PLOS ONE: Tonic och phasic glatt muskulatur regleras inte av PKCa - CPI-17 Banan i svin mage Antrum och Fundus

Abstrakt

Reglering av myosin lätt kedja fosfatas (MLCP) via proteinkinas C ( PKC) och 17 kDa PKC-potentierad hämmare av myosin lätt kedja fosfatas (CPI-17) har rapporterats som en Ca ^{2 + sensibilisering signalväg i glatt muskulatur (SM), och därmed kan vara inblandade i tonic vs. phasic sammandragningar. Denna studie undersökte proteinuttryck och spatial-tidsmässiga fördelningen av PKCa och KPI-17 i intakta SM vävnader. KCl eller karbakol (CCh) stimulering av tonic mage ögonbotten SM genererar en ihållande sammandragning medan phasic magen antrum genererar en övergående kontraktion. Dessutom genererar tonic fundus större relativ kraft än phasic antrum med en iM forbol 12, 13-dibutyrat (PDBu) stimulering som uppges aktivera PKCa - CPI-17 väg. Western blot-analyser visade att denna kontraktila skillnad inte orsakades av en skillnad i proteinuttryck av PKCa eller KPI-17 mellan dessa två vävnader. Immunohistokemiska resultat visar att fördelningen av PKCa i de längsgående och cirkulära skikt av fundus och antrum inte skiljer sig, varvid till övervägande del lokaliserade nära SM cellplasmamembranet. Stimulering av antingen vävnad med en iM PDBu eller ett iM CCh ändrar inte denna perifera PKCa distribution. Det finns inga skillnader mellan dessa två vävnader för KPI-17 fördelning, men till skillnad från PKCa distribution visas KPI-17 att diffust fördelade över hela cytoplasman under avslappnade vävnadsförhållanden, men övergår till ett primärt perifert distribution i plasmamembranet med stimulering av vävnader med en iM PDBu eller ett iM CCh. Resultat från dubbel märkning visar att varken PKCa eller KPI-17 co-lokalisera på adherens (vinkulin /Talin) på membranet men de samar lokalisera med varandra och med caveoli (caveolin) på membranet. Denna brist på skillnad tyder på att PKCa - CPI-17 vägen är inte ansvarig för tonic vs. phasic sammandragningar observerats i magen fundus och antrum}

Citation: Zhang Y, Hermanson ME, Eddinger TJ (2013) Tonic. och phasic glatt muskulatur regleras inte av PKCa - CPI-17 Banan i svin mage Antrum och Fundus. PLoS ONE 8 (9): e74608. doi: 10.1371 /journal.pone.0074608

Redaktör: Wenhui Hu, Temple University School of Medicine, USA

Mottagna: 13 mars 2013, Accepteras: 4 augusti, 2013; Publicerad: 18 september 2013

Copyright: © 2013 Zhang et al. Detta är en öppen tillgång artikel distribueras enligt villkoren i Creative Commons Attribution License, som tillåter obegränsad användning, distribution och reproduktion i alla medier, förutsatt den ursprungliga författaren och källan kredit

Finansiering:. Detta arbete stöddes av National Science Foundation (NSF), Biological Sciences avdelningen och Graduate School, Marquette University. Finansiärerna hade ingen roll i studiedesign, datainsamling och analys, beslut att publicera, eller beredning av manuskriptet

Konkurrerande intressen:.. Författarna har förklarat att inga konkurrerande intressen finns

