PLoS One: Tonic és fázisos simaizom-összehúzódást nem szabályozza a PKC - CPI-17 útvonal sertés gyomor Antrum és Fundus

absztrakt katalógusa

rendeletben miozin könnyű lánc foszfatáz (MLC) keresztül a protein kináz C ( PKC) és a 17 kDa-os PKC-potencírozza inhibitor a miozin könnyű lánc foszfatáz (CPI-17) leírták, mint a Ca ^{2+ érzékenyítés jelátviteli simaizom (SM), és így be lehet vonni tónusos vs. fázisos összehúzódások. A tanulmány a fehérje expressziója és a térbeli-időbeli eloszlását PKC és a CPI-17 intakt SM szövetekben. KCI vagy karbakol (CCh) stimulálása tónusos gyomor fundus SM generál tartós összehúzódást, míg a fázisos gyomor antrum generál átmeneti összehúzódás. Ezen túlmenően, a tónusos szemfenéki generál nagyobb relatív erő, mint fázisos antrum, 1 uM forbol-12, 13-dibutirátot (PBDu) stimulációs amely azt jelentette, hogy aktiválja a PKC - CPI-17 útvonalon. Western-blot vizsgálat azt igazolta, hogy ez a kontraktilis különbség nem volt okozta különbség a fehérje expresszióját PKC vagy a CPI-17 között, e két szövetekben. Immunhisztokémiai eredmények azt mutatják, hogy az eloszlás a PKC-a hosszanti és a körkörös rétegek a fundus és antrum nem különböznek, túlnyomórészt lokalizált közelében SM sejt plazmamembrán. Stimulálása vagy szövet 1 mM PBDu vagy 1 nmol CCh nem változtat ezen a perifériás PKC forgalmazás. Nincs különbség a két szövetekben a CPI-17 eloszlása, de ellentétben a PKC eloszlás, a CPI-17 úgy tűnik, hogy diffúz elosztani a citoplazmában alatt nyugodt szöveti körülmények között, de eltolódik egy elsősorban perifériás eloszlás a plazmamembrán stimulációjával járó a szövetek 1 mM PBDu vagy 1 nmol CCh. Eredmények a kettős jelölés azt mutatják, hogy sem a PKC, sem a CPI-17 co-lokalizálni a adherens junction (vinculin /talin) a membrán, de azok együtt lokalizálni egymással és a caveoli (Caveolin) a membrán. Ez nem az a különbség arra utal, hogy a PKC - CPI-17 útvonal nem felelős a tónusos vs. fázisos kontrakciók megfigyelt gyomor fundus és antrumban. Katalógusa}

Citation: Zhang Y Hermanson ME, Eddinger TJ (2013) Tonic és fázisos simaizom kontrakció nem szabályozza a PKC - CPI-17 útvonal sertés gyomor Antrum és fundus. PLoS ONE 8 (9): e74608. doi: 10,1371 /journal.pone.0074608 katalógusa

Szerkesztő: Wenhui Hu, Temple University School of Medicine, Amerikai Egyesült Államok katalógusa

Beérkezett: március 13, 2013; Elfogadva: augusztus 4, 2013; Megjelent: szeptember 18, 2013 katalógusa

Copyright: © 2013 Zhang et al. Ez egy nyílt hozzáférésű cikk feltételei szerint terjeszthető a Creative Commons Nevezd meg! Licenc, amely engedélyezi a korlátlan használatát, a forgalmazás és a reprodukció bármilyen adathordozón, feltéve, hogy az eredeti szerző és a forrás jóváírásra. Katalógusa

Forrás: Ez a munka támogatta a National Science Foundation (NSF), Biológiai tudományok Osztálya és a Doktori Iskola, Marquette Egyetemen. A finanszírozók nem volt szerepe a tanulmány tervezés, adatgyűjtés és elemzés, döntés, hogy közzéteszi, vagy a készítmény a kézirat. Katalógusa

Érdekütközés: A szerzők kijelentették, hogy nem ellentétes érdekek léteznek. Katalógusa

