PLoS ONE: Tonic ja phasic sileän lihaksen supistukseen ei säännellä joita PKC-a - CPI-17 Pathway in Swine Vatsa antrumissa ja Silmänpohjan

tiivistelmä

asetukseen myosiinikevytketjua fosfataasi (MLCP) kautta proteiinikinaasi C (PKC) ja 17 kDa PKC-voimisti estäjä myosiinikevytketjua fosfataasi (CPI-17) on ilmoitettu olevan Ca ^{2+ herkistymistä signalointireitille sileän lihaksen (SM), ja voi siten olla mukana tonic vs. vaihesiirtymäksi supistuksia. Tutkimuksessa selvitettiin proteiinin ilmentymisen ja spatiaalinen-ajallinen jakautuminen PKC-a ja CPI-17 ehjä SM kudoksissa. KCI tai karbakolin (CCh) stimulaatio tonic mahan silmänpohjan SM luo jatkuvaa supistuminen samalla vaiheittaisten mahan antrum luo ohimenevä supistuminen. Lisäksi tonic silmänpohjan tuottaa suuremmat suhteellinen voima kuin phasic antrum 1 uM forboli- 12, 13-dibutyraa- (PDBu) stimulaation joka raportoidaan aktivoida PKC-a - CPI-17-reitin. Western blot analyysit osoittivat, että tämä supistuvien eroa ei aiheuttanut eroa proteiinin ilmentymistä PKC-a tai CPI-17 näiden kahden kudosten. Immunohistokemiallista tulokset osoittavat, että jakautumisen PKC-a pituussuunnassa ja pyöreä kerrosten silmänpohjan ja antrum eivät eroa toisistaan, on pääasiassa paikallisia lähellä SM solukalvoon. Stimulointi joko kudoksen kanssa 1 uM PDBu tai 1 uM CCh ei muuta tätä reuna-PKC-a-jakeluun. Ei ole eroja näiden kahden kudosten CPI-17 jakelu, mutta toisin kuin PKC-a-jakelu, CPI-17 näyttää hajanaisesti jaetaan koko sytoplasmassa alle rento kudosolosuhteissa vaan siirtyy ensisijaisesti reuna-jaettavaksi solukalvon kanssa stimulaation kudoksiin 1 uM PDBu tai 1 uM CCh. Tulokset kaksinkertainen merkinnät osoittavat, että kumpikaan PKC-a eikä CPI-17 kolokalisoituvat klo vyöliitos (vinkuliini /Talin) on kalvo, mutta ne eivät kolokalisoituvat keskenään ja caveoli (caveolin) on kalvo. Tämä puute ero viittaa siihen, että PKC-a - CPI-17-reitti on ei vastaa tonic vs. vaiheittaisten supistusten havaittu vatsassa silmänpohjan ja antrum.}

Citation: Zhang Y, Hermanson ME, Eddinger TJ (2013) Tonic ja phasic sileän lihaksen supistukseen ei säännellä joita PKC-a - CPI-17 Pathway in Swine Vatsa antrumin ja Silmänpohjan. PLoS ONE 8 (9): e74608. doi: 10,1371 /journal.pone.0074608

Editor: Wenhui Hu, Temple University School of Medicine, Yhdysvallat

vastaanotettu: 13 maaliskuu 2013; Hyväksytty: 04 elokuu 2013; Julkaistu: 18 syyskuu 2013

Copyright: © 2013 Zhang et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat National Science Foundation (NSF), Biologiset tieteet osasto ja Graduate School, Marquette University. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

mekanismi (t) määritetään tonic (jatkuva) vs. phasic (ohimenevä) sileän lihaksen (SM) supistuksia on edelleen ratkaisematta. Monipuolinen hermotuksen ja kiertävän signalointimolekyylejä lisäksi ainutlaatuinen reseptoriin ja proteiini (isoformin) ilmaisun ja solunsisäiset signalointireitit vaikeuttaa sitä. Odotetusti on useita ehdotti hypoteeseja selittämään tonic voimassa kunnossapidon SM lukien: slowly- tai ei-pyöräily sileän lihaksen myosiinin rajat sillat kutsutaan salpa siltoja [1], [2], [3], [4]; rekrytointi kuin lihaksen myosiinin II [5], [6], [7]; muodostuminen caldesmon tai calponin riippuvainen aktiini-to-myosiini ristisidosten [8], [9]; muodostuminen solun tukirangan voiman kantavien rakenteiden [10], [11], [12]; ja sääntely myosiinin LC _{20 fosforylaation kautta toisiolähetti- väyliä vaikuttaa myosiinikevytketjua kinaasi (MLCK) ja myosiinikevytketjua fosfataasi (MLCP) aktiivisuus [13], [14], [15], [16], [17] , [18]. Tämä viimeinen luokka on kiinnostava, koska raportoitu differentiaalikaavojen, lokalisointi ja sääntely näiden toisiolähetti- proteiineja erilaisissa SM kudoksissa. Muuttuva sääntely MLCK ja MLCP toiminta voisi tarjota paitsi keino Ca ^{2+ herkistyminen, mutta myös mahdollinen mekanismi tonic vs. vaihesiirtymäksi supistuminen. Inaktivointi MLCP kautta PKC-a -CPI-17-reitin mahdollistaisi säilyy korkealla myosiinikevytketjua (MLC 20) fosforylaation ja siten kestävän kutistusvoimaa. Epäonnistuminen inaktivoimiseksi MLCP vähentäisi MLC 20 fosforylaation ja voima, tuloksena on ohimenevä supistuminen. Vatsa silmänpohjan SM luo tonic (jatkuva) supistuminen samalla kun mahan antrum SM luo phasic (ohimenevä) supistuminen reaktiona erilaisiin ärsykkeisiin.}}

