21,4% der Expression in normalen Geweben ist. Dieses Ergebnis zeigte, dass RASSF1A Proteinexpression in GC war signifikant niedriger als in benachbarten normalen Geweben entspricht. Dies ist auf die mRNA-Expression von RASSF1A konsistent.
Der Mechanismus reduziert oder RASSF1A Expression zum Schweigen gebracht könnte durch Promotor-Methylierung und /oder Mutation von RASSF1A Gen verursacht werden. Jedoch haben mehrere Studien gezeigt, dass die Mutation des RASSF1A Gens ist sehr selten [4, 5, 7, 12, 13]. Somit wird RASSF1A Gen wahrscheinlich durch Mechanismen der methyltion inaktiviert. Byun et al [5] festgestellt, dass von 41 primären GC mit Verlust oder abnormal Reduktion von RASSF1A Expression, 39 methyliert wurden, während in den beiden GC und normalen Geweben mit normalen RASSF1A Expression keine methyliert. Um et al [10] zeigten, dass Hypermethylierung des RASSF1A Promotors wurde in 25,8% der GC und in 11,1% der Magen-Darm-Metaplasie (IM) bzw. gefunden. Unsere Daten zeigen, dass die Häufigkeit von RASSF1A Methylierung in GC war höher als die obigen Daten berichtet. GC ist sehr weit verbreitet in China und hohe Methylierung von RASSF1A erklären kann zum Teil der Grund dafür, warum GC Inzidenz ist in den chinesischen höher. Interessanterweise ist die Tatsache, dass RASSF1A Promotor-Hypermethylierung höher in EBV positiven GC als in EBV negativen Karzinom (66,7% vs. 3,6%) kann eine enge Verbindung zwischen EBV und anomale Methylierung in GC vorschlagen. Tatsächlich hat sich einem früheren Bericht darauf hingewiesen, dass die virale Onkogenese abweichende Methylierung beinhalten könnte, was zu einer Inaktivierung von Tumorsuppressor-Gene [9].
Wir fanden, dass die Methylierungsfrequenz von RASSF1A in primären GC und in den entsprechenden normalen Geweben waren 66,7% und 14,8% entspricht. Unsere Daten zeigten, dass von 54 GC-Patienten 36 methyliert waren und 18 waren nicht methylierten, methylierte GC was darauf hindeutet, mehr üblich ist, im Einvernehmen mit den anderen Berichten. Die früheren Studie [14] vorgeschlagen, dass der Magen ist eine der normalen Geweben mit einer hohen Frequenz von alterungsbedingten Methylierung und Magenkrebs ist eine der Tumoren mit einer hohen Frequenz von CpG-Insel-Methylierung. Kang et al [15] untersuchten den Methylierungsstatus von 11 Genen in nichtneoplastische Magenschleimhaut und sie fanden, dass anomale CpG-Insel-Methylierung aufgetreten häufig bei chronischer Gastritis, die Alterung Beziehung zeigte, und dass altersbedingte Methylierung Gen typspezifisch. RASSF1A Gen wurde selten methyliert, ohne Alterung Beziehung. Darüber hinaus werden weitere Autoren berichtet [3-5], dass in normalen Geweben wurden keine methylierte RASSF1A Allele nachgewiesen. Jedoch zeigten unsere Daten, dass die RASSF1A Methylierung frenquency in den entsprechenden normalen Geweben, war hoher Anteil (14,8%). Die Diskrepanz zwischen unseren Daten und anderer Autoren kann der Differenz der Proben zurückzuführen sein, die wir untersucht die nicht-nesoplasia Magengewebe bei Patienten mit Magenkrebs waren, und es ist sehr wahrscheinlich, chronische Gastritis Gewebe zu schließen, vor allem intestinale Metaplasie Gewebe im angrenzenden normalen Gewebe entspricht. Die früheren Studie berichtet, dass mehrere Gene bei chronischer Gastritis, vor allem in intestinale Metaplasie Gewebe häufig methyliert waren. Zu et al [10], um die 8 tumor-verwandtes Gen Methylierungsstatus einschließlich RASSF1A in Magen intestinale Metaplasie bei Patienten mit und ohne Magenkrebs untersucht und fanden sie, dass die Häufigkeit der Methylierung in RASSF1A in Krebs und intestinale Metaplasie waren 25,8% und 11,1% , beziehungsweise. Das Ergebnis war im Einklang mit unseren. In der Tat, sequenziert wir die MSP-Produkte für mehrere Proben. Die Sequenz wurde im Einklang zu der Sequenz vorhergesagt (Daten zeigen nicht). Wir fanden heraus, dass nicht-methylierten Bands immer mit methylierten Bands in den meisten primären GC koexistieren und angrenzenden normalen Gewebe trotz der Verringerung oder den Verlust von RASSF1A Ausdruck, im Einklang mit früheren Berichten [4, 10] entspricht. Dies wird höchstwahrscheinlich diese reseziert Tumoren wurden nicht microdissected und wurden mit Stromazellen kontaminiert. Darüber hinaus ist MSP extrem empfindlich. Bai et al [16] haben, dass die Detektion dieser beiden Bänder entweder intra-allelische Heterogenität der CpG-Insel-Methylierung oder Methylierung der Insel stellt aus Allel variierende Allel. Alternativ könnte unser Ergebnis zeigen, dass partielle Methylierung des RASSF1A Gen-Promotor genug, um die Gentranskription zu verstummen, da der Verlust eines einzigen Genkopie ausreichend ist, die Tumorbildung zu fördern [17, 18]. Tommasi et al [19] beobachtet, dass heterozygote RASSF1A Knockout-Mäuse waren deutlich Tumor anfällig, sowohl für spontane Tumorbildung und für die chemisch induzierten Tumoren. Dies könnte darauf hindeuten, dass das RASSF1A Gen die Eigenschaften verleihen Haploinsuffizienz hat, wenn nur ein Allel verloren.