Introduktion

mekanismen (s) att bestämma tonic (ihållande) vs. phasic (övergående) glatt muskulatur (SM) sammandragningar är fortfarande olöst. Diverse innervation och cirkulerande signalmolekyler förutom unik receptor och protein (isoform) uttryck och intracellulära signalvägar komplicera frågan. Inte oväntat, det finns flera föreslagna hypoteser till tonic kraft underhåll i SM inklusive förklara: slowly- eller icke-cykling glatt muskulatur myosin tvärbryggor kallade spärr broar [1], [2], [3], [4]; rekrytering av icke-muskel myosin II [5], [6], [7]; bildandet av caldesmon eller calponin beroende aktin-to-myosin tvärbindningar [8], [9]; bildandet av cytoskelett kraftbärande strukturer [10], [11], [12]; och reglering av myosin LC _{20 fosforylering via andra budbärare vägar påverkar myosin lätta kedjan kinas (MLCK) och myosin lätt kedja fosfatas (MLCP) aktivitet [13], [14], [15], [16], [17] [18]. Denna sista kategori är av intresse på grund av den rapporterade differentiellt uttryck, lokalisering och reglering av dessa andra budbärare proteiner i olika SM vävnader. Steglös reglering av MLCK och MLCP aktivitet inte bara kan erbjuda ett medel för Ca ^{2 + sensibilisering, men också en möjlig mekanism för tonic vs. phasic kontraktion. Inaktivering av MLCP via PKCa -CPI-17 väg skulle göra det möjligt för bibehållen hög myosin lätta kedjan (MLC 20) fosforylering och därmed en varaktig sammandragande kraft. Ett misslyckande att inaktivera MLCP skulle minska MLC 20 fosforylering och kraft, vilket resulterar i en övergående kontraktion. Mage ögonbotten SM genererar en tonic (ihållande) sammandragning medan magen antrum SM genererar en phasic (övergående) sammandragning som svar på en mängd olika stimuli.}}

Ca ^{2 + sensibilisering, som innebär aktivering av G- proteinkopplade andra budbärare vägar som utlösa de kontraktila proteiner till [Ca 2 + _{i] genom att hämma MLCP kan ske genom någon av många vägar. En av de rapporterade banor för hämning av MLCP verksamhet omfattar proteinkinas C /C-kinas aktiveras PP1 hämmarprotein av 17 kDa (PKC /CPI-17) väg [19], [20]. G-kopplade proteinreceptor (GCPR) aktivering resulterar i aktivering av fosfolipas C (PLC), hydrolyserar fosfatidylinositol 4,5-bisfosfat (PIP 2) för att producera inositol 1,4,5-trisfosfat (IP 3) och diacylglycerol (DAG). DAG är känd för att aktivera PKC som kan orsaka fosforylering av KPI-17 för att selektivt hämma MLCP (granskas för invärtes SM i [17]). PKC tros regleras genom dess aktivering och rumslig fördelning inom cellen, varvid den senare är kontrollerad genom att förankra proteiner som binder till och begränsar placeringen av PKC till specifika regioner av cellen [21], [22]. Till exempel föreslår rapporter om konstitutivt aktiv L-typ Ca 2 + kanaler och regleringen av PKC [23], [24] att PKC är lokaliserad nära membranet i glatta muskelceller. Det cellulära funktion KPI-17 i cellen kan variera beroende på nivån av proteinuttryck och om det ligger nära plasmamembranet där PKCa ligger /aktiverad, eller i samband med de kontraktila myosin tjocka trådar där MLCP skulle placeras DE -phosphorylate myosin lätta kedjan 20 (MLC 20).}}

uttrycket av PKCa och KPI-17 och deras rumsliga-temporala omfördelning vid vävnadsaktivering har föreslagits i Ca ^{2 + sensibilisering av glatta muskelvävnad (för granskning [14], [15], [16], [17]). Det är således möjligt att skillnader i deras uttryck och cellulär lokalisering /translokation kan vara involverade i att bestämma tonic vs. phasic kontraktila svar. För dessa två proteiner att vara en del av en väg involverad i att hämma MLCP aktivitet under vävnads aktivering och därmed orsaka en tonic eller phasic svar, måste de uttryckas på lämpliga nivåer och placeras på rätt plats i cellen vid rätt tidpunkt. Eftersom PKC aktiveras av DAG (ett membranbundet fosfolipid), måste det också vara på membranet åtminstone temporärt för att detta ska ske. Och om KPI-17 kommer att hämma MLCP från defosforylera MLC _{20 på de tjocka trådarna, KPI-17 vid någon tidpunkt måste vara i cytosolen i samband med de tjocka trådarna vistas där. Med dessa två steg som förekommer i två rumsligt distinkta regioner av cellen, en eller båda av dessa proteiner har att translokera till den andra regionen för dem att interagera och fullborda reaktionsvägen.}}