Ca ^{2+ herkistyminen, johon liittyy aktivointi G- -proteiiniin toinen messenger polkuja, jotka herkistävät supistuvien proteiinien [Ca 2 + _{i] estämällä MLCP, voi tapahtua millä tahansa lukuisista polkuja. Yksi raportoitu väyliä eston MLCP toiminta sisältää proteiinikinaasi C /C-kinaasi aktivoituu PP1 inhibiittoriproteiinista 17 kDa (PKC /CPI-17) reitin [19], [20]. G-kytketyn proteiini reseptori (GCPR) aktivointi johtaa aktivoitumiseen fosfolipaasi C (PLC), hydrolysoi fosfatidyyli 4,5-bifosfaatin (PIP 2) tuottamiseksi inositoli 1,4,5-trisfosfaattia (IP 3) ja diasyyliglyserolia (DAG). DAG on tiedetään aktivoivan PKC joka voi aiheuttaa fosforylaatio CPI-17 estää selektiivisesti MLCP (tarkistetaan sisäelinten SM [17]). PKC uskotaan säännellä sen aktivointia ja alueellista jakautumista solussa, joista jälkimmäinen ohjataan ankkurointi proteiineja, jotka sitoutuvat ja rajoittaa sijainnin PKC tietyille alueille solun [21], [22]. Esimerkiksi raportit konstitutiivisesti aktiivisia L-tyypin Ca 2 + kanavat ja niiden sääntelyä PKC [23], [24] viittaavat siihen, että PKC on lokalisoitu lähellä kalvon sileän lihaksen soluissa. Solu toiminta CPI-17 solussa voi vaihdella sen tasosta proteiinin ilmentymisen ja onko se sijaitsee lähellä solukalvon jossa PKC-a sijaitsee /aktivoitu, tai liittyy supistuvien myosiinin paksu säikeet jossa MLCP sijaitsisi de -phosphorylate myosiinikevytketjua 20 (MLC 20).}}

ilmaisu PKC-a ja CPI-17 ja niiden spatiaalinen-ajallinen uusjakoa upon kudos aktivoinnin on ehdotettu Ca ^{2+ herkistymistä sileän lihaskudoksen (tarkistettavaksi [14], [15], [16], [17]). Siten on mahdollista, että erot niiden ilmaisun ja solusijaintipaikan /translokaatio voitaisiin mukana päättämässä tonic vs. phasic supistuvien vastauksia. Näistä kaksi proteiinia olla osa koulutusjakson mukana estävä MLCP aktiivisuuden aikana kudosta aktivoinnin, ja aiheuttavat siten tonic tai phasic vastausta, ne on ilmaistava asianmukaisilla tasoilla ja sijoitettu oikeaan paikkaan solussa oikeaan aikaan. Koska PKC aktivoituu DAG (a kalvoon sitoutunut fosfolipidi), sen on myös oltava kalvon ainakin ajallisesti tämän tapahtua. Ja jos CPI-17 aikoo estää MLCP alkaen defosforyloimaan MLC _{20 paksu säikeet, CPI-17 jossain vaiheessa on oltava sytosoliin liittyy paksu hehkulankojen hetkellä. Nämä kaksi vaihetta tapahtuvat kahden spatiaalisesti erillistä aluetta solun, toinen tai molemmat näistä proteiineista on translokoituvat toiselle alueelle niiden vuorovaikutuksessa ja täydentää kautta.}}

Tämän tutkimuksen tarkoituksena oli testata Jos oletetaan, että PKC-a - CPI-17 Ca ^{2 + herkistymisen -systeemi mukana päättämässä tonic (jatkuva) ja phasic (ohimenevä) contractile vasteita sujuvaa lihaksia. Siksi meidän määrittää proteiinin ilmentymisen ja spatiaalinen-ajallinen jakautuminen PKC-a ja CPI-17 vaiheittaisten mahassa antrumiin ja tonic mahan silmänpohjan alle rento ja aktivoitu olosuhteissa. Tulokset osoittavat merkitsevää eroa ilmentymä kumpaakaan näistä proteiineista, eikä niiden oheislaitteiden jakautuminen näiden kahden kudokset ovat ristiriidassa hypoteesin, että PKCα- CPI-17 Ca 2+ herkistyminen reitti on ratkaiseva tekijä tonic vs. phasic contractile vasteita havaittiin näissä kudoksissa.}