Bevezető

A mechanizmus (ok) meghatározására tónusos (tartós) vs. fázisos (átmeneti) simaizom (SM) összehúzódások továbbra is megoldatlan. Változatos beidegzés és a keringő jelző molekulák mellett egyedi receptor és protein (izoforma) expressziója és intracelluláris jelátviteli mechanizmusok bonyolítja a kérdést. Nem várt módon, van több javasolt hipotézisek megmagyarázni tónusos erő fenntartását SM, beleértve: slowly- vagy nem ciklikus simaizom miozin kereszthidak nevezett retesz hidak [1], [2], [3], [4]; felvételére nem-izom miozin II [5], [6], [7]; kialakulását caldesmon vagy calponin függő aktin-to-miozin átnyúló kapcsolatok [8], [9]; kialakulását Citoszkeletális erő-tartószerkezetek [10], [11], [12]; és szabályozása miozin LC _{20 foszforiláció révén második hírvivő utakat érintő miozin könnyű lánc kináz (MLCK) és a miozin könnyű lánc foszfatáz (MLC) tevékenység [13], [14], [15], [16], [17] [18]. Ez utóbbi kategóriát azért érdekes, mert a bejelentett eltérő expressziója, lokalizációja és szabályozása ezen második messenger fehérjék különböző SM szövetekben. Változó szabályozása MLCK és MLC-aktivitás nem csak egy eszköz Ca ^{2+ érzékenyítés, hanem egy lehetséges mechanizmusát tónusos vs. fázisos kontrakció. Inaktiválása MLC keresztül PKC -CPI-17 út lehetővé tenné karbantartott nagy miozin könnyű lánc (MLC 20) foszforiláció és így a tartós összehúzó erőt. Egy hiba, hogy inaktiváljuk MLC csökkentené MLC 20 foszforiláció és erő, ami a tranziens összehúzódás. Gyomor fundus SM generál tónusos (tartós) összehúzódást, míg a gyomor antrum SM generál fázisos (átmeneti) összehúzódása válaszul különböző ingerekre. Katalógusa}}

Ca ^{2+ érzékenyítés, amely magában foglalja az aktiválás G- fehérjéhez kapcsolt második messenger utakat, hogy érzékennyé a kontraktilis fehérjék [Ca 2 + _{i] gátlásával MLC, előfordulhat bármelyik számos utakat. Az egyik jelentett utak gátlására MLCP aktivitás magában foglalja a protein kináz C /C-kináz aktivált PP1 inhibitor fehérje 17 kDa (PKC /CPI-17) útvonal [19], [20]. G-kapcsolt fehérje receptor (GCPR) aktiválás aktiválását eredményezi a foszfolipáz C (PLC), hidrolizálja foszfatidilinozitol 4,5-biszfoszfát (PIP 2), hogy az inozit-1,4,5-trifoszfát (IP 3) és diacilglicerin (DAG). DAG ismert, hogy aktiválja a PKC amely okozhat foszforilációját CPI-17 szelektív gátlására MLC (felül zsigeri SM [17]). PKC úgy vélik, hogy szabályozza az aktiválás és térbeli eloszlásának a sejten belül, az utóbbi által vezérelt rögzítő fehérjéket, amelyek kötődnek és korlátozzák a helyét a PKC specifikus régióiban a sejt [21], [22]. Például beszámoltak konstitutívan aktív L-típusú Ca 2 + -csatornákat, és szabályozásuk PKC [23], [24] azt sugallja, hogy a PKC lokalizálódik közel a membrán simaizomsejtekben. A celluláris funkciója CPI-17 a sejt változhat attól függően, hogy szintű fehérje expresszió és attól, hogy a közelében található a plazmamembrán ahol PKC található /aktivált, vagy társított kontraktilis miozin vastag filamentumok ahol MLC lenne található a de -phosphorylate miozin könnyű lánc 20 (MLC 20). katalógusa}}

A kifejezés a PKC és a CPI-17 és a térbeli-időbeli újraelosztása upon szövet aktiválás javasoltak Ca ^{2+ érzékenyítés simaizom szövetek (felülvizsgálatra [14], [15], [16], [17]). Így lehetséges, hogy a különbségek a kifejezést és celluláris lokalizáció /transzlokáció lehetne részt meghatározására tónusos vs. fázisos összehúzódási válaszokat. Mert ez a két fehérje is részt vesz egy olyan útvonalat vesz részt gátló MLC tevékenység során szöveti aktiválását, és ezáltal okozva tonik vagy fázisos válasz, úgy kell kifejezni a megfelelő szinteken és elhelyezni a megfelelő helyen a cellában a megfelelő időben. Mivel PKC aktiválja DAG (a membrán kötött foszfolipid), azt is figyelembe kell venni a membrán legalább átmenetileg, hogy ez megtörténjen. És ha a CPI-17 fog gátolni MLC származó defoszforilálásával MLC _{20 a vastag szál, CPI-17 egy ponton kell lennie a citoszolban társított vastag filamentumok ott jelen. Ezzel a két lépést előforduló két térbelileg elkülönülő régió a sejt, az egyik vagy mindkét fehérje kell áthelyeződnek a másik régió számukra, hogy kölcsönhatásba lépnek, és befejezni a reakcióút.}}

