Plos ONE: Tonic in fazno krčenja gladkih mišic ne ureja na PKCα - CPI-17 Pathway v Prašičja trebuhu antruma in Fundus

Povzetek

Urejanje miozin lahke verige fosfataze (MLCP) preko protein kinaze C (PKC) in 17 kDa PKC-potencira zaviralec miozin lahke verige fosfataze (CPI-17) je bila prijavljena kot Ca ^{2+ preobčutljivost signalizacijo pot v gladkih mišic (SM), in tako lahko sodelujejo v tonik vs fazno popadkov. Ta študija je preučila izražanje proteinov in prostorsko-časovno razporeditev PKCα in CPI-17 v neokrnjenih SM tkivih. KCl ali karbahola (CCH) spodbujanje tonik želodec Fundus SM ustvari trajno krčenje, medtem ko je fazno želodec antruma ustvarja prehodno krčenje. Poleg tega tonično fundus ustvari večjo relativno moč kot fazno antruma z 1 iM forbol 12, 13-dibutirata (PDBu) stimulacije, ki se poroča aktivirati PKCα - CPI-17 poti. Western blot analize so pokazale, da je ta kontrakcije razlika z razliko v izražanju proteinov PKCα ali CPI-17 med tema dvema tkiva ni povzročil. Imunohistokemične rezultati kažejo, da je porazdelitev PKCα v vzdolžnih in okroglih plasti fundusa in antruma ne razlikujejo, pri čemer pretežno lokalizirane v bližini SM celica plazemske membrane. Stimulacija bodisi tkiva z 1 um PDBu ali 1 iM CCH ne spreminja tega periferno distribucijo PKCα. Obstajajo med tema dvema tkiv za distribucijo CPI-17 nobene razlike, toda za razliko od distribucije PKCα Videti CPI-17 se difuzno porazdeljene po vsej citoplazmi pod sproščen pogojih tkivo, ampak premakne v prvi vrsti obodni porazdelitvi na plazemski membrani s stimulacijo tkiva z 1 um PDBu ali 1 um CCH. Rezultati dvojnem označevanju kažejo, da niti PKCα niti CPI-17 co-lokalizira na adherens križišču (vinculin /Talinu) na membrani, vendar ne sodelujejo locirajo s seboj in s caveoli (caveolin) na membrano. To pomanjkanje razlike kažejo, da je PKCα - je CPI-17 pot ni odgovoren za tonik v primerjavi s fazno popadkov, ugotovljenih v želodcu fundusa in antruma}

Navedba sklicevanja: Zhang Y, Hermanson ME, Eddinger TJ (2013) tonik. in fazno krčenja gladkih mišic ne ureja na PKCα - CPI-17 Pathway v Prašičja trebuhu antruma in očesnega ozadja. PLoS ONE 8 (9): e74608. doi: 10,1371 /journal.pone.0074608

Urednik: Wenhui Hu, Temple University School of Medicine, Združene države Amerike

Prejeto: 13. marca 2013; Sprejeto: 4. avgust 2013; Objavljeno: 18. september 2013

Copyright: © 2013 Zhang et al. To je odprtega dostopa članek razširja pod pogoji Creative Commons Attribution License, ki omogoča neomejeno uporabo, distribucijo in razmnoževanje v katerem koli mediju, pod pogojem, da prvotni avtor in vir knjižijo

Financiranje:. To delo je bil podprt s strani National Science Foundation (NSF), biološki Oddelek znanosti in Graduate School, Marquette University. Med financerji imel nobene vloge pri oblikovanju študije, zbiranje in analizo podatkov, sklep, da se objavi, ali pripravi rokopisa

nasprotujočimi si interesi.. Avtorji so izjavili, da ne obstajajo konkurenčni interesi