Methods

elinten ja kudosten käsittely

Sian kudoksissa (mahat) saatiin Hansen Meat Service (Franksville, WI) ja laita kylmään fysiologista suolaliuosta (PSS, (mm): 140,1 NaCl, 4,7 KCI, 1,2 Na _{2HPO 4, 2,0 MOPS (pH 7,4), 0,02 Na 2EDTA, 1,2 MgSO 4, 1.6 CaCl 2, ja 5,6 glukoosia). Mahat puhdistettiin verta, löysä sidekudoksen, ja joissakin tapauksissa, limakalvon, ja jäädytettiin välittömästi tai varastoidaan PSS jääkaapissa 0-2 päivää. Jotkut elimet olivat tuore mahdollisimman pian seuraavat post mortem (60-90 minuuttia). Joissakin elimissä inkuboitiin PSS ja /tai stimuloidaan 1,0 uM CCh tai PDBu (Sigma) 37 ° C: ssa eri ajankohtina ennen pakastamista. Muuttuvat inkubaatioajat ja agonistin pitoisuuksia testattiin myös. Immunohistokemiaa kaikki kudos säilytettiin pakastettuina, kunnes niistä leikattiin ja immunoreagoivat. Pakastaminen kaikissa tapauksissa mukana sijoittamalla kappaletta kudosten tai kudoksen nauhat isopentaanissa jäähdytettiin nestemäisellä typellä seurasi säilytys -80 ° C: ssa. Viidestä kuuteen um osiin jäädytetty kudokset leikattiin Leica CM1900, säädetty kyytiin lasilevyille ja säilytetään pakastettuna (0-1 päivää) kunnes immunoreagoivat.}

immunoreaktiot ja reagenssit

vasta-aineita käytetään saatiin seuraavista lähteistä: PKC-a (H-7 ja C-20) ja CPI-17 (H-60) Santa Cruz Biotech, Santa Cruz CA; Vinkuliini ja Talin Sigma, Saint Louis, Missouri; Caveolin 1 BD Biosciences, San Jose, CA; Cy 2 ja Cy3 aasin anti hiiri tai kaniini: n päässä Jackson Immuno-, West Grove, PA; Alexa Fluor 594-phalloidin ja DAPI Molecular Probes, Eugene, OR. Kaikki nämä vasta-aineita on käytetty aiemmin laboratoriossamme immunohistokemiaan ja Western blotting jos ne osoittavat spesifisyyttä bändi oikean molekyylipainon kyseisen valkuaisaineen ilmoitettu [25], [26], [27]. Negatiiviset kontrollit, jossa primaarinen vasta-aine ei sisälly osoita mitään reaktiivisuutta näitä bändejä eikä immunofluoresenssilla kudosleikkeissä.

Jäädytetyt kudososat kyytiin lasilevyille sulatettiin huoneenlämmössä ja kiinnitettiin sitten 2% paraformaldehydillä 10 minuuttia, tehtiin läpäiseviksi 0,5% Triton X-100: ssa 10 minuuttia ja pysäytettiin 5 mg /ml BSA: ta 1 tunnin ajan ennen kuin niiden annetaan reagoida primaarisen vasta-aineen yli yön (4 ° C) ja sitten sopivan sekundäärisen vasta-aineen kanssa yhden tunnin ajan huoneenlämpötilassa. Kun sekundaarinen vasta-aine, kudokset inkuboitiin DAPI (0,5 uM), phalloidin (10-50 nM) tai DAPI /phalloidin sopiviksi värjäystä ytimet ja /tai rihmamaisia ​​aktiini. Useita pesuja käytettiin seuraavia ensisijaisen ja toissijaisen Inkubaatioiden ja counterstaining. Cover lasit kiinnitettiin käyttämällä puskuroitua 75% glyserolia 0,2% n-propyyligallaatti minimoimiseksi häipyminen. Kaikki immunoreagoimaan liuokset tehtiin PBS-Tween [(g /l: NaCl 8,0, KH _{2PO 4 0,2, Na 2HPO 4 1.15, KCI 0,2,), 1% tween- 20, pH 7,4] ja 0,1% BSA. Negatiiviset kontrollit sisältyvät 0,1% BSA: ta ilman, että ensisijainen vasta-aine, ja osoittaneet mitään immunoreaktiotuote.}