Syftet med denna studie var att testa hypotesen att PKCa - CPI-17 Ca ^{2 + sensibilisering vägen är involverad i att fastställa tonic (ihållande) och phasic (övergående) kontraktila svar i musklerna. För att göra detta har vi fastställt proteinuttryck och spatial-tidsmässiga fördelningen av PKCa och KPI-17 i phasic magen antrum och tonic mage ögonbotten under avslappnade och aktiverade tillstånd. Resultaten visar ingen signifikant skillnad i uttryck av någon av dessa två proteiner, inte heller i sitt perifera fördelningen mellan dessa två vävnader är oförenliga med hypotesen att PKCα- KPI-17 Ca 2 + sensibilisering vägen är den avgörande faktorn för tonic vs. phasic kontraktila svar som observerades i dessa vävnader.}

Metoder

organ- och vävnads Hantering

Svin vävnader (magar) erhölls från Hansen Meat Service (Franks, WI) och sätta i kall fysiologisk saltlösning (PSS, (i mM): 140,1 NaCl, 4,7 KCl, 1,2 Na _{2HPO 4, 2,0 MOPS (pH 7,4), 0,02 Na 2EDTA, 1,2 MgSO 4, 1,6 CaClz 2, och 5,6 glukos). Magarna rengöras från blod, lös bindväv, och i vissa fall, slemhinnan, och frystes omedelbart eller förvaras i PSS i kylskåp i 0-2 dagar. Vissa organ var färskfrusen så snart som möjligt efter obduktion (60-90 minuter). Vissa organ inkuberades i PSS och /eller stimuleras med 1,0 | iM CCh eller PDBu (Sigma) vid 37 ° C under olika tidpunkter före frysning. Variabla inkubationstider och agonistkoncentrationer testades också. För immunohistokemi all vävnad förvarades fryst tills sektioneras och immunoreagerade. Frysning i samtliga fall involverade placering av bitar av vävnader eller vävnadsremsor i isopentan kyld i flytande kväve följt av förvaring vid -80 ° C. Fem till sex im delar av de frusna vävnaderna skars på en Leica CM1900 kryostat, plockade upp på objektglas och lagrades fryst (0-1 dagar) tills immunoreagerade.}

immunreaktioner och reagens

antikroppar som används erhölls från följande källor: PKCa (H-7 och C-20) och (H-60)-17 KPI från Santa Cruz Biotech, Santa Cruz CA; Vinkulin och Talin från Sigma, Saint Louis, Missouri; Caveolin en från BD Biosciences, San Jose, CA; CY2 och Cy3 åsna anti mus eller kanin sekundära s från Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA; Alexa Fluor 594-falloidin och DAPI från Molecular Probes, Eugene, OR. Alla dessa antikroppar har använts tidigare i vårt laboratorium för immunohistokemi och Western blotting där de visar specificitet för ett band med den korrekta molekylvikten för respektive protein indikerade [25], [26], [27]. Negativa kontroller där den primära antikroppen inte är inkluderad visar ingen reaktivitet för dessa band och ingen immunofluorescens på vävnadssektioner.

Frysta vävnadssektioner plockas upp på objektglas tinades vid rumstemperatur och fixerades sedan med 2% paraformaldehyd under 10 minuter, permeabiliserade i 0,5% Triton X-100 under 10 min och blockerades med 5 mg /ml BSA under 1 timme före reaktion med den primära antikroppen över natten (4 ° C) och sedan den lämpliga sekundär antikropp under en timme vid rumstemperatur. Efter den sekundära antikroppen, var vävnaderna inkuberades med DAPI (0,5 M), phalloidin (10-50 nM) eller DAPI /phalloidin som är lämpligt för färgning kärnor och /eller fintrådiga aktin. Flera tvättar användes efter de primära och sekundära inkubationer, och motfärgning. Täckglas monterades med användning av buffrade 75% glycerol med 0,2% n-propylgallat för att minimera blekning. Alla immunoreagera lösningar gjordes i PBS-Tween [(ig /liter: NaCl 8,0, KH _{2PO 4 0,2, Na 2HPO 4 1,15, KCl 0,2,), 1% tween- 20, pH 7,4] med 0,1% BSA. Negativa kontroller inkluderade 0,1% BSA utan den primära antikroppen, och visade ingen immunoreaktion.}