A tanulmány célja az volt, hogy vizsgáljuk a feltételezést, hogy a PKC - CPI-17 Ca ^{2+ érzékenyítés útvonal meghatározásában érintett tónusos (tartós) és fázisos (átmeneti) összehúzódási válaszokat sima izmokat. Ehhez meghatároztuk a fehérje expressziója és a térbeli-időbeli eloszlását PKC és a CPI-17 fázisos gyomor antrum és tónusos gyomor fundus alatt nyugodt és aktivált körülmények között. Az eredmények nem mutató szignifikáns különbség kifejezése annak, hogy e két fehérje, sem a perifériás eloszlása ​​a két szövetek összeegyeztethetetlenek a feltételezést, hogy a PKCα- CPI-17 Ca 2+ érzékenyítés út a meghatározó tényező az tónusos vs. fázisos összehúzódási válaszokat észleltek ezekben a szövetekben. katalógusa}

módszerek katalógusa

szerv és szövet gépek katalógusa

Sertés szövetek (gyomor) nyerték Hansen Hús Service (Franksville, WI) és tegye hideg fiziológiás sóoldatot (PSS, (mM-ban): 140,1 NaCl, 4,7 KCI, 1,2 Na _{2HPO 4, 2,0 MOPS (pH = 7,4), 0,02 Na 2EDTA, 1,2 MgSO 4, 1.6 CaCI 2 és 5,6 glükóz). Gyomrokat tisztítani a vér, laza kötőszövet, és egyes esetekben, a nyálkahártya, és azonnal lefagyasztottuk, vagy tárolt PSS hűtőszekrényben 0-2 napig. Egyes szervek voltak friss fagyasztott lehető leghamarabb következő post mortem (60-90 perc). Egyes szervek inkubáltuk PSS és /vagy stimulált 1,0 um CCh vagy PBDu (Sigma), 37 ° C-on különböző időpontokban fagyasztás előtti. Változó inkubációs idők és az agonista koncentrációját is teszteltük. Az immunhisztokémiai összes szövetet fagyasztva tároltuk szekcionált és immunológiailag. Fagyasztás minden esetben az érintett forgalomba darab szöveteket vagy szövet csíkokat izopentánban lehűtjük folyékony nitrogénben, majd tárolás -80 ° C-on. Öt-hat um szakaszok a fagyasztott szöveteket vágjuk Leica CM1900 fagyasztóból, felvette tárgylemezen és fagyasztva tároltuk (0-1 nap), amíg immunológiailag. Katalógusa}

immunreakciókat és reagensek katalógusa

A felhasznált antitestek kaptuk a következő forrásokból: PKC (H-7 és C-20) és a CPI-17 (H-60), Santa Cruz Biotech, Santa Cruz CA; Vinculin és Talin a Sigma, St. Louis, Missouri; Caveolin 1 a BD Biosciences, San Jose, CA; Cy2 és Cy3 szamár anti-egér vagy nyúl másodlagos a Jackson Immuno, West Grove, PA; Alexa Fluor 594-falloidin és DAPI Molecular Probes, Eugene, OR. Mindezek antitesteket a korábban alkalmazott a laboratóriumunkban immunhisztokémiai és Western-blot, ahol mutatnak specifitást egy sávban a megfelelő molekulatömeg az adott fehérje jelzett [25], [26], [27]. A negatív kontrollok, ahol a primer antitest nem tartalmazza nem mutatnak reaktivitást Ezeknél a sávoknál, és nincs immunfluoreszcens a szöveti metszeteken.

Fagyasztott szöveti metszeteket felvette üveg tárgylemezeket szobahőmérsékleten felengedtük, és azután rögzíteni 2% paraformaldehiddel 10 perc, permeabilizált 0,5% -os Triton X-100-on 10 percig, és blokkoltuk 5 mg /ml BSA-t 1 órán való reagáltatása előtt az elsődleges antitesttel egy éjszakán át (4 ° C), majd a megfelelő másodlagos ellenanyag egy órán át szobahőmérsékleten keverjük. Miután a szekunder antitesttel, a szöveteket inkubáltuk DAPI-t (0,5 nM), phalloidin (10-50 nm) vagy DAPI /falloidinnel megfelelő megfestésére magok és /vagy fonalas aktin. Több mosás alkalmaztunk következő a primer és szekunder inkubálást, és a counterstaining. Fedő üvegek voltak szerelve a pufferelt 75% glicerin és 0,2% n-propil-gallát minimalizálása gyengült. Minden immunreakcióba oldatokat készítettünk PBS-Tween [(g /literben: NaCI 8,0, KH _{2PO 4 0.2, Na 2HPO 4 1,15, KCI 0,2,), 1% tween- 20, pH = 7,4], 0,1% BSA-t. A negatív kontrollok tartalmazza 0,1% BSA-t anélkül, hogy a primer antitest, és nem mutatott immunreakció.}