Uvod

mehanizem (i) določitev tonik (trajno) v primerjavi s fazno (prehodna) gladkih mišic (SM) kontrakcije ostaja nerešen. Raznolika oživčenje in kroži signalnih molekul poleg edinstvenega receptor in beljakovin (izoencima) izražanja in znotrajceličnih signalnih poti zaplete vprašanje. Ni nepričakovano, obstaja več predlagane hipoteze, da pojasni vzdrževanje tonik sile v SM, vključno z: slowly- ali brez kolesarjenje gladkih mišic miozin prečnih mostov imenovanih zapah mostovi [1], [2] [3] [4]; Izbira ne-mišične miozin II [5] [6] [7]; oblikovanje caldesmon ali calponin odvisnih navzkrižnih povezav aktin-do-miozin [8], [9]; oblikovanje citoskeletnim-sil ob struktur [10] [11] [12]; in ureditev miozin LC _{20 fosfatnem preko sekundarnega sporočilnega poti, ki vplivajo na miozin lahke verige kinaze (MLCK) in miozina lahke verige fosfataza (MLCP) dejavnosti [13] [14] [15] [16] [17] [18]. Ta zadnja kategorija je zanimiv zato, ker iz poročila diferencialne izražanja, lokalizacijo in urejanje teh sekundarnega sporočilnega beljakovin v različnih SM tkivih. Spremenljivka ureditev MLCK in MLCP dejavnosti lahko zagotovi ne le sredstvo za Ca ^{2+ senzibilizacije, ampak tudi morebitno mehanizem za tonik v primerjavi s fazno krčenje. Inaktivacija MLCP preko PKCα -CPI-17 poti bi omogočilo vzdržuje visoko miozin lahke verige (MLC 20) fosforilacije in s tem trajno krčenja sile. Neuspeh, da se inaktivira MLC bi zmanjšala MLC 20 fosforilacijo in sile, kar ima za posledico prehodno krčenje. Želodec fundus SM ustvari tonik (trajno), krčenje, medtem ko v želodcu antruma SM ustvari fazno (prehodno) krčenje kot odgovor na različne dražljaje.}}

Ca ^{2+ preobčutljivost, ki vključuje aktivacijo G- -protein povezan drugi sel poti, ki dovzetnost Krčenje beljakovine [Ca 2 + _{i] z zaviranjem MLC, se lahko pojavi pri katerikoli izmed številnih poti. Eden izmed prijavljenih poti za inhibicijo MLCP dejavnosti vključuje protein kinaza C /C-kinaze aktivira PP1 inhibitor protein z dne 17. kDa (PKC /CPI-17) poti [19], [20]. Aktivacija G-povezan protein receptor (GCPR) posledica aktivacije fosfolipaze C (PLC), hidrolizira fosfatidilinozitol 4,5-bifosfat (PIP 2) za proizvodnjo inozitol 1,4,5-trisphosphate (IP 3) in diacilglicerol (DAG). DAG je znano, da aktivira PKC ki lahko povzroči fosforilacijo CPI-17, da selektivno zavira MLC (pregledano trebušne SM v [17]). PKC je verjel, da je treba urediti s svojo aktivacijo in prostorski razporeditvi znotraj celice, pri čemer se jih sidranje proteine, ki se vežejo na in omejitev lokacijo PKC na določenih regijah celice [21], [22] je imela. Na primer, poročila o konstitutivno aktivno L-tipa Ca 2 + kanalov in njihova ureditev, ki PKC [23], [24] kažejo, da se PKC lokalizirana v bližini membrane v gladkih mišičnih celicah. Celična funkcija CPI-17 v celici lahko razlikujejo glede na stopnjo izražanja proteinov in ali se nahaja v bližini plazemske membrane, kjer se PKCα nahaja /aktiviran, ali povezano z kontrakcije miozin debelih vlaken, kjer bi MLC, ki se nahajajo na de -phosphorylate miozin lahke verige 20 (MLC 20).}}

izraz PKCα in CPI-17 in njihovo prostorsko-časovno prerazporeditev ob aktiviranju tkivnega so bili predlagani v Ca ^{2+ preobčutljivost gladkih mišičnih tkiv (za pregled [14] [15] [16] [17]). Tako je možno, da bi se razlike v njihovem izražanju in celične lokalizacije /prenosom vpleteni pri določanju tonik vs fazno kontraktilnih odzivov. Za ti dve beljakovine, da bo del poti, ki sodelujejo pri zaviranju MLCP aktivnosti med aktivacijo tkiva in s tem povzroča tonik ali fazno odziv, morajo biti izraženi na ustreznih ravneh in postavljen na pravem mestu v celici ob pravem času. Ker je PKC aktivira DAG (membrano vezan fosfolipidov), mora biti tudi na membrano vsaj začasno, da se to zgodi. In če CPI-17 gre za zaviranje MLC iz dephosphorylating MLC _{20 na debelih vlaken, CPI-17 na neki točki mora biti v citosolu povezano z debelimi filamenti prisotni. S temi dva koraka, ki se pojavljajo v dveh prostorsko ločenih regijah celice, enega ali obeh teh proteinov mora translocira v drugi regiji za njihovo interakcijo in dokončanje poti.}}