Mikroskopi

Sektioner observerades med användning av en Olympus IX70 mikroskop med epifluorescens belysning. Digitala bilder togs med en 16 bitars Princeton Instruments (Princeton, NJ) CCD-kamera, styrs via en PCI-kort via IPLab för Windows på en dator (Ver 3.6, Scanalytics,. Fairfax, VA). Bilder togs med antingen en 100 x (1,3 NA) eller 60 × (1,25 NA) olja lins eller en 40 × (0,9 NA) luft lins och lagras på datorn. Emissionsfilter som användes var 405, 490 och 570 nm. Sektioner också visas med en Nikon konfokalmikroskop (Nikon A1 konfokal Eclipse Ti). Målen som användes var 100 × (1,4 NA) olje lins på 425, 488 och 561 nm. Liknande resultat observerades i immunfluorescens distributioner som använder dessa två olika system.

bildanalys av Fördelning av PKC /CPI-17 av enskilda celler i vävnader

Profiler av fluorescensintensiteten togs för enskilda celler i tvärgående vävnadssnitt. Sektioner observerades vid låg förstoring (10-20x) för att undvika områden av uppenbara artefakter (vävnads vikning, frysskada, etc). I en artefakt fri yta förstoringen ökades till 40-100x, och bilderna togs vid dessa högre förstoringar. Tre olika områden inom ett vävnadssnitt valdes för att ta bilder. Z-stack serie togs individuellt för var och en av de tre färgkanalerna som används. 1 pm tjocka Z sektioner togs, och 15-25 Z sektioner togs för varje avsnitt vävnad (siffror S1 & S2 visar Z-stack exempel på KPI-17 immunreaktivitet i antrum med och utan vävnads aktivering). undersöktes varje Z stack serien för varje avsnitt för att identifiera centrum z bilden och bilden omvandlades till a.bmp fil, som importerades till NIS-Elements AR 3,0 (Nikon) på en dator för att analysera data.

Profiler av PKCa och Phalloidin fluorescensintensiteten erhölls för enskilda celler i tvärvävnadssnitt. En linje drogs över mitten av bildfältet. Tio celler som korsas av linjen valdes ut för mätningar. Baserat på våra tidigare protokoll [25], de första fem pixlar (~0.7 pm) på vardera sidan av cellen där falloidin intensiteten ökade kraftigt från baslinjen definierades som periferin av cellen. För cytosoliska mätningar genomfördes en rad placeras minst 2 um bort från cellperiferin. Intensitetsmätningar gjordes med användning av ett område av intresse (ROI) ungefär i mitten av cellen (för cytosoliska mätningar), eller längs cellens membran (för perifera mätningar). För konsekvensens skull är storleken på ROI hölls konstant i de perifera och cytosoliska mätningar. Celler i avsnittet med mycket små diametrar (inte kan mäta cytosoliska ROI minst 2 pm från periferin) eller med kärnor närvarande (synlig DAPI färgning där rumsliga begränsningar och perinukleära organ kunde förbrylla distribution) uteslöts från analysen. För PKCa, var förhållandet mellan den genomsnittliga intensiteten hos PKCa vid periferin över den totala PKCa intensiteten (summan av PKCa intensitet från ROI vid periferin och ROI i cytosolen) användas. Tio celler per fält och tre olika områden utsattes för mätning för analys av data för varje vävnadsområde, dvs trettio celler räknades och medelvärdet beräknades för varje prov (n = 1). Den slutliga provstorleken var n = 5. De samma procedurer tillämpades för att mäta intensiteten av CPI-17, förutom att endast ett område av 10-celler användes för varje prov (n = 1), med en slutlig provstorlek av n = 3.