Mikroszkóp

A metszeteket megfigyelhető egy Olympus IX70 mikroszkóp epifluoreszcens megvilágítással. A digitális képek vettünk egy 16 bites Princeton Instruments (Princeton, NJ) CCD kamera, szabályozható a PCI kártya segítségével IPLab Windows PC-n (Ver. 3.6, Scanalytics; Fairfax, VA). Kép vettük segítségével akár 100 × (1,3 NA), vagy 60 × (1,25 NA) olaj lencse vagy egy 40 × (0,9 NA) levegő lencse és a számítógépen a tárolt. Emisszió használt szűrők 405, 490 és 570 nm-en. A metszeteket is megtekinthetők egy Nikon konfokális mikroszkóppal (Nikon A1 konfokális Eclipse Ti). A célok a következők voltak 100 × (1,4 NA) olaj lencse 425, 488 és 561 nm-en. Hasonló eredményeket figyeltek meg immunfluoreszcens eloszlás segítségével két különböző rendszer. Katalógusa

Image Analysis of Distribution PKC /CPI-17 az egyes sejtek szövetek katalógusa

Profiles fluoreszcencia intenzitásának vettünk az egyes sejtek keresztirányú szöveti metszeteken. A metszeteket megfigyelhető kis nagyítás (10-20x), hogy elkerülje területek látható hiba (szövet összecsukható, fagyasztva sérülés, stb.). Egy tárgy mentes terület nagyítását növeltük 40-100x és képek készültek a fenti nagyobb nagyításban is. Három különböző területein egy szöveti metszetek közül választották ki a képeket. Z-stack sorozat vettünk egyedileg a három szín használt csatornák. 1 um vastag Z metszeteket készítettünk, és 15-25 Z metszeteket készítettünk minden egyes szövet szakasz (a számok az S1 & S2 megjelenítése Z-stack példái CPI-17 immunreaktivitás antrumban és anélkül szövet aktiválás). Mindegyik Z stack sorozat vizsgáltuk az egyes részekben, hogy azonosítsa a középső z képet, és ez a kép alakult át a.bmp fájl, amelyet importált NIS-Elements AR 3.0 (Nikon) a PC az adatok elemzésére. Katalógusa

Profiles PKC és phalloidin fluoreszcencia intenzitást kapunk az egyes sejtek keresztirányú szöveti metszeteken. A vonalat húzott át a központ a képmezőben. Tíz sejtek átszeli a vonalat választottak mérésekhez. Alapján a korábbi jegyzőkönyvek [25], az első öt pixel (~0.7 um) mindkét oldalán a cellát, ahol a phalloidin intenzitás meredeken emelkedett a kiindulási értékhez definiáltuk a periférián a cellába. A citoszol mérések egy vonalat helyeztünk legalább 2 um-re a sejt perifériáján. Intenzitás méréseket végeztünk egy régió (ROI) nagyjából a közepén a sejt (a citoszolikus mérés), vagy végig a sejt membrán (perifériás mérés). A következetesség érdekében a méret a ROI állandó értéken tartjuk a perifériás és a citoszolikus méréseket. A sejteket a részben nagyon kis átmérőjű (nem képes mérni a citoszol ROI legalább 2 um a perifériáról) vagy magok jelen (látható DAPI-festés, ahol térbeli korlátozások és perinukleáris organellumok lehetett megszégyenítse a eloszlás) elemzésből kizártuk. A PKC, az arány az átlagos intenzitás PKC a periférián felett a teljes PKC intenzitás (SUM PKC intenzitását ROI kerületén és a ROI a citoszolban) használtunk. Tíz sejt per területen, és három különböző területeken vetettük alá, a mérési adatok elemzés minden szöveti régió, azaz harminc sejteket megszámoltuk, és átlagoltuk minden egyes minta (n = 1). A végső minta méretét n = 5.A azonos eljárásokat alkalmaztak mérésére intenzitását CPI-17, kivéve, hogy csak egy mező 10 sejteket alkalmaztunk minden egyes minta (n = 1), a végső minta mérete n = 3. katalógusa

mechanikus mérések katalógusa

Közvetlenül felhasználás előtt szövet csíkokat vágunk, és rögzíteni mindkét végén, a bilincsek közé erősített kampókat álló fémrúd és izometrikus erő átalakító (Harvard készülék, Holliston, MA), a PSS buborékoltatunk 95% O _{2/5% CO 2 vízköpenyes izom kamrák (Radnóti Glass Technology, Monrovia, CA), 37 ° C-on. A hossza az egyes csík változtattuk áthelyezésével az álló fémrúd.}

