PLoS ONE: tonik i fazna kontrakciju glatkih mišića zar ne Regulatori PKCα - CPI-17 Put u svinjske želudac antruma i fundus

Sažetak pregled

Regulacija miozin lakog lanca fosfataza (MLCP) putem protein kinaze C (PKC) i 17 kDa PKC-potencira inhibitora miozina lakog lanca fosfataze (CPI-17) je prijavljena kao Ca ^{2 + Osjetljivost signalni put u glatkih mišića (SM), i na taj način mogu biti uključeni u tonik protiv fazna kontrakcija. Ova studija ispituje ekspresije proteina i prostorno-vremensku distribuciju PKCα i CPI-17 u netaknutim SM tkiva. KCl ili karbakol (CCH) stimulacija tonik fundusa želuca SM stvara neprekidne kontrakcije dok je fazna želudac antruma stvara prolazno kontrakciju. Osim toga, tonik fundus generira veću relativnu snagu od faznim antruma s 1 uM forbol-12, 13-dibutirat (PDBu) stimulacije koji je prikazan za aktiviranje PKCα - CPI-17 puta. Western blot analiza pokazuje da je ova kontrakcije razlika nije bila uzrokovana razlikom u ekspresiju proteina u PKCα ili CPI-17 između ova dva tkiva. Imunohistokemijski rezultati pokazuju da je raspodjela PKCα u uzdužnom i kružnim slojeva fundusa i antrumu ne razlikuju, se uglavnom lokaliziran pored membrane SM stanične plazme. Stimulacija ili tkiva s 1 uM PDBu ili 1 uM CCH ne mijenja tu perifernu distribuciju PKCα. Nema razlike između ove dvije tkiva za CPI-17 distribuciju, ali za razliku od distribucije PKCα, CPI-17 čini se da se difuzno raspoređena u cijeloj citoplazmi pod opuštenim uvjetima tkiva, ali odabire prvenstveno periferne distribuciju na staničnom membranom sa stimulacijom tkiva s 1 uM PDBu ili 1 uM CCH. Rezultati iz dvostrukog označavanja pokazuje da niti PKCα, niti CPI-17 ko-lokaliziranje na adherens spoju (vinculin /Talin) na membrani, ali oni ko-lokaliziranje jedni s drugima i sa caveoli (caveolin) na membrani. Ovaj nedostatak razlike sugerira da je PKCα - CPI-17 put nije odgovoran za tonik protiv fazna kontrakcija promatrane u fundusa želuca i antruma}

Citation: Zhang Y, Hermanson mene, Eddinger TJ (2013) tonik. i fazna kontrakciju glatkih mišića zar ne Regulatori PKCα - CPI-17 Put u svinjske želudac antruma i fundusa. PLoS ONE 8 (9): e74608. doi: 10,1371 /journal.pone.0074608 pregled

Urednik: Wenhui Hu, Temple University School of Medicine, United States of America pregled

Primljeno: 13. ožujka 2013. godine; Prihvaćeno: 4. kolovoza 2013. godine; Objavljeno: 18. rujna 2013 pregled

Copyright: © 2013 Zhang i sur. Ovo je otvorenog pristupa članak distribuirati pod uvjetima Creative Commons Imenovanje License, koja omogućuje neograničeno korištenje, distribuciju i reprodukciju u bilo kojem mediju, pod uvjetom da je izvorni autor i izvor su zaslužan

financiranja. Ovo djelo je podržan od strane National Science Foundation (NSF), Odjel za biologiju i Graduate School, Marquette University. U financijeri nisu imali ulogu u studiju dizajna, prikupljanja i analize podataka, Odluka o objavi, ili pripremu rukopisa pregled

U konkurenciji interese.. Autori su izjavili da ne postoje suprotstavljeni interesi pregled