Mekaniska Mätningar

Omedelbart före användning, var vävnadsremsor klippa och spännas fast på varje ände, med klämmorna säkrade mellan krokar på en stationär metallstång och en isometrisk kraftomvandlare (Harvard Apparatus, Holliston, MA), i PSS bubblas med 95% O _{2/5% CO 2 i vattenmantlade muskelkammare (Radnoti Glass Technology, Monrovia, CA) vid 37 ° C. Längden av varje remsa varierades genom att omplacera den stationära metallstången.}

glatt muskelvävnad remsor (magen antrum och fundus) ekvilibrerades under 1 h och sträcktes till en passiv spänning som närmar Lo med användning av en förkortad längd-spänning-kurvan . Kontrakts vävnader, var PSS ersattes med K ^{+ - PSS (109 mM KCl ersätts iso-osmotiskt för NaCl) [28]. De muskelremsor aktiverades upprepade gånger med sträckning av vävnaden mellan varje aktivering, till dess att toppkraften inte längre visade en signifikant ökning jämfört med föregående kontraktion. Chambers spolades tre gånger med PSS efter varje vävnad aktivering. Minst två repeterbara successiva K + - PSS kontraktioner användes för att få en standard kraft spår med en 10 minuters vila mellan varje sammandragning innan försöket. Vävnaderna sedan aktiveras med en iM karbakol och avslappnad igen, som genomfördes under K + - PSS sammandragningar. Efterföljande sammandragningar ingår ett iM fentolamin och propranolol för att blockera α- och β - adrenerga receptorer, respektive. Efter den slutliga ett iM CCh kontraktion och tvätta var vävnaderna aktiveras med ett iM PDBu att spela in deras mekaniska svar.}

Analys av Force Data

Spänningssignaler från kraftgivare digitaliserades av PowerLab 400 eller 4 SP hårdvara (ADInstruments, Castle Hill, Australien) visualiseras på en datorskärm (diagram v3.6 eller 4,0, ADInstruments) som kraft (g) vid 10 Hz och lagras av programvarukommando till en hårddisk för senare analyser. Siffror gjordes med kalkylprogrammet Excel 2000 (Microsoft, Redmond, WA).

Gelelektrofores och Western blotting

Protein expression analyserades såsom beskrivits tidigare [29]. Vävnaderna homogeniserades vid 50 mg /ml i 0,125 M Tris, 2% natriumdodecylsulfat (vikt /volym), 20% glycerol, 0,1% bromfenolblått (vikt /volym) och 20 mM ditiotreitol. Proteiner upplöstes på låga tvärbindnings natriumdodecylsulfat geler [30] och immunoblotting utfördes såsom beskrivits tidigare [31]. Den PKCa antikropp redovisas antingen ett enda band eller oftare en dubblett vid ~76 kD medan KPI-17 antikropp erkänt ett enda band vid ~17 kD. Dessa storlekar är i överensstämmelse med den förväntade storleken för dessa proteiner baserade på gelmobilitet. För att säkerställa riktigheten av western blöts, var lastkurvor gjort för både magen fundus och antrum prover under en 5-faldigt område av belastningar (4-20 pl) för aktin (coomassie blå färgning) och PKCa och KPI-17 (western blotting) . Resultaten visade ett linjärt samband över detta område för alla tre proteiner från båda vävnader (R ^{2 > 0,98 för alla resultat, n = 3). Kvantifiering av PKCa och CPI-17-proteinexpression utfördes på western blottar med användning av 5-10 | il belastningar som var inom denna linjära området (n = 6).}

Statistik

Statistiska jämförelser genomfördes använder MINITAB (Minitab Inc. State College, PA). En ett prov t-test användes för att testa fördelningen av PKCa /CPI-17 (en perifer till total ROI halt av 0,5 indikerar en "uniform" fördelning i glatta muskelceller (SMC)) i antrum och fundus enligt vilotillstånd. Ett sätt ANOVA utfördes för att testa för PKC /CPI-17 fördelningsskillnader för de två vävnader med olika stimulerande parametrar. Två prov t-tester användes för att testa betydelsen av skillnaden för uttryck nivå PKCa eller KPI-17 i antrum och fundus. En två-tailed F-test för likhet två standardavvikelser (SDS) bestämdes en signifikant lägre SD i förhållandet caveolin till PKCa jämfört med SD av förhållandet mellan vinkulin till PKCa. Värdet P < 0,05 ansågs signifikant för alla statistiska test. Inga statistiska test gjordes på kraftdata och figur 1 är representativa för liknande uppgifter från 6 olika djur. Western blot data från sex djur. PKCa datadistribution är i genomsnitt trettio celler mätt per djur och fem djur testades. KPI-17 datadistribution är ett genomsnitt av 10 celler mätt per djur och tre djur testades. Protein samlokalisering data är baserade på en "n" av åtminstone 20 celler från åtminstone 3 djur.