Namen te študije je bil preveriti hipoteza, da PKCα - je CPI-17 Ca ^{2+ preobčutljivost pot vključeni v določitev tonik (trajno) in fazno (prehodne) Krčenje odgovore na gladkih mišic. Da bi to naredili smo ugotovili izražanje proteinov in prostorsko-časovno razporeditev PKCα in CPI-17 v fazno želodcu antruma in tonik v želodcu fundusa pod sproščeno in aktiviranih pogoji. Rezultati kažejo, da ni značilnih razlik v izražanju koli od teh dveh proteinov, niti v njihovi periferni distribuciji med tema dvema tkiv so v nasprotju s hipotezo, da 2+ preobčutljivost pot je PKCα- CPI-17 Ca odločilni dejavnik za tonic vs. kontraktilnih odgovorov fazno opazili v teh tkivih.}

metod

organov in tkiv Ravnanje

prašičev tkiva (želodci) so bili pridobljeni iz Hansen mesa storitve (Franksville, WI) in mu v mrzli fiziološki raztopini soli (PSS (v mm): 140,1 NaCl 4,7 KCI, 1,2 na _{2HPO 4, 2,0 MOPS (pH 7,4), 0,02 na 2EDTA, 1,2 MgSO 4, 1,6 CaCl 2, in 5,6 glukoze). Želodcev bili očiščeni krvi, ohlapne vezivnega tkiva, in v nekaterih primerih sluznica in takoj zamrznemo ali shranjeni v PSS v hladilniku 0-2 dni. Nekateri organi so bili sveže zamrznjene v najkrajšem možnem času po obdukciji (60-90 minut). Nekateri organi inkubiramo v PSS in /ali stimulirano z 1,0 uM CCH ali PDBu (Sigma) pri 37 ° C, pri različnih časovnih točkah pred zamrzovanjem. Spremenljivi časi inkubacije in agonisti koncentracije smo testirali tudi. Za imunohistokemijo smo imeli vse tkivo shranijo zamrznjene do prerezana in immunoreacted. Zamrzovanje v vseh primerih vpletenih dajanje kosov tkiv ali tkivnih trakov izopentan ohladili v tekočem dušiku, ki mu sledi shranjevanjem pri -80 ° C. Pet do šest Lun sekcije iz zamrznjenega tkiva smo razrezali na Leica CM1900 kriostat, pobral na steklenih ploščicah in shranjeni zamrznjeni (0-1 dni), dokler immunoreacted.}

imunske reakcije in reagenti

protitelesa, ki se uporabljajo so bili pridobljeni iz naslednjih virov: PKCα (H-7 in C-20) in (H-60), 17 CPI iz Santa Cruz Biotech, Santa Cruz CA; Vinculin in Talin Sigme, Saint Louis, Missouri; Caveolin 1 od BD Biosciences, San Jose, CA; Cy2 in Cy3 Donkey anti miško ali zajec sekundarne je iz Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA; Alexa Fluor 594-phalloidin in DAPI iz molekularne sonde, Eugene, ALI. Vse te protitelesa so prej uporabljali v našem laboratoriju za imunohistokemijo in zahodni blot, kjer se kažejo specifičnost za pas pravilno molekulsko maso za posameznega proteina, ki je naveden [25], [26] [27]. Negativne kontrole, kjer je primarna protitelesa niso vključeni ne kažejo reaktivnosti teh pasov in ne imunofluorescence na odsekih tkiva.

Zamrznjene odseki tkiva pobrali na steklenih ploščicah smo odtajali pri sobni temperaturi in se nato pritrdi z 2% paraformaldehida v 10 min, permeabiliziranih v 0,5% Triton X-100 za 10 minut in blokirane s 5 mg /ml BSA, 1 uro pred reakcijo s primarnim protitelesom čez noč (4 ° C) in nato z ustreznim sekundarnega protitelesa za eno uro pri sobni temperaturi. Po sekundarnih protiteles, so tkiva inkubirana z DAPI (0,5 uM), phalloidin (10-50 nM) ali DAPI /phalloidin kot primerna za obarvanje jeder in /ali filamentoznega aktina. Več opere so bile uporabljene po primarnih in sekundarnih inkubaciji ter counterstaining. Cover kozarci so bili nameščeni s pomočjo pufrske 75% glicerola z 0,2% n-propil galat za zmanjšanje izginja. Vse immunoreacting rešitve so bile narejene v PBS-Tween [(vg /liter: NaCl 8.0, KH _{2PO 4 0.2, Na 2HPO 4 1.15, KCl 0,2), 1% tween- 20, pH 7,4] z 0,1% BSA. Negativne kontrole vključen 0,1% BSA brez primarnega protitelesa in ni pokazal nobenega imunoreakcija.}