Uvod pregled

mehanizam (i) određivanje tonik (kontinuirana) vs fazna (prolazne) glatkih mišića (SM) kontrakcije ostaje neriješen. Raznovrsna inervaciju i kruži signalnih molekula osim jedinstvenog receptora i proteina (izoforme) izražavanja i unutarstaničnih signalnih puteva zakomplicirati problem. Ne neočekivano, postoji više hipoteza da se objasni održavanje tonik snagu u SM, uključujući: slowly- ili ne-biciklizam glatkih mišića miozin poprečnih mostova zove kvaka mostovi [1], [2], [3], [4]; Zapošljavanje ne-mišićnog miozin II [5], [6], [7]; Formiranje caldesmon ili calponin ovisnih aktin-to-miozina poprečnih veza [8], [9]; Formiranje citoskeletnih strukturama sile nose [10], [11], [12]; i regulacija miozina LC _{20 fosforilacije preko druge puteve glasnik utječu miozin lakog lanca kinazu (MLCK) i miozin laki lanac fosfataza (MLCP) aktivnosti [13], [14], [15], [16], [17] [18]. Ova posljednja kategorija je od interesa zbog prijavljenog diferencijalne ekspresije, lokalizacije i reguliranje tih drugih proteina glasnik u raznim SM tkiva. Promjenjiva regulacija aktivnosti MLCK i MLCP može pružiti ne samo sredstvo za Ca ^{2 + senzibilizacije, ali i mogući mehanizam za tonik protiv faznim kontrakcije. Inaktivacija MLCP putem PKCα -CPI-17 put bi se omogućilo održavana visoka miozina lakog lanca (MLC 20) fosforilacije i time kontinuirana sile stezanja. Propust da se inaktivira MLCP će smanjiti MLC 20 fosforilaciju i sile, što je rezultiralo u prijelaznim kontrakcije. Fundusa želuca SM generira tonik (trajni) kontrakciju tijekom želuca antruma SM generira fazna (prijelazne) kontrakciju kao odgovor na razne stimulacije. Pregled}}

Ca ^{2+ osjetljivost, koja uključuje aktivaciju G- drugih glasnika putevi protein-vezani koji senzibilizirati kontraktilne proteine ​​u [Ca 2 + _{i] inhibirajući MLCP, može se pojaviti na bilo koji od brojnih putova. Jedan od prijavljenih putova za inhibiciju aktivnosti MLCP uključuje protein kinaze C /C-kinaze aktivirane PP1 inhibitor protein od 17 kDa (PKC /CPI-17) staze [19], [20]. G-spareni proteinski receptor (GCPR) aktivacije rezultira aktivacijom fosfolipaze C (PLC) hidrolizira fosfatidilinozitol 4,5-bifosfat (PIP 2) da se dobije inozitol 1,4,5-trifosfata (IP 3) i diacilglicerol (DAG). DAG je poznato da aktiviraju PKC što može dovesti do fosforilaciju CPI-17 selektivno inhibiraju MLCP (ocjenjuju se radi visceralne SM u [17]). PKC se vjeruje da se regulirati njegovu aktivaciju i prostornoj raspodjeli unutar stanice, pri čemu su pod kontrolom sidrenje proteina koji se vežu na i ograničiti položaj PKC specifičnim regijama stanice [21], [22]. Na primjer, izvješća o konstitutivno aktivne L-tipa Ca 2 + kanala i njihova regulacija PKC [23], [24] sugerira da PKC je lokaliziran u blizini membrane u stanice glatkih mišića. Stanični funkcija CPI-17 u stanici može se razlikovati ovisno o razini ekspresije proteina i da li se nalazi u blizini plazma membrane u kojoj se nalazi PKCα /aktivirani ili povezana s kontrakcije miozin debelih filamenata gdje bi MLCP se nalazi na de -phosphorylate miozin laki lanac 20 (MLC 20). pregled}}

izraz PKCα i CPI-17 i njihove prostorno-vremenske preraspodjelu nakon aktiviranja tkiva su predložene u Ca ^{2 + Osjetljivost glatkih mišićnih tkiva (za pregled [14], [15], [16], [17]). Tako je moguće da se razlike u izrazu i stanične lokalizacije /premještanje mogli biti uključeni u određivanje tonikom naspram fazna kontraktilnih odgovora. Za ova dva proteina da bude dio puta koji su uključeni u inhibiciju aktivnosti MLCP tijekom aktivacije tkiva, a time uzrokujući tonik ili fazna odgovor, oni moraju biti izraženi na odgovarajućim razinama i postavljen na pravom mjestu u ćeliji u pravo vrijeme. Budući da je PKC aktivira DAG (membranski vezane fosfolipida), on također mora biti na membrani barem privremeno da se to dogodi. A ako CPI-17 će spriječiti MLCP od defosforilirati MLC _{20 na debele vlakna, CPI-17 u nekom trenutku mora biti u citosolu povezane s debelim vlakna prisutna. Uz ta dva koraka odvijaju u dva prostorno odvojena područja stanici, jedan ili oba od tih proteina mora pomjeriti na drugu regiju za njih komunicirati i dovršiti put. Pregled}}