Microscopy

Osiot havaittiin käyttäen Olympus IX70 mikroskooppi epifluoresenssilla valaistus. Digitaaliset kuvat otettiin 16-bittinen Princeton Instruments (Princeton, NJ) CCD-kamera, ohjataan PCI aluksella kautta IPLab for Windows PC (Ver. 3.6, Scanalytics, Fairfax, VA). Kuvat otettiin käyttäen joko 100 × (1,3 NA) tai 60 × (1,25 NA) öljyä linssi tai 40 × (0,9 NA) ilma-objektiivi ja tallentaa tietokoneeseen. Emissiosuodattimia käytettiin 405, 490 ja 570 nm. Leikkeitä myös tarkastella myös Nikon -konfokaalimikroskoopilla (Nikon A1 konfokaali Eclipse Ti). Tavoitteet käytettiin 100 x (1,4 NA) öljyä linssi 425, 488 ja 561 nm. Samanlaisia ​​tuloksia havaittiin immunofluoresenssilla jakaumat käyttämällä näitä kahta eri järjestelmää.

Image Analysis of Distribution PKC /CPI-17 yksittäiset solut Kudokset

Profiilit Fluoresenssin intensiteetin otettiin yksittäiset solut poikittainen kudosleikkeet. Osiot havaittiin pienellä suurennoksella (10-20x) välttämiseksi alueille ilmeinen esineitä (kudoksen taitto, jäätyminen jne). Vuonna artefakti vapaa alue suurennus nostettiin 40-100x, ja kuvat otettiin näissä suurennettava. Kolme eri alueilla yhdessä kudoksessa jakso valittiin ottamaan kuvia. Z-pino sarjan otettiin erikseen kunkin kolmen värin kanavaa käytetään. 1 pm paksu Z kohdat otettiin, ja 15-25 Z osat otettiin kudos- osassa (luvut S1 & S2 osoittavat Z-pino esimerkkejä CPI-17 immunoreaktiivisuus antrumissa kanssa ja ilman kudosta aktivointia). Jokainen Z pino sarja tutkittiin kunkin osan tunnistamiseen keskiosaa z kuva, ja tämä kuva muunnettiin a.bmp tiedosto, joka tuotiin NIS-Elements AR 3,0 (Nikon) PC tietojen analysointiin.

Profiilit PKC-a ja falloidiinia fluoresenssin voimakkuus saatiin yksittäiset solut poikittainen kudosleikkeiden. Viiva vedettiin poikki keskellä kuvaa kentän. Kymmenen solut kulkee linjan valittiin mittauksiin. Perustuen edelliseen protokollia [25], viiden ensimmäisen pikselin (~0.7 um) kummallakin puolella solun, jossa phalloidin intensiteetti kasvoi voimakkaasti lähtötilanteesta määriteltiin solun kehällä. Sillä sytosolin mittauksia, linja on sijoitettu vähintään 2 um päässä solun kehän. Intensiteetin mittaukset tehtiin käyttämällä kiinnostuksen kohteena olevan alueen (ROI) suunnilleen keskellä solun (ja sytosolin mittaukset), tai pitkin solun kalvon (oheislaitteiden mittaukset). Johdonmukaisuuden koko ROI pidetään vakiona reuna ja sytosolin mittauksia. Solut osio hyvin pieni halkaisijat (ei pysty mittaamaan sytosolin ROI vähintään 2 um kehältä) tai ytimet läsnä (näkyvä DAPI värjäys paikkatietojen rajoituksia ja perinuclear soluelimiin voisi häpeään jakelu) jätettiin analyysin ulkopuolelle. Sillä PKC-a, suhde miedommilta PKC-a kehällä yli koko PKC-a-intensiteetti (summa PKC-a-intensiteettiä ROI kehällä ja ROI sytosoliin) käytettiin. Kymmentä solua per kenttä ja kolme eri alojen alistettiin mittaus- tietojen analysointia kunkin kudoksen alueen, eli kolmekymmentä solut laskettiin ja laskettiin keskiarvo kullekin näytteelle (N = 1). Lopullisen näytteen koko on n = 5.Jos samoja menettelyjä sovellettiin mitata intensiteetti CPI-17, paitsi että vain yksi kenttä on 10-soluja käytettiin kullekin näytteelle (N = 1), jossa on lopullinen näyte koko n = 3.