Resultat

Svin mage fundus är i första hand en tonic glatt muskelvävnad som svarar på stimulering med en ihållande sammandragning medan antrum är en primärt phasic glatt muskelvävnad som svarar på stimulering med en övergående sammandragning (fig. 1). I vävnader är dessa svar sannolikt ett resultat av direkt stimulering av den glatta muskulaturen som tillsats av 1 ^ M propranolol (β agonist blockerare) och fentolamin (α agonist blockerare) användes för att förhindra aktivering av adrenerga receptorer på grund av potentiell frisättning av sympatiska neurotransmittorer. Stimulering av glatt muskulatur med PDBu används rutinmässigt för att orsaka glatt muskulatur via PKC-aktivering [32], [33], [34]. En iM PDBu orsakar en liten långsam nedgång i magen fundus remsor (-40% av K ^{+ stimuleringssvar) medan antrum visar väsentligen inget svar (< 5% K + stimulering) (fig. 1). Skillnaden mellan de ihållande och transientsvar för dessa två vävnader till KPSS och CCh, och närvaron eller frånvaron av en kontraktil respons på PDBu stimulering skulle kunna bero på uttrycket och /eller rums-tidsmässiga fördelningen av de nedströms belägna andra budbärare (PKCa och KPI-17) som påstods vara ansvarig för MLCP hämning med PDBu stimulering. För att undersöka detta har vi mätte expressionsnivåer och bestäms den rumsliga-tidsmässiga fördelningen av PKCa och CPI-17 i dessa vävnader.}

Figur 2 visar Western blot-resultat för uttryck av CPI-17 och PKCa i magen antrum och fundus. Vävnaderna behandlas styrning för proteinkoncentration, och resultaten beräknades baserat på intensiteten hos respektive protein signalen, och normaliserades till aktin proteinuttryck (Fig. 2). Båda metoderna (endast normaliserade data visade) indikerade att varken uttrycket av KPI-17 protein eller att av PKCa proteinet är signifikant (p > 0,23 & p > 0,28 respektive n = 6) när man jämför dessa två SM vävnader. Kontroller gjordes med hjälp av en rad olika belastningar för att bekräfta olika linearitet lastning och att prover som används för kvantifiering var inom detta område (data ej visade, se metoder). Eftersom det inte finns några skillnader i uttrycket för dessa två proteiner mellan dessa två vävnader, nästa fortsatte vi att bestämma om skillnader i deras rumsliga-temporala fördelningen skulle kunna förklara skillnaden i sina svar till PDBu stimulering.

Figur 3 visar immuohistochemical resultat för distribution av PKCa i de längsgående och cirkulära lagren av ögonbotten och antrum. Under vilande betingelser i avkopplande lösning när det inte finns någon kraft generering genom vävnaden, visas PKCa att entydigt distribueras företrädesvis nära periferin av SMC (Fig. 3- grön färg, PSS). Stimulering av vävnaderna med en iM CCh (3 ') eller ett iM PDBu (10 och 30') ändrar inte denna perifera distribution av PKCa. Förhållandet mellan fördelningen av PKCa nära plasmamembranet i förhållande till totala cellulära PKCa användes för att kvantifiera eventuella förändringar i fördelningen av detta protein under dessa olika förhållanden. Figur 4 visar resultaten som kvoten av PKCa vid cellperiferin i förhållande till de totala PKCa närvarande i cellen (perifer /(perifer + cytosol), se metoder). Ett förhållande av 0,5 skulle indikera en "uniform" fördelning av proteinet i hela cellen. Den PKCa förhållande (perifer /totalt) varierade 0,64-0,68 i alla förhållanden undersökas. Dessa värden är betydligt större än 0,5 (p < 0,05), vilket tyder på att PKCa ligger främst vid cell periferi (det är inte "enhetligt" distribueras i cellen) och att denna fördelning inte ändras mellan de avslappnade eller stimulerade förhållanden <. br>