Cilj ovog istraživanja bio je ispitati hipoteza da PKCα - CPI-17 Ca ^{2 + Osjetljivost put sudjeluje u određivanju tonik (trajni) i fazna (prolazni) kontrakcije odgovora u glatkim mišićima. Za to smo utvrdili izraženost proteina i prostorno-vremensku distribuciju PKCα i CPI-17 u faznim želuca antruma i tonik fundusa želuca pod opuštenim i aktiviranih uvjetima. Rezultati pokazuju da nema značajne razlike u ekspresiji bilo koji od ova dva proteina, a niti u njihovoj perifernoj distribuciji između ova dva tkiva nisu u skladu s hipotezom da je PKCα- CPI-17 Ca 2 + Osjetljivost put je odlučujući faktor za tonik vs odgovora kontraktilnih fazna promatrane u tim tkivima. pregled}

metode

organa i tkiva rukovanje pregled

svinjske tkiva (želuci) dobiveni su iz Hansen mesa usluge (Franksville, WI) i stavi u hladnu fiziološku otopinu soli (PSS (u mM): 140,1 NaCl, 4,7 KCl, 1,2 na _{2HPO 4, 2,0 MOPS (pH 7.4), 0.02 na 2EDTA 1,2 MgSO 4, 1,6 CaClz 2 i 5,6 glukoza). Želuci su očišćeni od krvi, labav vezivnog tkiva, te u nekim slučajevima, sluznica i zamrznuti odmah ili pohraniti u PSS u hladnjaku 0-2 dana. Neki organi su svježe zamrznute što je prije moguće nakon post mortem (60-90 minuta). Neki organi su inkubirani u PSS i /ili stimuliraju s 1,0 uM CCH ili PDBu (Sigma) pri 37 ° C za različite vremenske točke prije zamrzavanja. Varijabilni vremena inkubacije i agonist koncentracije također su ispitani. Za imunohistokemiju sva tkiva su smrznute pohranjene do razdvojeni imunološkoj reakciji. Zamrzavanje, u svim slučajevima je obuhvaćao stavljanje komada tkiva ili tkiva trake u izopentanu ohladi u tekućem dušiku nakon čega slijedi skladištenje na -80 ° C. Pet do šest um dijelovi smrznute tkiva su rezane na Leica CM1900 kriostat, pokupila na stakalca i čuvaju zamrznute (0-1 dana), dok imunološkoj reakciji. Pregled}

imunoloških i reagensi pregled

protutijela dobiveni su iz sljedećih izvora: PKCα (H-7 i C-20) i CPI-17 (H-60) iz Santa Cruz Biotech, Santa Cruz CA; Vinculin i Talin od Sigma, Saint Louis, Missouri; Caveolin jedan od BD Biosciences, San Jose, CA; Cy2 i Cy3 Donkey anti miša ili zeca na sekundarni a iz Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA; Alexa Fluor 594-phalloidin i DAPI od Molecular Probes, Eugene, OR. Svi ovi antitijela već su prije korišteni u laboratoriju za imunohistokemiju i western blotting gdje pokazuju specifičnost za vrpce ispravnom molekulskom masom za odgovarajuće protein označen [25], [26], [27]. Negativne kontrole gdje se primarno antitijelo nije uključen ne pokazuju reaktivnost za te pruge i bez imunofluorescencije na dijelovima tkiva. Pregled

sekcije Smrznuto tkivo podigne na stakalca su odmrznute na sobnoj temperaturi, a zatim fiksirane s 2% paraformaldehidom 10 minute, propustljivih u 0,5% Triton X-100 tijekom 10 minuta i blokirane s 5 mg /ml BSA 1 sat prije reakcije sa primarnim antitijelima preko noći (4 ° C), a zatim odgovarajući sekundarnim antitijelima tijekom jednog sata pri sobnoj temperaturi. Nakon sekundarnog protutijela, tkiva su inkubirani sa DAPI (0,5 uM), phalloidin (10-50 nM) i DAPI /phalloidin prikladno za bojanje jezgre i /ili vlaknaste aktina. Više pranja korišteni su slijedeći primarnih i sekundarnih inkubacije, te counterstaining. Cover naočale su montirani pomoću bufferom 75% glicerola s 0,2% n-propil galat kako bi se smanjili blijedi. Svi immunoreacting rješenja su u PBS-Tween [(g /litri: NaCl 8,0, KH _{2PO 4 0.2 Na 2HPO 4 1.15, KCl 0,2,), 1% Tween- 20, pH 7,4] s 0,1% BSA. Negativne kontrole su uključivale 0.1% BSA bez primarnog antitijela, i nije pokazivao immunoreaction. Pregled}