so opazili mikroskopija

Profili uporabo Olympus IX70 mikroskop z osvetlitvijo epifluorescenčnim. Digitalne slike so bile posnete z 16 bit Princeton Instruments (Princeton, NJ) CCD kamero, nadzorovano s PCI ploščo preko IPLab za Windows na PC-ju (Ver 3.6, Scanalytics;. Fairfax, VA). Slike so bile posnete z uporabo bodisi 100 × (1.3 NA) ali 60 x (1.25 NA) olja lečo ali 40 × (0,9 NA) zraka objektiv in shranjeni na računalniku. filtri emisij, uporabljene so bile 405, 490 in 570 nm. Oddelki so si ogledali tudi s pomočjo Nikon konfokalnim mikroskopom (Nikon A1 konfokalna Eclipse TI). Cilji, ki se uporabljajo so 100 × (1.4 NA) olje objektiv na 425, 488 in 561 nm. Podobni rezultati so bili v imunofluorescencnih distribucij, ki uporabljajo te dva različna sistema opazili.

Slika Analiza Distribucija PKC /CPI-17 posameznih celic v tkiva

Profili intenzitete fluorescence so bili za posamezne celice v profili prečnih tkiva. Oddelki so bili pri majhnih povečavah (10-20x) opazili, da se prepreči področja navideznih predmetov (tkiva zgibanje, zamrznitev poškodbe, itd.) V artefakt prostem območju, je povečava povečala na 40-100x in slike so bile posnete pri višjih povečavah. Tri različna področja znotraj enega oddelka tkiva so bili izbrani za fotografiranje. Z-kup serije so bili individualno za vsako od treh barvnih kanalov uporablja. so bili 1 mikrometrov debele Z odseki, in so bili sprejeti 15-25 Z sekcije za vsak del tkiva (podatki S1 & S2 kažejo Z-konzoli primeri CPI-17 radioinkorporacijo v antruma z in brez aktivacije tkiva). Vsak Z kup serija je bila preučena za vsak odsek za opredelitev sredino z sliko in ta slika je bila pretvorjena v a.bmp datoteko, ki je bilo uvoženo za NIS-Elements AR 3.0 (Nikon) na osebnem računalniku za analiziranje podatkov.

Profili PKCα in Phalloidin intenzitete fluorescence smo dobili za posamezne celice v prečnih prerezih tkiva. Linija je bila pripravljena po sredini slikovnega polja. Deset celice prekrižane s črto, ki so bili izbrani za merjenje. Ki temelji na naših prejšnjih protokolov [25], v prvih petih pik (~0.7 um) na obeh straneh celice, kjer je intenzivnost phalloidin močno povečala od izhodiščne vrednosti so bile opredeljene kot obodu celice. Za citosolnih meritve smo črta dajo vsaj 2 um stran od celične obrobja. Meritve intenzitete so bile narejene s pomočjo regijo kraji (ROI), približno v sredini celice (za citosolnih meritev), ali po membrani celice (za periferne meritev). Za doslednosti je velikost ROI konstantna za perifernega in citosolnih meritev. Celice v oddelku z zelo majhnimi premeri (ne more meriti citosolni ROI vsaj 2 um iz obrobja) ali jedra sedanjosti (vidna DAPI barvanjem, kjer prostorske omejitve in perinuclear organele lahko zmešajmo distribucijo) so bili izključeni iz analize. Za PKCα smo uporabili razmerje med povprečno intenziteto PKCα na obodu skozi celotno intenzivnosti PKCα (vsota svetilnosti PKCα iz ROI na obodu in ROI v citosol). Deset celic na terenu in tri različna področja izpostavimo meritev za analizo podatkov za vsakega tkiva regijo, tj trideset celice preštejemo in povprečje za vsak vzorec (n = 1). je n = bile uporabljene Končna velikost vzorca 5. v isti postopki za merjenje jakosti CPI-17, le da smo uporabili samo eno polje 10 celic za vsak vzorec (n = 1), s končno velikost vzorca n = 3.