simaizom szövetre csíkok (gyomor antrum és fundus) kiegyensúlyozzuk 1 órán és kinyújtva egy passzív feszültség közelítő Lo segítségével egy rövidített hossz-feszülés görbe . Szerződéskötési szövetek, PSS váltotta K ^{+ - PSS (109 mM KCl helyettesített iso-ozmotikus NaCl) [28]. Az izom csíkokat aktivált többször nyúlik a szövetek között, minden bekapcsoláskor, amíg csúcs erő már nem mutatott jelentős növekedést jelent az előző összehúzódás. Chambers átöblítjük háromszor PSS követő szöveti aktiválást. Legalább két ismételhető egymás utáni k + - PSS kontrakciókat használják, hogy egy szabványos erő nyom egy 10 perces pihenés között minden összehúzódás megkezdése előtt a kísérletet. A szöveteket ezután aktiválódik 1 umol carbachol és nyugodt újra, amint ott végzett K + - PSS összehúzódások. Ezután következő összehúzódásokat mind benne 1 umol fentolamin és a propranolol, hogy blokkolja α- és β - adrenerg receptorokat, ill. A végleges 1 nmol CCh összehúzódás és mossa a szöveteket aktivált 1 nM PBDu felvenni a mechanikai választ. Katalógusa}

elemzése Force adatok katalógusa

Feszültség jeleket erőmérőműszerek digitalizáltuk Powerlab 400 vagy 4 SP hardver (ADInstruments, Castle Hill, Ausztrália) láthatóvá a számítógép képernyőjén (kör v3.6 vagy 4.0, ADInstruments), mint erő (g) 10 Hz és tárolt szoftver paranccsal egy merevlemez későbbi elemzések. Ábrák készültek a táblázatkezelő program az Excel 2000 (Microsoft, Redmond, WA). Katalógusa

gélelektroforézis és Western-blot katalógusa

A fehérje expresszióját elemeztük a korábban leírtak szerint [29]. A szöveteket homogenizáljuk 50 mg /ml 0,125 M Tris, 2% nátrium-dodecil-szulfát (tömeg /térfogat), 20% glicerin, 0,1% brómfenolkék (súly /térfogat) és 20 mM ditiotreitolt. A fehérjéket megoldódott az alacsony keresztkötési nátrium-dodecil-szulfát gélen [30] és immunblot analízist végeztünk a korábban leírtak [31]. A PKC-antitest felismerte vagy egyetlen sávot, vagy gyakrabban egy dublett ~76 kD, míg a CPI-17 ellenanyag elismert egyetlen sávot ~17 kD. Ezek a méretek összhangban vannak a várt méretű ezek a fehérjék alapuló gél mobilitást. A pontosság érdekében a Western-blot, rakodási görbéket vettünk mindkét gyomor fundus és antrumban minták több mint 5-szörös körű terhelések (4-20 pl) aktin (Coomassie kék festés) és PKC és a CPI-17 (Western blot) . Az eredmények lineáris összefüggést mutatott ebben a tartományban mindhárom fehérjék mindkét szövetben (R ^{2 0,98 bármilyen eredmény, n = 3). Kvantitatív PKC és a CPI-17 fehérje expressziója végeztük Western blot segítségével 5-10 ul terhelések, amelyeknek belül volt ez lineáris tartományban (n = 6).}

Statisztika

Statisztikai összehasonlítást végeztünk segítségével MINITAB (Minitab Inc. State College, PA). Egymintás t-tesztet használtunk, hogy teszteljék a eloszlását PKC /CPI-17 (a perifériás teljes ROI tartalom 0,5 jelzi a "egységes" eloszlás simaizomsejtekben (SMC-k)) A antrumban és fundus alatt nyugalmi állapotban. Egyutas ANOVA-t végeztünk annak vizsgálatára, hogy a PKC /CPI-17 forgalmazási különbség a két szövetek különböző stimuláló paraméterekkel. Kétmintás t-próbát alkalmaztunk, hogy teszteljék a jelentősége különbség expressziós szintjének PKC vagy CPI-17 antrumban és fundus. Egy kétfarkú F-próba az egyenlőség két standard deviáció (SDS) határozzuk meg lényegesen kisebb SD arányban Caveolin a PKC-ha összehasonlítjuk a SD arányának vinculin a PKC. A p < 0,05 értéket tekintettük szignifikánsnak a statisztikai próbák. Nincs statisztikai vizsgálatokat végeztek az erő adatok és az 1. ábrán reprezentatív hasonló adatokat 6 különböző állatokat. Western-blot adatok hat állatokat. PKC eloszlási adatokat átlagosan harminc sejtek mért állatonként és öt állatot vizsgáltunk. CPI-17 forgalmazási adatok átlagosan 10 sejtek mért állatonként és három állatot vizsgáltunk. Protein kolokalizációs adatok alapján egy "n" legalább 20 sejt legalább 3 állat. Katalógusa