Mekaaniset Mittaukset

välittömästi ennen käyttöä, kudos nauhat leikattiin ja kiristetään molemmissa päissä, jossa kiinnittimet kiinnitetty välillä koukut paikallaan metallitanko ja isometrinen voima-anturi (Harvard Apparatus, Holliston, MA), PSS siihen johdettiin 95% O _{2/5% CO 2 vesivaippainkubaattorissa lihas kammiot (Radnoti Glass Technology, Monrovia, CA) 37 ° C: ssa. Pituus kunkin liuskan vaihdeltiin sijoittamalla paikallaan metalli sauva.}

Smooth lihaskudoksen nauhat (mahan antrum ja silmänpohjan) tasapainotettiin 1 h ja venytetään passiivinen jännitys lähentämällä Lo käyttäen lyhennetyn pituuden jännitys käyrä . Supistuvan kudokset, PSS korvattiin K ^{+ - PSS (109 mM KCI korvataan iso-osmoottisesti NaCl) [28]. Lihas liuskat aktivoitiin toistuvasti venyttämällä kudosta keskenään aktivointia, kunnes huippu voima ei enää osoittanut merkittävää kasvua edelliseen supistuminen. Chambers huuhdeltiin kolme kertaa PSS jokaisen kudoksen aktivoinnin. Ainakin kaksi toistettavissa peräkkäisen K + - PSS supistukset käytettiin saada standardin voima jälkeä 10 minuutin levätä välillä jokaisen supistuminen ennen koetta. Sitten kudokset aktivoitiin 1 uM karbakolia ja rento jälleen, kuten tehtiin aikana K + - PSS supistukset. Myöhemmät supistukset kaikki mukana 1 uM fentolamiinilla ja propranololia estää α- ja β - adrenergisiin reseptoreihin, vastaavasti. Viimeisen 1 uM CCh supistuminen ja pese, kudokset aktivoitiin 1 uM PDBu tallentaa niiden mekaaniset vaste.}

analyysi Force Data

Jännite signaaleja voima-antureiden oli digitalisoitu Powerlab 400 tai 4 SP laitteisto (ADInstruments, Castle Hill, Australia) visualisoida tietokoneen näytöllä (kuvio v3.6 tai 4,0, ADInstruments) kuin voima (g) 10 Hz: n ja tallentaa ohjelmiston komento kiintolevylle myöhempää analyysejä. Kuviot tehtiin taulukkolaskentaohjelman Excel 2000 (Microsoft, Redmond, WA).

geelielektroforeesi ja Western-blottaus

Proteiinin ilmentyminen analysoitiin kuten aiemmin on kuvattu [29]. Kudokset homogenisoitiin 50 mg /ml 0,125 M Tris, 2% natriumdodekyylisulfaattia (paino /tilavuus), 20% glyserolia, 0,1% bromifenolisinistä (paino /tilavuus) ja 20 mM ditiotreitolia. Proteiinit erotettiin matalan silloitusaineen natriumdodekyylisulfaattia geelit [30], ja immunoblottaus suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [31]. PKC-a-vasta-aine tunnisti joko yhden kaistan tai useammin on dubletti ~76 kD, kun taas CPI-17 vasta-aine tunnisti yhden juovan on noin 17 kD. Nämä koot ovat yhdenmukaiset odotetun kokoinen näiden proteiinien perusteella geelillä liikkuvuuden. Tarkkuuden varmistamiseksi Länsi blotit, lastaus käyrät tehtiin sekä vatsan silmänpohjan ja antrum näytteitä yli 5-kertainen erilaisia ​​kuormituksia (4-20 ui) aktiinin (Coomassie blue-värjäys) ja PKC-a ja CPI-17 (western blotting) . Tulokset osoittivat lineaarista suhdetta yli tällä alueella kaikki kolme proteiinit molemmissa kudoksissa (R ^{2 > 0,98 kaikki tulokset, n = 3). Kvantitointi PKC-a ja CPI-17-proteiinin ekspressio suoritettiin Western blot käyttäen 5-10 ui kuormitukset oli tällä lineaarisella alueella (n = 6).}

Tilastot

Tilastolliset vertailut tehtiin käyttäen Minitab (Minitab Inc. State College, PA). Yhden otoksen t-testiä käytettiin testaamaan jakeluun PKC-a /CPI-17 (perifeerinen täydelliseen ROI oli 0,5 osoittaa "yhtenäinen" jakautumisen sileän lihaksen soluissa (SMC)) antrumissa silmänpohjan alla lepää kunnossa. Yksi tapa ANOVA suoritettiin testaamiseksi PKC /CPI-17 jakelu eroja kahden kudosten eri stimuloivaa parametreja. Kaksi otoksen t-testejä käytettiin testaamaan merkitystä ero ilmentymistason PKC-a tai CPI-17 antrumissa silmänpohjan. Kahden pyrstö F-testi yhtäläiset kahden keskihajonnan (SDS) määritetty merkittävästi alhaisempi SD suhde caveolin ja PKC-a verrattuna SD suhde vinkuliini ja PKC-a. Arvo P < 0,05 katsottiin merkitseväksi kaikissa tilastollisia testejä. Ei tilastollisia testejä tehtiin sen voimatiedot ja kuvio 1 on edustavat samankaltaisia ​​tietoja 6 eri eläimistä. Western blot data on peräisin kuusi eläintä. PKC-a jakaumatiedot on keskimäärin kolmekymmentä solua mitattiin eläintä kohti ja viiden eläimen testattiin. CPI-17 jakaumatiedot on keskimäärin 10 solua mitattiin eläintä kohti ja kolme eläimet testattiin. Proteiini kolokalisaation data perustuu 'n' on vähintään 20 solua vähintään 3 eläintä.