Eftersom PKCa föreslås att aktivera CPI-17, fortsatte vi att bestämma den rumsliga-temporala fördelningen av KPI-17 i dessa vävnader under liknande förhållanden. Figur 5 visar immuohistochemical resultat för distribution av KPI-17 i de längsgående och cirkulära skikt av fundus och antrum. Under vilobetingelser i avkopplande lösningen när det inte finns någon kraft generering genom vävnaden, visas KPI-17 som skall diffust fördelade över hela SMC (fig. 5- PSS, fig. S1). Stimulering av vävnader med en iM CCh (30 ') (men inte en iM CCh för 3', data visas ej) eller en iM PDBu (30 ') resulterar i en betydande förändring av denna fördelning så att KPI-17 visas nu vara primärt vid periferin av cellen i en fördelning som liknar den som observerats för PKCa (fig. 5, fig. S2). Förhållandet mellan fördelningen av KPI-17 nära plasmamembranet i förhållande till den totala KPI-17 (perifer + cytosoliska) användes för att kvantifiera eventuella förändringar i fördelningen av detta protein under dessa olika förhållanden. Figur 4 visar resultaten som förhållandet mellan periferi-till-total CPI-17. KPI-17 förhållande (perifer /totalt) varierade från 0,49 till 0,67 i alla vävnader och villkor undersökta. Förhållandet mellan KPI-17 perifera /totalt i avslappnade former är inte väsentligt annorlunda än 0,5 (betyder 0,49-0,5; P > 0,19) vilket indikerar att KPI-17 är diffust fördelade i glatta muskelceller under detta förhållande. Detta ändrar inte efter 3 'av ett iM CCh stimulering eftersom det fortfarande ingen signifikant skillnad från de avslappnade former (betyder = 0,53-0,55; P > 0,05) med undantag av ögonbotten vävnader där KPI-17 perifera /total förhållande är signifikant större (p < 0,05) vid 3 '(fig. 4). Med 30 'av antingen en iM CCh eller en iM PDBu stimulering blir KPI-17 distributionen betydligt större än 0,5 för alla vävnader och lager (medel = 0.62-0.67, P < 0,01), vilket tyder på att KPI-17 nu ligger i första hand på celler periferi (det är inte längre "enhetligt" fördelade över hela cellen), liknar fördelningen av PKCa (Fig. 4).

främst perifer fördelning av PKCa (under både avslappnad och stimulerade förhållanden) och KPI-17 (efter 30 'stimulering med CCh eller PDBu) är inte enhetlig vid cell periferi, men punktat i distributionen (Fig. 6). Det finns också en punktformig fördelning av anatomiskt och funktionellt distinkta zonula adhaerens och caveoli på SMC plasmamembranet [26]. För att bestämma om fördelningen av PKCa och KPI-17 vid membranet motsvarar den punktat mönster av zonula adhaerens, gjorde vi dubbel märkning med två adherens associerade proteiner, vinkulin och Talin. Den alternativa mönster av fördelning av de röda och gröna fluoroforer på membranen visar att PKCa och KPI-17 inte samar lokalisera med antingen vinkulin eller Talin (Fig. 6), vilket tyder på att PKCa och KPI-17 inte associerar med den adherens komplexet under de förhållanden vi granskat. Eftersom caveoli alternerar med zonula adhaerens på perifera membranet [26], PKCa och KPI-17 kan samverka lokalisera med caveoli. För att bestämma om punktat fördelningen av PKCa och KPI-17 vid membranet motsvarar den punktat mönster av caveoli, gjorde vi också dubbel märkning av PKCa med caveolin. Fördelningen av PKCa och caveolin sam-lokaliseras vid membranet i både avslappnat och aktiverade betingelser som burken observerats genom uppkomsten av den gul /orange fluorescens snarare än distinkt röd och grön fluorescens (Fig. 6). En två-tailed F-test för likhet två standardavvikelser (SDS) bestämdes en signifikant lägre SD i förhållandet caveolin till PKCa jämfört med SD av förhållandet mellan vinkulin till PKCa (n = 20 celler; p < 0,05) . Dessutom dubbel märkning av PKCa med CPI-17 efter aktivering av vävnaden visar också signifikant samlokalisering (n = 20 celler; p < 0,05) av dessa två proteiner i närheten av plasmamembranet (fig. 7). Dessa data visar att PKCa primärt lokaliserad nära caveloi vid SMC plasmamembranet vid alla tidpunkter, och att efter vävnadsaktivering, en betydande del av den cytosoliska CPI-17 translokerar till caveoli vid plasma där den samar lokaliseras med PKCa.