Eredmények katalógusa

sertés gyomor fundus egy elsősorban tónusos sima izomszövet, amely reagál a stimulációra egy tartós összehúzódást, míg a antrum egy elsősorban fázisos sima izomszövet, amely reagál a stimulálás tranziens összehúzódás (ábra. 1). A szövetekben ezek a válaszok valószínűleg eredményeként közvetlen ingerlése a simaizom mint hozzáadunk 1 uM propranolol (β-agonista blokkoló) és fentolamin (α-agonista blokkoló) arra használták, hogy megakadályozzák aktiválását adrenerg receptorok miatt lehetséges felszabadulását szimpatikus neurotranszmitterek. A simaizom stimulálása a PBDu használják rutinszerűen okoz simaizom összehúzódás keresztül a PKC aktiválás [32], [33], [34]. Egy uM PBDu okoz egy kis lassú összehúzódása gyomor fundus csíkokat (~40% K ^{+ stimuláció válasz), míg az antrum lényegében nem mutat választ (< 5% K + stimuláció) (ábra. 1). A különbség a tartós és átmeneti reakciók e két szövetek KPSS és a CCH, és a jelenléte vagy hiánya egy összehúzódási válasz PBDu stimulálás lehet az oka, hogy az expressziós és /vagy térbeli-időbeli eloszlása ​​a downstream második hírvivők (PKC és CPI-17), amelyek állítólag felelősek MLC gátlás PBDu stimuláció. Hogy vizsgálja meg ezt mértük az expressziós szintek és meghatároztuk a térbeli-időbeli eloszlása ​​PKC és a CPI-17 ezekben a szövetekben.}

A 2. ábra mutatja Western-blot eredménye expresszióját CPI-17 és PKC-a gyomorban antrum és fundus. A szöveteket feldolgozott kontrollálva fehérje koncentráció, és az eredményeket alapján számítottuk az intenzitása a megfelelő fehérje szignál, és normalizáltuk aktin fehérje expresszió (ábra. 2). Mindkét módszer (csak normalizált adatokat mutatjuk be) azt mutatta, hogy sem a kifejezés a CPI-17 fehérje, sem a PKC-fehérje jelentősen különbözik (p > 0,23 & p > 0,28 -kal, n = 6), ha összehasonlítjuk a két SM szövetekben. Controls végeztünk egy sor terhelések, hogy erősítse meg a tartományban linearitás a berakodás, és hogy a használt minták mennyiségi voltak ebben a tartományban (adatokat nem köziünk, lásd módszerek). Mert nincs különbség a kifejezés e két fehérje a két szövetek, mi mellett azt vizsgálta, hogy különbségek vannak a térbeli-időbeli eloszlását megmagyarázhatja a különbség a válaszok PBDu stimuláció. Katalógusa

A 3. ábra mutat immuohistochemical eredmények eloszlásának PKC hosszanti és körkörös rétegek a szemfenéki és antrum. Nyugalmi körülmények között relaxáló oldatban, ha nincs erő létrehozásának a szövet, a PKC-úgy tűnik, hogy egyedileg elosztott preferenciálisan kerülete közelében a SMC-k (ábra. 3- zöld színű, PSS). Serkenti a szövetek 1 nmol CCh (3 ') vagy 1 mM PBDu (10 és 30), nem változtat ezen a perifériás eloszlása ​​PKC. Az arány az eloszlása ​​a PKC közel a plazmamembrán viszonyított teljes sejt PKC-t használunk, hogy mennyiségileg lehetséges eloszlásának változása a fehérje mellett a különböző körülmények között. A 4. ábra mutatja az eredményeket, mint az arány a PKC-a sejt perifériáján képest a teljes PKC jelen a sejtben (perifériás /(perifériás + citoszol), lásd módszerek). A arány 0,5 azt jelzi, "egységes" elosztás a protein az egész sejtben. A PKC arány (perifériás /összes) között mozgott 0,64-0,68 minden körülmények között vizsgálni. Ezek az értékek lényegesen nagyobb, mint 0,5 (p < 0,05), jelezve, hogy PKC található elsősorban a sejt perifériáján (ez nem "egyenletesen" elosztott a sejtben), és hogy ez az eloszlás nem változik közötti relaxált vagy stimulált körülmények között.