mikroskopija pregled

Sekcije su promatrane pomoću Olympus IX70 mikroskop s osvjetljenjem epifluorescentnim. Digitalne slike su snimljene sa 16 bita Princeton instrumenti (Princeton, NJ) CCD kamerom, kontrolirana putem PCI odbora putem IPLab za Windows na PC-u (Ver 3.6, Scanalytics;. Fairfax, VA). Slike su snimljene koristeći ili T (1.25 Na) objektiv ulja 100 × (1,3 NA) ili 60 ili (NA 0.9) zrak objektiv od 40 × i pohranjene na računalu. Emisija filteri su korišteni 405, 490 i 570 nm. Sekcije su također su pogledali pomoću Nikon konfokalnog mikroskopa (Nikon A1 Osnove optike Eclipse Ti). Ciljevi koji se koriste su 100 × (1,4 NA) objektiv ulje na 425, 488 i 561 nm. Slični rezultati su opaženi u imunofluoroescentnu distribucija koje koriste ova dva različita sustava. Pregled

Analiza Slika Distribucija PKC /CPI-17 pojedinačnih stanica u tkivima

Profili intenziteta fluorescencije su uzeti za pojedine stanice sekcije poprečnih tkiva. Sekcije su promatrane u malim povećanjem (10-20x) kako bi izbjegli područja vidljivih artefakata (presavijanja tkiva, zamrznuti štetu, itd). U artefakt slobodnom prostoru uvećanje je povećan na 40-100x i slike su snimljene na tim višim povećanjima. Tri različita područja unutar jednog dijela tkiva su izabrani da se slike. Z-stog serija odvedeni pojedinačno za svaku od tri boje kanala koji se koriste. odvedeni 1 lm debeli Z sekcije, a od 15-25 Z dijelovi su uzeti za svaki dio tkiva (brojke S1 & S2 pokazuju Z-stog primjeri CPI-17 imunoreaktivnost u antruma sa i bez aktivacije tkiva). Svaki Z stog serija je ispitan za svaki dio identificiranja centar z sliku i ta slika je pretvoren u a.bmp datoteku koja je uvezena na NIS-Elements AR 3.0 (Nikon) na računalu kako bi analizirali podatke. Pregled

Profili PKCα i phalloidin intenziteta fluorescencije dobiveni su za pojedine stanice u dijelovima poprečnim tkiva. Linija je nacrtana na sredini terena slike. Deset stanice mogu prijeći liniju odabrani su za mjerenja. Na temelju naših prethodnih protokola [25], u prvih pet piksela (~0.7 um) na obje strane stanice, gdje je intenzitet phalloidin naglo se povećao s početnih vrijednosti definirane su kao periferiji stanice. Za citosolu mjerenja, linija je postavljena najmanje 2 um daleko od periferiju stanice. Mjerenja intenziteta provedena su pomoću područja interesa (ROI) otprilike na sredini stanice (za citosolu mjerenja), ili uz membrani stanice (na perifernim mjerenja). Zbog konzistentnosti, veličina ROI održava konstantnom za periferne i citosolu mjerenja. Stanice u odjeljku s vrlo malih promjera (ne mogu mjeriti citosolnu ROI barem 2 um s periferije) ili s jezgrama prisutan (vidi DAPI bojanja u kojima prostorna ograničenja i perinuclear organele mogu zbuniti distribuciju) su isključeni iz analize. Za PKCα, korišten je odnos prosječnog intenziteta PKCα po obodu preko ukupnog intenziteta PKCα (zbroj intenziteta PKCα iz ROI na obodu i ROI u citosolu). Deset stanica po polju i tri različita polja su podvrgnuti mjerenju za analizu podataka za svaku regiju tkiva, tj trideset stanice su prebrojane i prosječno se za svaki uzorak (n = 1). Konačna veličina uzorka je n = primijenjeni 5.The isti postupci za mjerenje intenziteta CPI-17, osim što su korišteni samo jedno polje od 10 stanica za svaki uzorak (n = 1), konačne veličine uzorka od n = 3. pregled