Mehanski Meritve

Tik pred uporabo, so tkiva trakov razrežejo in vpet na vsaki strani, s sponkami zavarovane med trnki na stabilno kovinsko palico in izometričnih merilnikom (Harvard Aparati, Holliston, MA), v PSS mehurčkih z 95% O _{5/2% CO 2 v vodi plaščem mišičnih komor (Radnoti Glass Technology, Monrovia, CA) pri 37 ° C. Dolžina vsakega traku smo spreminjali s prestavitvijo stacionarna kovinsko palico.}

Gladka mišična tkiva trakovi (želodec antruma in očesno) smo uravnotežili 1 h in raztegne za pasivno napetost približuje Lo uporabo skrajšano dobo napetosti krivuljo . Sklepanja pogodb tkiva, je PSS nadomesti z K ^{+ - PSS (109 mM KCl nadomestimo z iso-osmotsko za NaCl) [28]. Trakovi mišic Aktivirani so bili večkrat z raztezanjem tkiva med vsakim aktiviranjem, dokler Največja sila pokazala več znatno povečanje v primerjavi s prejšnjim krčenje. Komore bile splaknemo trikrat z PSS po vsakem aktiviranju tkiva. Vsaj dve ponovljivi zaporedni K + - PSS popadki so bili uporabljeni, da bi dobili standardni sile sled z 10 minut počitka med vsako krčenje pred začetkom poskusa. Tkiva so nato aktivira z 1 iM karbahol in sproščeno spet, kot je bilo opravljeno v K + - PSS popadkov. Kasnejše kontrakcije vse vključeno 1 um fentolamin in propranolol, da blokira α- in B - adrenergične receptorje, v tem zaporedju. Po zadnji 1 um CCH krčenje in pranje, so tkiva aktivira z 1 um PDBu posneti svojo mehansko odgovor.}

Analiza Force podatkov

napetostni signali sile pretvornike, ki so digitaliziral PowerLab 400 ali 4 SP strojne opreme (ADInstruments, Castle Hill, Avstralija) vizualizira na računalniškem zaslonu (Graf v3.6 ali 4.0, ADInstruments) kot sile (g) na 10 Hz in shrani z ukazom programske opreme na trdi disk za kasnejše analize. Številke so bile narejene s programom za preglednice Excel 2000 (Microsoft, Redmond, WA).
Smo analizirali

Gel Elektroforeze in Western blot

Protein izraz kot prej [29] opisano. Tkiva smo homogenizirali v 50 mg /ml v 0,125 M Tris, 2% natrijev dodecilsulfat (mas /vol), 20% glicerol, 0,1% bromofenol modro (mas /vol) in 20 mM ditiotreitol. Beljakovine so razrešili z nizkimi zamreženja natrijevega dodecil geli [30] in imunoblot je bila izvedena kot je opisano prej [31]. Protitelo PKCα priznana samo en pas ali pogosteje dvojice na ~76 kD, medtem ko protitelesa CPI-17 priznane en sam trak pri ~17 kD. Te velikosti so skladne s pričakovano velikostjo teh proteinov, ki temeljijo na mobilnosti gel. Za zagotovitev točnosti Western-blot analiz, so nakladalne krivulje naredil tako želodčnih Fundus in antruma vzorcih več kot 5-kratno razponu obremenitev (4-20 ul) za aktin (Coomassie modro obarvanje) in PKCα in CPI-17 (western blot) . Rezultati so pokazali linearno zvezo preko tega razpona za vse tri proteine ​​iz obeh tkivih (R ^{R2 0,98 za vse rezultate, n = 3). Kvantitativna določitev PKCα in CPI-17 protein izražanja je bila narejena na Western-blot analiz z uporabo 5-10 ul obremenitve, ki je bila v tem linearnem območju (n = 6).}

Statistika

Statistične primerjave so bile izvedene uporabo MINITAB (Minitab Inc. State College, PA). Eno vzorec t-test smo uporabili za testiranje porazdelitev PKCα /CPI-17 (periferna do celotne vsebine ROI 0,5 kaže "enotno" porazdelitev v gladkih mišičnih celicah (SMC)) v antruma in fundusa pod počivati ​​stanju. Eden od načinov, ANOVA je bila izvedena za testiranje PKC /CPI-17 razlik distribucijo za obe tkiva z različnimi parametri spodbudnega. Dve vzorcev t-testi so bili uporabljeni za testiranje pomen razlike pri ravni ekspresije PKCα ali CPI-17 v antruma in fundusa. Dve zimsko F-test za enakost dveh standardnih odklonov (SDS) določi bistveno manjši SD v razmerju caveolin do PKCα v primerjavi z SD razmerja vinculin do PKCα. Vrednost P &0.05 smo imeli za signifikanten vseh statističnih testov. Ni statističnih testov smo opravili na podatkih sil in številka 1 je reprezentativna za podobne podatke iz 6 različnih živali. Western blot podatki iz šestih živali. Podatki distribucija PKCα je povprečno trideset celic izmerjenih na žival in pet živali so bili testirani. CPI-17 Podatki porazdelitev je v povprečju 10 celic, izmerjenih na žival in tri živali so bili testirani. Podatki protein co-lokalizacija temelji na "n" vsaj 20 celic iz najmanj 3 živali.