Mivel PKC javasolják, hogy aktiválja a CPI-17, haladtunk, hogy meghatározzák a térbeli-időbeli eloszlását CPI-17 a szövetekben hasonló feltételek mellett. 5. ábra mutat immuohistochemical eredmények eloszlásának CPI-17 a hosszanti és a körkörös réteg a szemfenéki és antrum. Nyugalmi körülmények relaxáló megoldás, amikor nincs erő generáció által a szövetet, a CPI-17 úgy tűnik, hogy diffúz elosztani a SMC-k (ábra. 5- PSS, Fig. S1). Stimuláció a szövetek 1 uM CCh (30 ') (de nem 1 uM CCh 3', az adatokat nem mutatjuk be) vagy 1 uM PBDu (30 ') eredményez jelentős változást ebben eloszlása ​​olyan, hogy a CPI-17 Most úgy tűnik, hogy elsősorban a periférián a cellát egy eloszlás hasonló a megfigyelt PKC (ábra. 5, Fig. S2). Az arány az eloszlása ​​a CPI-17 közelében, a plazma membrán viszonyított teljes CPI-17 (perifériás + citoszolikus) használtunk számszerűsíteni lehetséges változások eloszlását ezen fehérje mellett ezeket a különböző körülmények között. A 4. ábra mutatja az eredményeket, mint az arány a perifériás-to-teljes CPI-17. A CPI-17 arány (perifériás /összes) között mozgott 0,49-0,67 minden szövetben és feltételek vizsgálni. Az arány a CPI-17 perifériás /összes nyugodt körülmények nem különbözik jelentősen, mint 0,5 (azt jelenti, 0,49-0,5; p > 0,19), jelezve, hogy a CPI-17 diffúzan eloszlik a simaizomsejtek ilyen feltételek mellett. Ez nem változtatja következő 3 '1 uM CCh stimuláció mivel még mindig nincs szignifikáns különbség a nyugodt körülmények között (azt jelenti, = 0,53-0,55; p > 0,05), kivéve a fundus szövetekben, ahol a CPI-17 perifériás /összes arány szignifikánsan nagyobb (p < 0,05) 3 '(ábra. 4). 30 'vagy 1 nmol CCh vagy 1 nM PBDu stimuláció, a CPI-17 elosztó képessége lényegesen nagyobb, mint 0,5 minden szövetre, és rétegek (eszközök = 0,62-0,67, P < 0,01), ami azt jelzi, hogy a CPI-17 jelenleg található elsődlegesen a sejtek periférián (ez már nem "egyenletesen", melyek a sejt), hasonlóan az elosztó PKC (ábra. 4). katalógusa

a elsődlegesen perifériás eloszlása ​​PKC (amelyek mind a nyugodt és stimulált körülmények között) és a CPI-17 (következő 30 'stimulálás CCh vagy PBDu) nem egységes a sejt perifériáján, hanem pettyes eloszlásban (6.). Van is egy pontszerű eloszlása ​​a anatómiailag és funkcionálisan elkülönülő adherens csomópontok caveoli a SMC plazmamembrán [26]. Annak megállapítása érdekében, ha az elosztás a PKC és a CPI-17 a membrán megfelel a pettyes mintázat adherens csomópontok, csináltunk kettős jelölés két adherens junction asszociált fehérjék, vinculin és talin. Az alternatív minta eloszlása ​​a piros és zöld Fluorofórok a membránok azt mutatják, hogy a PKC és a CPI-17 nem együtt lokalizálni akár vinculin vagy talin (6.), Ami arra utal, hogy a PKC és a CPI-17 nem állnak össze az adherens junction komplex feltételek alapján megvizsgáltuk. Mivel caveoli váltakoznak a adherens csomópontok a perifériás membrán [26], PKC és a CPI-17 lehet együtt lokalizálja a caveoli. Annak meghatározására, hogy a pontszerű eloszlása ​​a PKC és a CPI-17 a membrán megfelel a pontszerű mintát a caveoli, mi is volt kettős jelölés PKC a Caveolin. A terjesztési PKC és Caveolin co-lokalizálódik a membrán mindkét nyugodt és aktivált feltételekkel lehet figyelték meg a megjelenését a sárga /narancs színben fluoreszkál helyett különböző piros és zöld fluoreszcencia (6.). Egy kétfarkú F-próba az egyenlőség két standard deviáció (SDS) határozzuk meg lényegesen kisebb SD arányban Caveolin a PKC-ha összehasonlítjuk a SD arányának vinculin a PKC (n = 20-sejtek; p < 0,05) . Ezen túlmenően, a kettős címkézése PKC-a CPI-17 aktiválást követően a szövet is mutatja, jelentős co-lokalizáció (n = 20-sejtek; p < 0,05) a két fehérje közel a plazma membrán (ábra. 7). Ezek az adatok azt mutatják, hogy a PKC elsősorban lokalizált közelében caveloi a SMC plazmamembrán mindenkor, és hogy a következő szöveti aktiváció, egy jelentős része a citoszol CPI-17 transzlokálódik a caveoli a plazma, ahol együtt lokalizálódik az PKC.