Mehanička mjerenja pregled

Neposredno prije upotrebe trake tkiva su izrezani i učvršćena na oba kraja, s hvataljkama osiguran između kuka na nepomičnu metalnom šipkom i izometrični transduktor sile (Harvard Apparatus, Holliston, MA), u PSS vrenje sa 95% O _{2/5% CO 2 u vodi navlakom mišića komora (Radnoti Glass Technology, Monrovia, CA) pri 37 ° C. Dužina svake trake mijenjana pomicanjem stacionarni metalnu šipku. Pregled}

glatkih mišića trake tkiva (trbuh antruma i fundus) se uravnoteži 1 sat i protegnuo se pasivni napetosti prilici Lo koristi skraćeni duljina napetosti krivulje , Za ugovor tkiva, PSS je zamijenjen K ^{+ - PSS (109 mM KCl supstituirani izo-osmotski za NaCl) [28]. Mišića Trake se aktivira više puta s istezanje tkiva između svakog aktiviranja, dok masa sila više ne pokazuje značajan porast u odnosu na prethodnu kontrakcije. Komore su isprane tri puta s PSS nakon svake aktivacije tkiva. Najmanje dva opetovani uzastopna K + - PSS kontrakcije su se koristili da bi dobili standardne snage trag sa 10 minuta odmora između svake kontrakcije prije početka eksperimenta. Tkiva su zatim aktivirati s 1 uM karbahola i opušteno opet, kao što je provedeno tijekom K + - PSS kontrakcija. Naknadni kontrakcije sve uključeno 1 um fentolamin i propranolol blokirati α- i P - adrenergičke receptore, respektivno. Nakon završnog 1p.M CCH kontrakciju i oprati, tkiva su aktivirani s 1! JM PDBu kako bi snimili svoj mehanički odgovor. Pregled}

Analiza snaga Data pregled

Naponski signali iz prijenosnikom sile su zabilježeni od strane PowerLab 400 ili 4 SP hardvera (ADInstruments, Castle Hill, Australija) vizualizirati na zaslonu računala (Tablica v3.6 ili 4.0, ADInstruments) kao snaga (g) na 10 Hz i pohranjeni od strane programske naredbe na tvrdi disk za daljnje analize. Brojke su izrađene uz program za proračunske tablice Excel 2000 (Microsoft, Redmond, WA). Pregled analizirana

Gel elektroforeza i Western blot-pregled

ekspresije proteina kao što je prethodno opisano [29]. Tkiva homogenizirana su u 50 mg /ml u 0,125 M Tris, 2% natrij dodecilsulfat (wt /vol), 20% glicerola, 0,1% bromfenol plavo (m /V) i 20 mM ditiotreitola. Proteini se mogu razdvojiti na niskim križno vezana natrij dodecilsulfat gelova [30] i imunobloting se obavlja kao što je ranije opisano [31]. PKCα antitijela prepoznali ni jednu vrpcu ili češće je prsluk na ~76 kD dok CPI-17 antitijelo prepoznao jednu vrpcu na ~17 kD. Ove veličine su u skladu s očekivanim veličine za tih proteina na temelju mobilnosti gela. Da bi se osigurala točnost Western blot analize, utovar Krivulje su učinili za oba fundusa želuca i antruma uzoraka preko 5 puta raspona opterećenja (4-20 ul) za aktin (Coomassie bojanje) i PKCα i CPI-17 (Western blot) , Rezultati pokazuju linearnu vezu preko raspona za sva tri proteina iz oba tkiva (R ^{R2 0,98 za sve rezultate, n = 3). Kvantifikacija PKCα i CPI-17 proteinsku ekspresiju izvršena je na Western blot analize pomoću 5-10 lI opterećenja koji je bio u tom linearnom području (n = 6). Pregled}