Diskussion

Smooth muskelvävnad rutinmässigt karakteriseras som antingen "tonic" (generera en långsam underhålls isometrisk sammandragning) eller "phasic" (generera en snabb transient isometrisk kontraktion). Styrke och /eller vävnad förkortning i SM tros kräva förhöjd myosin lätta kedjan fosforylering, ATP konsumtion och tvär bron cykling. En möjlig mekanism som ansvarar för dessa två typer av sammandragningar är differentiell Ca ^{2 + sensibilisering. Ca 2 + sensibilisering i glatt muskulatur tros till stor del bero på hämning av MLCP samtidigt med eller efter aktivering av MLCK under vävnads aktivering [15], [35]. En av de stora vägar föreslås vara inblandade i Ca 2 + sensibilisering är via G-proteinkopplade receptorer (GPCR) /fosfolipas C (PLC) /diacylglycerol (DAG) /PKC /CPI-17 att hämma MLCP. GPCR: s, PLC, och DAG är alla belägna på /i plasmamembranet. Placeringen av MLCP är mindre säker, men vid någon punkt i tid efter vävnads aktivering MLCP behöver associeras med MLC _{20 om myosin molekyl av de tjocka filamenten för att defosforylera detta protein. Eftersom tjocka filament har rapporterats vara fördelade över hela SMC cytoplasman [36], [37], [38], [39], kommer MLCP också måste fördelas över hela cytoplasman vid något tillfälle under avkoppling [40]. Om MLCP är belägen inuti cytosolen och nära MLC 20 under kontraktion, och PKCa och CPI-17 spela en roll vid inhibering MLCP under kontraktion, så åtminstone skulle förväntas CPI-17 för att vara belägna inom cytosolen hos någon tid under kontraktion. Resultaten av denna studie visar att PKCa preferentiellt lokaliserad nära plasmamembranet under avslappnade och aktiverade tillstånd, och att CPI-17 är också företrädesvis lokaliserad nära plasmamembranet under aktiverade villkor. Således föreslår dessa data att skillnader i PKCα- KPI-17 Ca 2 + sensibilisering vägen kan inte förklara tonic och phasic SM sammandragningar i magen fundus och antrum och ytterligare arbete krävs för att avgöra hur den rumsliga-temporala fördelningen av CPI- 17 med vävnads aktivering kan reglera MLCP att orsaka Ca 2 + sensibilisering SM sammandragning i intakta SM vävnader.}}

Medan PDBu orsakar en långsam nedgång i fundus som är -40% av KPSS inducerad toppkraften , lilla kontraktion genereras i antrum med PDBu stimulering. Eftersom ögonbotten och antrum representerar två grundläggande typer av glatt muskulatur, tonic och phasic respektive förefaller det logiskt att tillskriva skillnaden i styrke till olika egenskaper hos phasic och tonic muskler. Woodsome et al [41] rapporterade att expressionsnivån av CPI-17 i toniska vaskulär SM är högre än den i phasic vaskulär SM. Detta skulle kunna förklara de olika förmåga tonic muskler för att upprätthålla kraft (en hög koncentration av KPI-17 hämmar MLCP tillåter MLC _{20 fosforylering att hålla hög och kraft att bibehållas i tonic SM). Denna studie undersökte PKCa och KPI-17 proteinuttryck och fördelning i viscerala svin magen. Till vår förvåning var ingen signifikant skillnad i proteinexpressionsnivån av PKCa eller KPI-17 detekterades mellan fundus och antrum (Fig. 2).}

• PLOS ONE: Nikotin Dämpar Aktivering av Tissue residenta makrofager i musen magen genom β2 nikotin-acetylkolinreceptorn
• PLOS ONE: Kirurgisk behandling för patienter med Krukenberg tumör i magen Ursprung: kliniska resultat och prognostiska faktorer Analys