Tulokset

Sian vatsa silmänpohjan on ensisijaisesti tonic sileää lihaskudosta, joka vastaa stimulaatio jossa jatkuva supistuminen kun antrumiin on ensisijaisesti phasic sileää lihaskudosta, joka vastaa stimuloitaessa ohimenevä supistuminen (Fig. 1). Kudoksissa nämä vasteet ovat todennäköisesti seurausta suoran stimulaation sileän lihaksen lisäämällä 1 uM propranololia (β-agonisti esto) ja fentolamiini (α agonisti esto) käytettiin estämään aktivointi reseptorien aiheuttaman mahdollisen vapautumisen sympaattinen välittäjäaineiden. Stimulointi sileän lihaksen kanssa PDBu käytetään rutiininomaisesti aiheuttamaan sileän lihaksen supistumisen kautta PKC aktivointi [32], [33], [34]. Yksi uM PDBu aiheuttaa pienen hidas supistuminen vatsaan silmänpohjan nauhat (-40% K ^{+ stimulaation vaste), kun antrumiin osoittaa olennaisesti mitään vastausta (< 5% K + stimulaatio) (Fig. 1). Ero jatkuva ja ohimenevää vasteet näiden kahden kudosten KPSS ja CCh, ja läsnäolo tai puuttuminen supistusvastetta vaste PDBu stimulaatio voi johtua ilmentymisen ja /tai tilan-ajallinen jakautuminen alavirran toisiolähettien (PKC-a ja CPI-17), joita väitettiin olevan vastuussa MLCP eston kanssa PDBu stimulaatiota. Tarkastella tätä mittasimme ekspressiotasot ja määritetään spatiaalisen-ajallisen jakautumisen PKC-a ja CPI-17 näissä kudoksissa.}

Kuvio 2 esittää Western blot tulokset ilmentymisen CPI-17 ja PKC-a-vatsassa antrumissa ja silmänpohjan. Kudokset käsiteltiin ohjaamiseksi proteiinipitoisuus, ja tulokset laskettiin perustuen intensiteetti vastaavan proteiinin signaalin, ja normalisoitiin aktiinin proteiinin ilmentymisen (Fig. 2). Molemmat menetelmät (vain normalisoitu data esitetty) osoittivat, ettei ilmentymisen CPI-17-proteiinin tai että PKC-a-proteiini on merkittävästi erilainen (p > 0,23 & p > 0,28 vastaavasti, n = 6), kun verrataan näitä kahta SM kudoksissa. Kontrollit tehtiin käyttäen erilaisia ​​kuormituksia vahvistaa erilaisia ​​lineaarisuuden lastaus, ja että näytteitä käytettiin kvantitointiin olivat tällä välillä (tietoja ei esitetty, katso menetelmät). Koska ei ole eroja ilmaisu näiden kahden proteiinin näiden kahden kudosten, me vieressä eteni onko eroja niiden spatiaalinen-ajallinen jakautuminen voisi selittää eron vastauksensa PDBu stimulaatiota.

Kuva 3 näyttää immuohistochemical tulokset jakelua PKC-a pituus- ja pyöreä kerroksittain silmänpohjan ja antrumiin. Under lepotilassa rentouttava ratkaisu, kun ei ole voimaa sukupolvi kudoksesta, The PKC-a näyttää olevan ainutlaatuisesti jaetaan ensisijaisesti lähellä kehälle SMC (Fig. 3- vihreä väri, PSS). Stimulointi kudoksiin 1 uM CCh (3 ') tai 1 uM PDBu (10 ja 30) ei muuta tätä reuna-jakelun PKC-a. Suhde jakelun PKC-a lähellä solukalvon suhteessa koko solun PKC-a on käytetty määrällisesti mahdollisten muutosten jakelu tämän proteiinin näissä erilaisissa olosuhteissa. Kuvio 4 esittää tulokset, kun suhde PKC-a-solun kehällä suhteessa koko PKC-a läsnä solussa (perifeerinen /(perifeerinen + sytosoliin), katso menetelmät). Suhde 0,5 osoittaisi "yhtenäinen" proteiinin jakautumista koko solu. PKC-a-suhde (perifeerinen /yhteensä) vaihteli +0,64-+0,68 kaikissa olosuhteissa tutkittiin. Nämä arvot ovat merkittävästi suurempia kuin 0,5 (p < 0,05), mikä osoittaa, että PKC-a sijaitsee ensisijaisesti solun reuna (se ei ole "tasaisesti" jakautunut solu) ja että jakaminen ei muuta välillä rento tai stimuloiduissa olosuhteissa.