Statistika

Statističke provedene su usporedbe pomoću Minitab (Minitab Inc State College, PA). Jednom jedan uzorak t-test je korišten za testiranje distribuciju PKCα /CPI-17 (periferna ukupnom sadržaju ROI od 0,5 ukazuje na "ravnomjernu" distribuciju u stanice glatkih mišića (SMCs)) u antruma i fundus pod odmara stanju. Jedan od načina je ANOVA test za PKC /CPI-17 distribucijskih razlike za dva tkiva s različitih parametara poticajnim. Dva uzorka t-testovi su korišteni za testiranje značajnosti razlika za razinu ekspresije od PKCα ili CPI-17 u antruma i fundusa. Dva kraka F-test za jednakost dvije standardne devijacije (SDS) određena je značajno manju SD u omjeru caveolin na PKCα u odnosu na SD omjera vinculin na PKCα. Vrijednost za P < 0.05 je smatrana značajnom za sve statističkim testovima. Nema statistički testovi izvedeni su na podacima o snazi, a brojka 1 prikazuje sličnim podacima iz 6 različitih životinja. Western blot podaci iz šest životinja. PKCα distribuciju podataka je u prosjeku tridesetak stanica izmjerenih po životinji i pet životinja su testirani. CPI-17 raspodjela podataka je prosječno 10 stanica izmjerenih po životinji i tri životinje su testirane. Protein ko-lokalizaciju podaci temelje na 'n' od najmanje 20 stanica od najmanje 3 životinje. Pregled

Rezultati

Svinjska fundusa želuca je prvenstveno tonik glatko mišićno tkivo koje reagira na stimulaciju s trajnim kontrakcije dok je antruma je prvenstveno fazna glatko mišićno tkivo koje reagira na stimulaciju s prolaznim kontrakcije (Sl. 1). U tkivima ovi odgovori su vjerojatno rezultat izravnom stimulacijom glatkih mišića kao i dodavanjem 1 uM propranolol (beta agonist blokatora) i fentolamin (alfa agonist blokator) je korištena kako bi se spriječilo aktiviranje adrenergičkih receptora zbog potencijalno puštanje simpatičkih neurotransmitera. Stimulacija glatkih mišića s PDBu se koristi rutinski da uzrokuje kontrakciju glatkih mišića putem PKC aktivacije [32], [33], [34]. Jedan uM PDBU uzrokuje malu spor kontrakcije u fundusa želuca trake (~40% K ^{+ stimulacija odgovora), dok je antruma pokazuje u biti nema odgovora (< 5% K + stimulacija) (sl. 1). Razlika između produženim i prolaznih odgovora ova dva tkiva do KPSS i CCH i prisutnosti ili odsutnosti kontraktilnog odgovora na PDBu stimulaciju može biti s obzirom na ekspresiju i /ili prostorno-vremenska distribucija nizvodno drugih glasnika (PKCα i CPI-17), koji su sadržaj biti odgovoran za MLCP inhibicije s PDBu stimulacije. Ispitati to mjerili smo razinu ekspresije i određena prostorno-vremenska raspodjela PKCα i CPI-17 u ovim tkivima. Pregled}

Slika 2 prikazuje zapadne rezultate blot za izražavanje CPI-17 i PKCα u želucu antruma i fundusa. Tkiva su obrađeni kontrolira koncentraciju proteina, a rezultati su izračunati na temelju intenziteta odgovarajućeg proteina signal, te normalizirana na ekspresiju proteina aktin (Sl. 2). Obje metode (samo normalizirane prikazana) pokazuje da ni izraz CPI-17 protein, niti onaj PKCα proteina značajno razlikuje (p > 0,23 & p > 0,28, odnosno, n = 6) kada se uspoređuju ta dva SM tkiva. Kontrole se obave uz raspon opterećenja potvrditi raspon linearnosti utovara, a uzorci koriste za kvantifikaciju bilo u tom okviru (podaci nisu prikazani, vidjeti metode). Budući da ne postoje razlike u izrazu za ova dva proteina između ova dva tkiva, mi pored nastavila da se utvrdilo da li razlike u njihovoj prostorno-vremenske raspodjele može objasniti razliku u njihovim odgovorima na PDBu stimulacije. Pregled