Rezultati

Prašičja želodec fundus je predvsem tonik gladko mišično tkivo, ki se odziva na stimulacijo s trajnim krčenje, medtem ko antruma je predvsem fazno gladko mišično tkivo, ki se odziva na stimulacijo s prehodno krčenje (sl. 1). V tkivih so ti odzivi verjetno posledica neposredne stimulacije gladkih mišic kot dodatkom 1 uM propranolol (p agonisti zaviralca) in fentolamina (alfa agonisti zaviralca) smo uporabili za preprečevanje aktiviranja adrenergičnih receptorjev zaradi možnega sproščanja simpatičnih nevrotransmiterjev. Stimulacija gladkih mišic s PDBu uporabljamo rutinsko, da bo povzročil krčenja gladkih mišic preko PKC aktivacijo [32], [33], [34]. Eden uM PDBU povzroča majhno počasno krčenje želodca fundus trakov (~40% K ^{+ odziv stimulacije), medtem ko antruma kaže v bistvu brez odgovora (< 5% K + stimulacija) (slika 1).. Razlika med vztrajnim in prehodnih odgovorov teh dveh tkiv KPSS in CCH in prisotnost ali odsotnost odziva krčenja na stimulacijo PDBu lahko posledica izražanja in /ali prostorsko-časovne porazdelitve prodajnih drugega kurirji na (PKCα in CPI-17), ki so domnevni, da je odgovoren za inhibicijo MLCP s stimulacijo PDBu. Za to preučiti smo merili raven izražanja in določili prostorsko-časovna razporeditev PKCα in CPI-17 v teh tkivih.}

Slika 2 prikazuje zahodni rezultate popivnamo za izražanje CPI-17 in PKCα v želodcu antruma in očesnega ozadja. Tkiva smo obdelali kontroli koncentracijo proteinov, in rezultati so bili izračunani na osnovi intenzitete zadevnega proteina signala in normaliziran aktina proteinske ekspresije (sl. 2). Obe metodi (le normirane podatki prikazani), je pokazala, da je niti izraz CPI-17 beljakovin niti na PKCα beljakovin bistveno razlikuje (p > 0,23 & p > 0,28 oziroma, n = 6), če primerjamo ti dve SM tkiva. Kontrole so bile narejene s pomočjo vrsto obremenitve za potrditev razpon linearnosti natovarjanja, in da so vzorci, ki se uporabljajo za kvantifikacijo v tem območju (podatki niso prikazani, glej metode). Ker ni nobenih razlik v izražanju teh dveh proteinov med tema dvema tkiv, smo poleg nadaljeval, da ugotovi, ali bi razlike v njihovi prostorsko-časovne porazdelitve pojasniti razlike v odgovorih na stimulacijo PDBu.

Slika 3 oddaja immuohistochemical rezultati za distribucijo PKCα v vzdolžnih in okroglih plasti fundusa in antruma. Pod mirovanju razmerah v sproščujoče raztopino, ko ni generacija sila, s tkivom, se zdi, da PKCα nedvomno razdeli prednostno blizu obrobja SMC (sl. 3- zelene barve, PSS). Stimulacija tkiv z 1 um CCH (3 ') ali 1 uM PDBu (10 in 30), ne spremeni tega obodno razporeditev PKCα. Razmerje razdelitve PKCα blizu plazemski membrani glede na celotno celično PKCα je bila uporabljena za kvantifikacijo morebitnih sprememb v porazdelitvi tega proteina v teh različnih pogojih. Slika 4 prikazuje rezultate kot razmerje PKCα na celični obrobja glede na celotne PKCα prisotnih v celici (periferna /(periferna + citosol), glej metode). Razmerje 0,5 kaže na "enakomerno" porazdelitev proteina po vsej celici. Razmerje PKCα (periferna /skupaj) v razponu od 0.64-0.68 v pregledani vsi pogoji. Te vrednosti so bistveno večje od 0,5 (p 0.05), kar kaže, da se PKCα leži predvsem v celični obodu (to ni "enakomerno" porazdeljena v celico) in da ta razdelitev ne spreminja med sproščenim ali stimuliranih razmerah <. br>