Koska PKC-a ehdotetaan aktivoida CPI-17 etenimme määrittää spatiaalinen-ajallinen jakautuminen CPI-17 näissä kudoksissa samanlaisissa olosuhteissa. Kuva 5 näyttää immuohistochemical tulokset jakelua CPI-17 pituus- ja pyöreä kerroksittain silmänpohjan ja antrumiin. Under lepää olosuhteet rentouttava ratkaisu, kun ei ole voimaa sukupolvi kudoksesta, CPI-17 näyttää hajanaisesti jaettava koko SMC (Fig. 5 PSS, kuva S1). Stimulointi kudoksiin 1 uM CCh (30 ') (mutta ei 1 uM CCh 3', tuloksia ei ole esitetty) tai 1 uM PDBu (30 ') johtaa merkittävään muutokseen tässä jakelun siten, että CPI-17 näyttää nyt olla ensisijaisesti kehällä solun jakelu samanlainen kuin havaittiin PKC-a (Fig. 5, kuva S2). Suhde jakelun CPI-17 lähelle solukalvon suhteessa yhteensä CPI-17 (perifeerinen + sytosolinen) käytettiin määrittämään mahdollisia muutoksia jakeluun tämän proteiinin näissä eri olosuhteissa. Kuvio 4 esittää tulokset, kun suhde reuna-to-yhteensä CPI-17. CPI-17-suhde (perifeerinen /yhteensä) vaihteli +0,49-0,67 kaikissa kudoksissa ja olosuhteet tutkitaan. Suhde CPI-17 perifeerinen /yhteensä rennossa olosuhteissa ei ole merkittävästi erilainen kuin 0,5 (tarkoittaa 0,49-0,5; P > 0,19), mikä osoittaa, että CPI-17 diffuusisti jaettava koko sileälihassolujen tässä tilassa. Tämä ei muuta seuraavia 3 "1 uM CCh stimulaatiota ei ole vieläkään merkittävää eroa rento olosuhteissa (tarkoittaa = 0,53-0,55; P > 0,05) lukuunottamatta silmänpohjan kudokset, jossa CPI-17 perifeerinen /yhteensä suhde on merkittävästi suurempi (p < 0,05) 3 '(Fig. 4). 30 'on joko 1 uM CCh tai 1 uM PDBu stimulaatio, CPI-17 jakelu tulee merkittävästi suurempi kuin 0,5 kaikkiin kudoksiin ja kerrokset (keinoin = 0,62-,67, P < 0,01), mikä osoittaa, että CPI-17 sijaitsee nyt ensisijaisesti at solujen reuna (se ei enää "tasaisesti" jakautunut koko solu), samanlainen jakeluun PKC-a (Fig. 4).

pääasiassa perifeerinen jakauma PKC-a (alle sekä rento ja kannustanut olosuhteissa) ja CPI-17 (seuraava 30 'stimulaation CCh tai PDBu) ei ole yhtenäinen solun reunalla, mutta pistemäinen jakelun (Fig. 6). On myös pistemäinen jakelu anatomisesti ja toiminnallisesti erillisiä vyöliitos ja caveoli klo SMC solukalvon [26]. Sen määrittämiseksi, jos jakelun PKC-a ja CPI-17 kalvo vastaa pistemäinen kuvio vyöliitos, teimme kaksinkertainen merkintä, jossa on kaksi vyöliitos liittyviä proteiineja, vinkuliini ja Talin. Vaihtoehtoinen malli jakelun punaisen ja vihreän fluoroforien klo kalvot osoittavat, että PKC-a ja CPI-17 ei kolokalisoituvat joko vinkuliini tai Talin (Fig. 6), mikä viittaa siihen, että PKC-a ja CPI-17 eivät yhdistä kanssa vyöliitos monimutkainen olosuhteissa selvitimme. Koska caveoli vuorottelevat vyöliitos klo reuna-kalvo [26], PKC-a ja CPI-17 voi samanaikaisesti paikallistaa kanssa caveoli. Sen määrittämiseksi, pistemäinen jakelu PKC-a ja CPI-17 kalvo vastaa pistemäinen kuvio caveoli, teimme myös kaksinkertainen merkintä PKC-a kanssa caveolin. Jakelu PKC-a ja caveolin kolokalisoituvat membraanin sekä rento ja aktivoitu olosuhteissa voi havaittu ulkonäkö keltaista /oranssia fluoresenssia sijaan erillisiä punainen ja vihreä fluoresenssi (Fig. 6). Kahden pyrstö F-testi yhtäläiset kahden keskihajonnan (SDS) määritetty merkittävästi alhaisempi SD suhde caveolin ja PKC-a verrattuna SD suhde vinkuliini ja PKC-a (n = 20 solua; p < 0,05) . Lisäksi, kaksinkertainen merkintä PKC-a-CPI-17 aktivoinnin jälkeen kudoksen osoittaa myös merkittäviä co-localization (n = 20 solua; p < 0,05) näiden kahden proteiinin lähellä solukalvon (kuva 7). Nämä tiedot osoittavat, että PKC-a on ensisijaisesti paikallisesti lähellä caveloi on SMC solukalvon kaikkina aikoina, ja että sen jälkeen kudoksen aktivointi, merkittävä osa sytosolisen CPI-17 translokoituu caveoli on plasmassa, jossa se lokalisoituu PKC-a.