Wir haben auch die Assoziation zwischen Promotor-Hypermethylierung und relevanten klinisch-pathologische Parameter einschließlich Alter und Geschlecht der Patienten, Ort des Karzinoms, histologische Differenzierung zu untersuchen, Lauren Art und Metastasierung von GC. Wir fanden, dass Häufigkeit der Methylierung von RASSF1A Gens in fortgeschrittenen Tumoren deutlich höher war im Vergleich mit frühen Stadium Tumoren (68,6% gegenüber 33,3%) und höhere in schlecht differenzierten Tumoren (75% vs 60%), wenn sie mit gut verglichen und mäßig differenzierten Tumoren . Doch diese Unterschiede nicht statistisch signifikant. Byun et al [5] haben gezeigt, dass die Inaktivierung von RASSF1A mit Tumorstadium und Grad korreliert aber nicht mit histologischen Typen von Tumoren. Die Diskrepanz kann durch die begrenzte Proben für frühe GC in unserer Studie erklären.
Transfection of RASSF1A Gens das Wachstum von menschlichen Krebszellen in vitro und in vivo [3, 4] reduziert, was eine Rolle für RASSF1A als Tumor-Suppressor-Gen trägt. RASSF1A RAS Aktivierung kann Heterodimerisierung von RASSF1A und die neue Ras-Effektor (NORE1) erfordern und mit Ras, NORE1, den Verbinder Enhancer des KSR (CNK) und die pro-apoptotische MST1 kinase [20] Apoptose durch seine Wechselwirkung induzieren. Mehrere Gruppen haben berichtet, dass RASSF1A ein Mikrotubuli-bindende Protein und mitotischen Progression reguliert [21-25] und RAS wie kleine GTPase-Proteine ​​in Signaltransduktionswege fungieren beteiligt sind. Tommasi et al [19] hat gezeigt, dass RASSF1A
- /- und RASSF1A +/-
Mäusen Tumorhäufigkeit erhöht und Größe des Tumors, was darauf hindeutet, die Rolle von Tumorunterdrückung von RASSF1A, die ihre häufige epigenetische Inaktivierung erklären kann in menschlichen Tumoren.
Fazit Zusammengefasst
wurde die Expression von RASSF1A zu einem anormalen Niveau deutlich reduziert oder vollständig in Primär GC im Vergleich mit benachbarten normalen Gewebe verloren und wurde zu Hypermethylierung des Promotors des RASSF1A Gens korreliert. Weitere Arbeiten sind notwendig, um seine genaue Funktion und Interaktion mit anderen Faktoren zu erläutern Strategien für die Früherkennung, Prävention und Behandlung von Magenkrebs zu entwickeln
Erklärungen
Danksagung
Diese Arbeit wurde durch ein Stipendium unterstützt wurde (Nr. 2004AA301C91 ) aus Hubei Science and Technology Foundation Mei Ye und Gemeinschaft von Research Center of Digestive Diseases der Universität Wuhan Zhongnan Hospital. Die Autoren danken Prof. Tan Jinquan für kritische Anregungen und Mitarbeiter des Key Laboratory of Allergy und Immun-Krankheiten in Wuhan University School of Medicine für technische Unterstützung.
Autoren Original vorgelegt Dateien für Bilder
Unten sind die Links zu den Original eingereichten Dateien für Bilder der Autoren. 12885_2007_770_MOESM1_ESM.jpeg Autoren Originaldatei für Abbildung 1 12885_2007_770_MOESM2_ESM.jpeg Autoren Originaldatei für Abbildung 2 Original-Datei '12885_2007_770_MOESM3_ESM.jpeg Autoren für Abbildung 3 Konkurrierende Interessen
Der Autor (en) erklären, dass sie keine Interessenkonflikte haben.

• Thymidin-Phosphorylase /β-Tubulin-III Ausdrücke Vorhersage der Reaktion in der chinesischen Patienten mit fortgeschrittenem Magenkrebs Empfangen erster Linie Capecitabin plus Paclitaxel
• Auswertung eines Computerhilfe für die Beurteilung der Magensymptome (ECASS):.? Studienprotokoll für eine randomisierte, kontrollierte trial