Ker je PKCα predlaga, da aktivirate CPI-17, smo nadaljevali določiti prostorsko-časovna razporeditev CPI-17 v teh tkivih pod podobnimi pogoji. Slika 5 prikaz immuohistochemical rezultate za distribucijo CPI-17 v vzdolžnih in okroglih plasti fundusa in antruma. Pod počiva pogojev sproščujoče rešitev, ko ni generacija sila, s tkivom, se pojavi CPI-17 se difuzno porazdeljene po vsej SMC (sl. 5- PSS, sl. S1). Spodbujanje tkiva z 1 um CCH (30 ') (ne pa 1 iM CCH za 3 ", podatki niso prikazani) ali 1 iM PDBu (30'), rezultati na pomembne spremembe v razporeditvi, tako da se zdaj pojavi CPI-17 da se predvsem na obodu celice v distribuciji podoben tistemu opazili pri PKCα (sl. 5, sl. S2). Razmerje porazdelitve CPI-17 v bližini plazemski membrani glede na na skupno CPI-17 (periferna + citosolno) je bila uporabljena za kvantifikacijo morebitnih sprememb v porazdelitvi tega proteina v teh različnih pogojih. Slika 4 prikazuje rezultate kot razmerje perifernega do skupno CPI-17. Razmerje CPI-17 (periferna /skupaj) v razponu od 0.49-0.67 v vseh tkivih in pogoji preučiti. Razmerje CPI-17 periferno /skupaj v sproščenem pogojih ni bistveno drugačen od 0,5 (pomeni 0,49-0,5; P > 0,19), kar kaže, da je CPI-17 difuzno porazdeliti po gladkih mišičnih celic v takem stanju. To ne spremeni po 3 'od 1 uM CCH stimulacijo, saj še vedno ni bistvene razlike od sproščenih pogojih (pomeni = 0,53-0,55; P > 0,05), z izjemo fundusa tkiv, kjer CPI-17 periferna /Skupno razmerje je znatno večja (p 0.05), na 3 '(slika 4).. Z 30 'bodisi 1 um CCH ali 1 iM PDBu stimulacije, distribucija CPI-17 postane bistveno večja od 0,5 za vsa tkiva in plasti (sredstva = 0.62-0.67, P < 0,01), kar kaže, da je CPI-17 zdaj se nahaja v prvi vrsti na celice periferiji (da se ne bo več "enakomerno" porazdeli po celici), ki je podobna porazdelitvi PKCα (sl. 4).

predvsem periferni distribucija PKCα (pod obema sproščeno in stimulirane pogoji) in CPI-17 (po 30 'stimulaciji z CCH ali PDBu) ni enotna na mobilni periferiji, vendar pikčasti v distribuciji (sl. 6). Na voljo je tudi porazdelitev pikčasti z anatomsko in funkcionalno ločena adherens križiščih in caveoli na plazemski membrani SMC [26]. Da bi ugotovili, če je razdelitev PKCα in CPI-17 na membrano ujema z pikčasti vzorec adherens križišč, smo naredili dvojno označevanje z dvema adherens križišča, povezanih beljakovin, vinculin in Talinu. Nadomestni vzorec porazdelitve rdeče in zelene fluorofori na membran kažejo, da PKCα in CPI-17 ne sodelujejo locirajo bodisi vinculin ali Talinu (sl. 6), kar kaže, da je PKCα in CPI-17 se ne povezujejo z adherens križišče kompleks pod pogoji, smo pregledali. Ker caveoli namestnika s adherens križiščih na periferni membrane [26], PKCα in CPI-17 lahko sodelujejo lokalizira z caveoli. Če želite ugotoviti porazdelitev pikčasti v PKCα in CPI-17 na membrano ujema z pikčasti vzorec za caveoli, smo naredili tudi dvojno označevanje PKCα z caveolin. Porazdelitev PKCα in caveolin sodelovanja lokalizirati na membrane v tako sproščeno in aktiviranih pogoji, kot je bilo mogoče opazovati z videzom rumeno /oranžno fluorescence namesto izrazito rdečo in zeleno fluorescenco (sl. 6). Dve repa F-test za enakost dveh standardnih odklonov (SDS) določi bistveno manjši SD v razmerju caveolin do PKCα v primerjavi z SD razmerja vinculin do PKCα (n = 20 celic; p 0.05) . Poleg dvojno označevanje PKCα s CPI-17 po aktivaciji tkiva tudi kaže znatno sodelovanje lokalizacije (n = 20 celic, p < 0,05) teh dveh proteinov blizu plazemske membrane (slika 7).. Ti podatki kažejo, da se PKCα predvsem lokalizirana v bližini caveloi na plazemski membrani SMC ves čas, in da se po aktivaciji tkiva, velik del citosolnega CPI-17 premikanjem na caveoli v plazmi, kjer je co-lokalizira z PKCα.