Slika 3 pokazuje immuohistochemical rezultati za raspodjelu PKCα u uzdužnim i kružnim slojeva fundusa i antrumu. U mirujućim uvjetima u opuštanje rješenje kada nema sile genera tkivu, PKCα čini se jedinstveno distribuira poželjno blizu periferije SMCs (Sl. 3- zelene boje, PSS). Stimulacija tkiva s 1 uM CCH (3 ') ili 1 uM PDBu (10 i 30') ne mijenjaju taj periferni raspodjelu PKCα. Omjer raspodjele PKCα blizini plazmatske membrane u odnosu na ukupne stanične PKCα se upotrijebi za određivanje mogućih promjena u raspodjeli tog proteina pod tim različitim uvjetima. Slika 4 prikazuje rezultate kao omjeru PKCα na periferiju stanice u odnosu na ukupnu PKCα prisutne u stanici (periferni /(periferni + citosolu) vidi metode). Omjer 0,5 bi upućivali na "ravnomjernu" distribuciju proteina u cijeloj stanici. Omjer PKCα (periferni /ukupno) kretale su se od 0.64-0.68 u ispituju svi uvjeti. Te vrijednosti su znatno veći od 0,5 (p 0,05), što pokazuje da PKCα nalazi ponajprije na periferiju stanice (ne "ravnomjerno" distribuirani u stanici) i da to distribucija ne mijenja između opuštenim ili stimulirane uvjetima <. br>

Zbog PKCα predloženo je da se aktivira CPI-17, nastavila se odrediti prostorni-vremenski distribuciju CPI-17 u ovim tkivima pod sličnim uvjetima. Slika 5 prikazuje rezultate immuohistochemical za distribuciju CPI-17 u uzdužnim i kružnim slojeva fundusa i antrumu. Pod odmara uvjete opuštanje rješenje kada ne postoji sila generacije u tkivu, CPI-17 čini se da se difuzno raspoređena u cijeloj SMCs (sl. 5- PSS, sl. S1). Stimulacija tkiva s 1 uM CCH (30 ') (, ali ne i 1 uM CCH za 3', podaci nisu prikazani) ili 1 uM PDBu (30 '), rezultira u značajnom promjenom ove distribucije, tako da se CPI-17 prikaže primarno na periferiji stanice, u distribuciji sličnom onom opaženom u PKCα (sl. 5, sl. S2). Omjer raspodjele CPI-17 u blizini plazmatske membrane u odnosu na ukupnu CPI-17 (periferni + u citosolu) se koristi za određivanje mogućih promjena u raspodjeli tog proteina pod tim različitim uvjetima. Slika 4 prikazuje rezultate kao omjer perifernog do ukupno CPI-17. Omjer CPI-17 (periferni /ukupno) kretale su se od 0.49-0.67 u svim tkivima i uvjetima ispitanih. Omjer CPI-17 periferne /ukupno u opuštenim uvjetima ne razlikuje se značajno od 0,5 (znači 0,49 do 0,5; p > 0,19), što ukazuje da je CPI-17 difuzno raspoređena tijekom glatkih mišićnih stanica pod ovim uvjetima. To ne mijenja slijedi 3 '1p.M CCH stimulacije kako još uvijek ne postoji značajna razlika u odnosu na opuštenim uvjetima (znači = ,53-0,55; p > 0,05), s izuzetkom fundusa tkiva gdje je periferna /ukupni omjer CPI-17 je znatno veća (p < 0.05) na 3 '(Sl. 4). Sa 30 'u ili 1 uM CCH ili 1 uM PDBu stimulacije CPI-17 distribucija postaje znatno veća od 0,5 za sva tkiva i slojevi (sredstva = 0.62-0.67, p 0,01), što znači da CPI-17 se nalazi u prvom redu na stanicama periferiji (to više nije "ravnomjerno" koji se distribuira na stanici), slična raspodjeli PKCα (sl. 4). pregled