keskustelu

Smooth lihaskudoksen rutiininomaisesti luonnehtia olevan joko "tonic" (tuottaa hidas ylläpidetään isometrinen supistuminen) tai "phasic" (tuottaa nopeasti ohimenevä isometrinen supistuminen). Joukkojen muodostaminen ja /tai kudosten lyhentäminen SM uskotaan vaatia koholla myosiinikevytketjua fosforylaatio, ATP kulutus ja rajat silta pyöräily. Eräs mahdollinen mekanismi vastuussa näiden kahden supistuksia on ero Ca ^{2+ herkistymistä. Ca 2+ herkistymistä sileän lihaksen uskotaan suurelta osin johtua esto MLCP samanaikaisesti sen kanssa tai sen jälkeen aktivointi MLCK aikana kudoksen aktivoinnin [15], [35]. Yksi suurimmista polkuja ehdotti olla mukana Ca 2+ herkistyminen tapahtuu G-proteiiniin kytkettyjen reseptorien (GPCR) /fosfolipaasi C (PLC) /diasyyliglyserolia (DAG) /PKC /CPI-17 estää MLCP. GPCR: n, PLC, ja DAG ovat kaikki sijaitsevat /solukalvossa. Sijainti MLCP on epävarmempaa, mutta jossain vaiheessa seuraavissa kudoksessa aktivoinnin MLCP täytyy liittyä MLC _{20 myosiinin molekyylin paksuinen säikeiden jotta defosforyloivan tätä proteiinia. Koska paksu säikeet on raportoitu jaettava koko SMC sytoplasmaan [36], [37], [38], [39] mukaan MLCP on myös jaettava koko solulimaan jossain vaiheessa rentoutumista [40]. Jos MLCP sijaitsee sytosoliin ja lähellä MLC 20 aikana supistuminen ja PKC-a ja CPI-17 osansa estämällä MLCP aikana supistuminen, niin ainakin CPI-17 odotettaisiin sijaita sytosoliin joskus aikana supistuminen. Tulokset Tämän tutkimuksen osoittavat, että PKC-a etusijassa lokalisoitu lähellä solukalvon aikana rento ja aktivoidaan olosuhteissa ja että CPI-17 on myös edullisesti lokalisoitu lähellä solukalvon aikana aktivoitu olosuhteissa. Siten nämä tiedot viittaavat siihen, että erot PKCα- CPI-17 Ca 2 + herkistymistä koulutusjakson voi selittää tonic ja phasic SM supistukset mahassa silmänpohjan ja antrumiin ja lisätyötä tarvitaan määrittämään miten spatiaalinen-ajallinen jakautuminen CPI- 17 kanssa kudoksen aktivointi voi säädellä MLCP aiheuttamaan Ca 2 + herkistää SM supistumisesta ehjä SM kudoksissa.}}

Vaikka PDBu aiheuttaa hidas supistuminen silmänpohjan joka on -40%: n KPSS aiheuttama voima huipussa , pieni supistuminen syntyy antrumin kanssa PDBu stimulaatiota. Koska silmänpohjan ja antrum edustavat kahta perustyyppiä sileän lihaksen, tonic ja phasic vastaavasti vaikuttaa loogiselta syyksi eron voimassa sukupolven erillisiä ominaisuuksia phasic ja tonic lihas. Woodsome ym [41] ilmoitetaan, että ilmentymistaso CPI-17 tonic verisuonten SM on korkeampi kuin phasic verisuonten SM. Tämä voisi selittää eri kykyä tonic lihasten pitää voimassa (korkea pitoisuus CPI-17 estää MLCP avulla MLC _{20 fosforylaation pysyvän korkeana ja voimaa säilytettävä tonic SM). Tässä tutkimuksessa selvitettiin PKC-a ja CPI-17-proteiinin ilmentymisen ja jakelun sisäelinten sian vatsaan. Yllätykseksemme merkittävää eroa proteiinin ekspressiotaso PKC-a tai CPI-17 havaittiin välillä silmänpohjan ja antrum (Fig. 2).}

• PLoS ONE: Nikotiini Vaimentaa aktivointi Tissue Resident makrofagien Hiiri Vatsa kautta β2 asetyylikoliinin nikotiinireseptorin
• PLoS ONE: Kirurginen hoito potilailla, joilla krukenbergin tuumori vatsakirurgian Alkuperä: kliinistä hyötyä ja ennustetekijät Analysis