Pogovor

gladkega mišičnega tkiva rutinsko označen kot bodisi "tonik" (generiranje počasno vzdržuje izometrični kontrakcijo) ali "fazno" (generiranje hiter prehodno izometrični krčenje). oblikovanja sil in /ali tkiva skrajšanje v SM so verjeli, da zahtevajo povišan miozina lahke verige fosforilacija, ATP porabe in čez most kolesarjenje. Možen mehanizem je odgovoren za ti dve vrsti kontrakcije je razlika Ca ^{2+ preobčutljivost. Ca 2+ je preobčutljivost na gladke mišice verjeli v veliki meri posledica inhibicije MLCP vzporedno z ali potem aktivacije MLCK med aktivacijo tkiva [15], [35]. Ena od glavnih poti, da je vpletena v Ca preobčutljivost 2+ je prek G-proteinskih vezanih receptorjev (GPCR) /fosfolipaze C (PLC) /diacilglicerol (DAG) /PKC /CPI-17, da zavira MLCP. GPCR je, PLC in DAG se nahajajo na /v plazemsko membrano. Lokacijo MLCP manj gotovo, toda na neki točki v času naslednjem aktiviranju tkiva mora MLC, da je povezana z MLC _{20 na molekulo miozin z debelimi filamenti da dephosphorylate ta protein. Ker so poročali o debeli filamenti, da se porazdelijo po celotni SMC citoplazmi [36] [37] [38] [39], bo MLCP treba tudi, da se porazdelijo po citoplazmi na neki točki v času sprostitve [40]. Če je MLCP nahaja v citosolu in v bližini MLC 20 med krčenjem in PKCα in CPI-17, igrajo pomembno vlogo pri zaviranju MLC času krčenja, pa vsaj bi pričakovali CPI-17, ki se nahaja v citosolu v nekem trenutku med kontrakcijo. Rezultati te študije kažejo, da je PKCα prednostno lokalizirana v bližini plazemski membrani v sproščenem in aktiviranih pogoji in da CPI-17 je tudi prednostno lokalizirana v bližini plazemski membrani v aktiviranih pogoje. Tako, ti podatki kažejo, da so razlike v PKCα- CPI-17 Ca je potrebno 2+ preobčutljivost pot ne more pojasniti, tonik in fazno SM krče v želodcu fundusa in antruma in nadaljnje delo ugotoviti, kako je prostorsko-časovno razporeditev CPI- 17 z aktiviranjem tkiva regulira MLC, da bo povzročil Ca 2 + občutljivosti SM krčenja nedotaknjeno SM tkivih.}}

med PDBu povzroča počasno krčenje v fundusa, ki je ~40% od KPSS inducirane največje sile je malo krčenje nastaja v antruma s stimulacijo PDBu. Ker fundus in antruma predstavljata dve osnovni vrsti gladkega mišičja, tonik in fazno oziroma, se zdi logično, da pripisujejo razlike v generacijo sile na različnih lastnosti fazno in tonik mišice. Woodsome et al [41] poročal, da je stopnja izraz CPI-17 toničnega vaskularno SM višja kot v fazno vaskularno SM. To lahko pojasni različne možnosti tonično mišic za ohranitev silo (visoko koncentracijo CPI-17 zavira MLCP omogoča MLC _{20 fosforilacija ostala visoka in moč, da se ohrani v tonik SM). Ta študija je preučila PKCα in CPI-17 protein izražanja in distribucije v visceralno prašičji želodec. Na naše presenečenje, niso zaznali bistvene razlike v stopnji protein ekspresije PKCα ali CPI-17 med fundusa in antruma (sl. 2).}

• Plos ONE: Nikotin zaduši Aktivacija tkiva Resident makrofagov v želodec Mouse preko P2 nikotinski receptor
• Plos ONE: Kirurško zdravljenje za bolnike s Krukenberg tumor v trebuhu rojstva: Klinični izid in napovedni dejavniki Analysis