Vita katalógusa

Smooth izomszövetek rutinszerűen jellemzi, hogy vagy a "frissítő" (így egy lassú karbantartott kontrakciót) vagy a "fázisos" (így egy gyors átmeneti izometriás kontrakció). Force-termelés és /vagy szöveti rövidülést SM úgy gondolják, hogy emelt, miozin könnyű lánc foszforilációja, ATP-fogyasztás és a határokon hídon kerékpáros. Egy lehetséges mechanizmus felelős a két fajta összehúzódások differenciál Ca ^{2+ túlérzékenységet. Ca 2+ érzékenyítés simaizom véljük nagy részben annak köszönhető, hogy a gátlása MLC egyidejű, vagy azt követően, hogy az aktiválás MLCK alatt szövet aktiválás [15], [35]. Az egyik fő utak javasolt, hogy részt vesz a Ca 2+ szenzibilizáló keresztül a G-fehérje-kapcsolt receptorok (GPCR) /foszfolipáz C (PLC) /diacilglicerin (DAG) /PKC /CPI-17 gátlására MLC. GPCR-k, PLC, és a DAG mind található a /a plazmamembrán. A helyszín a MLC kevésbé biztos, de egy bizonyos ponton az időben következő szövet aktiválás MLC kell társított MLC _{20 a miozin molekula a vastag filamentumok érdekében defoszforiláljuk ez a fehérje. Mivel vastag szálak leírták, hogy kell elosztani a SMC citoplazma [36], [37], [38], [39], az MLC is kell elosztani a citoplazmában egy bizonyos ponton a relaxáció során [40]. Ha MLC belül található a citoszolban és a közeli MLC 20 alatt összehúzódás, és PKC és a CPI-17 szerepet játszik a gátlására MLC alatt összehúzódás, akkor legalább CPI-17 várhatóan belül kell elhelyezkedniük citoszolban valamikor alatt összehúzódás. A vizsgálat eredményei azt mutatják, hogy PKC preferenciálisan lokalizálódik közelében a plazma membrán alatt nyugodt és aktivált feltételek, és hogy a CPI-17 szintén előnyösen lokalizált közelében, a plazma membrán alatt aktivált körülmények között. Ezek az adatok tehát arra utalnak, hogy a különbségek a PKCα- CPI-17 Ca 2+ érzékenyítés útvonal nem tudja megmagyarázni tónusos és fázisos SM összehúzódások gyomor fundus és antrumban és további munkára van szükség annak megállapítására, hogy a térbeli-időbeli eloszlása ​​CPI- 17-es szövet aktiválás lehet szabályozni MLC okoz Ca 2+ túlérzékenységet SM összehúzódás ép SM szövetekben. katalógusa}}

Bár PBDu okozza a lassú összehúzódás a szemfenéki ami ~40% -a KPSS kiváltott csúcs erő , kis összehúzódás keletkezik a antrumban a PBDu stimulációt. Mivel fundus és antrumban képviseli két alaptípusa simaizom, tonik és fázisos illetve logikusnak tűnik tulajdonítani a különbség a hatályos nemzedék eltérő tulajdonságai fázisos és tónusos izmok. Woodsome munkatársai [41] beszámolt arról, hogy az expressziós szintje a CPI-17 tónusos vaszkuláris SM magasabb, mint a fázisos vaszkuláris SM. Ez megmagyarázhatja a különböző képességét tónusos izmok fenntartásához erő (magas koncentrációjú CPI-17 gátolja MLC lehetővé MLC _{20 foszforiláció magas marad, és erőt kell tartani tónusos SM). Ez a tanulmány azt vizsgálta PKC és a CPI-17 fehérje expressziója és eloszlása ​​a zsigeri sertés gyomor. Meglepetésünkre, nincs szignifikáns különbség a fehérje expressziós szintjét PKC vagy a CPI-17 volt kimutatható között a fundus és antrum (ábra. 2).}

• PLoS One: nikotin csillapítja aktiválása Tissue Resident makrofágok egér gyomor keresztül β2 nikotin acetilkolin receptor
• PLoS One: Sebészeti kezelés betegek Krukenberg Tumor a gyomor Origin: klinikai eredmények, valamint prognosztikai faktorainak elemzése