primarno periferna distribucija PKCα (u oba opušteno i stimuliranih uvjetima) i CPI-17 (nakon 30 'stimulacije CCH ili PDBu) nije ujednačena na periferiju stanice, ali točkast distribuciji (Sl. 6). Tu je i distribucija točkast od anatomski i funkcionalno različite adherens spojnica i caveoli na SMC plazma membrane [26]. Da bi se utvrdilo je li raspodjela u PKCα i CPI-17 na membrani korespondira s točkaste uzorkom adherens čvorišta, nismo dvostruko označavanje s dva adherens razvodne povezanih proteina, vinculin i Talin. Alternativni obrazac distribucije crvenom i zelenom fluorofora na membranama pokazuju da je PKCα i CPI-17 ne surađuju lokalizirati s bilo vinculin ili Talin (Sl. 6), što ukazuje da je PKCα i CPI-17 ne povezujemo s adherens junction kompleks pod uvjetima koje smo ispitanih. Zbog caveoli izmjenjuju s adherens čvorišta na periferne membrane [26], PKCα i CPI-17 može co-lokaliziranje s caveoli. Da bi se utvrdilo je li raspodjela pjegav od PKCα i CPI-17 na membrani korespondira s točkaste uzorak od caveoli, također smo učinili dvostruko označavanje PKCα s caveolin. Raspodjela PKCα i caveolin ko-lokaliziranje na membrani u oba opušteno i aktiviranih uvjetima kao što se može uočeno je pojavom žute /narančaste fluorescentne nego izrazitu crvenu i zelenu fluorescenciju (Sl. 6). Dva kraka F-test za jednakost dvije standardne devijacije (SDS) određena je značajno manju SD u omjeru caveolin na PKCα u odnosu na SD omjera vinculin na PKCα (n = 20 stanica; p < 0,05) , Osim toga, dvostruko označavanje PKCα s CPI-17 nakon aktivacije tkiva također pokazuje značajne ko-lokalizaciju (n = 20 stanice p 0.05) od ova dva proteina blizu plazma membrane (Sl. 7). Ovi podaci pokazuju da PKCα prvenstveno je lokaliziran u blizini caveloi na SMC plazma membrane u svako doba, a da se nakon aktivacije tkiva, značajan dio citosolne CPI-17 se premješta u caveoli u plazmi, gdje su tada localizes s PKCα. pregled

Rasprava pregled

glatkog mišićnog tkiva rutinski karakterizira kao ni "tonik" (stvaraju spore održavan izometričke kontrakcije) ili "fazna" (generiranje brzo prolazno izometričke kontrakcije). generacije snage i /ili skraćenje tkivo u SM se vjeruje da je potrebna povišena fosforilaciju lakog lanca miozin, ATP potrošnju i cross most biciklizam. Mogući mehanizam odgovoran za ove dvije vrste kontrakcija je diferencijal Ca ^{2 + preosjetljivost. Ca 2 + Osjetljivost na glatkih mišića Vjeruje se velikim dijelom biti posljedica inhibicije MLCP istovremeno ili naknadno na aktiviranje MLCK tijekom aktivacije tkiva [15], [35]. Jedan od glavnih putova predložio da se uključe u Ca 2 + Osjetljivost je preko G-proteinskih receptora (GPCR) /fosfolipaze C (PLC) /diacilglicerol (DAG) /PKC /CPI-17 inhibirati MLCP. GPCR-a, PLC i DAG nalaze se na /u membranu plazme. Lokacija MLCP je manje poznato, ali u nekom trenutku u vremenu nakon aktivacije tkiva MLCP treba biti povezan s MLC _{20 na miozina molekule debelih filamenata kako bi defosforiliraju ovaj protein. Zbog guste niti su izvijestili da se distribuirati diljem SMC citoplazmi [36], [37], [38], [39] je MLCP će također trebaju biti raspoređena u cijeloj citoplazmi u nekom trenutku tijekom odmora [40]. Ako MLCP se nalazi u citosolu i blizu MLC 20 tijekom kontrakcije i PKCα i CPI-17 igraju ulogu u inhibiciji MLCP tijekom kontrakcije, onda barem CPI-17 bi se očekivalo da se nalazi u citosolu na neko vrijeme tijekom kontrakcije. Rezultati ovog istraživanja pokazuju da PKCα preferencijalno je lokaliziran u blizini plazma membranu tijekom opušteno i aktiviranih uvjetima i da CPI-17 je također povoljno lokaliziran u blizini plazma membranu tijekom aktiviranih uvjetima. Dakle, ti podaci ukazuju na to da razlike u PKCα- CPI-17 Ca 2 + Osjetljivost put ne mogu objasniti tonik i fazna SM kontrakcije u fundusa želuca i antruma i daljnji rad je potreban kako bi se utvrdilo kako je prostorno-vremensku distribuciju CPI- 17 s aktivacijom tkiva može regulirati MLCP izazvati Ca 2 + senzibilizacija SM kontrakcije netaknutih SM tkiva. pregled}}

Dok PDBu uzrokuje sporo kontrakcije u fundus koji je ~40% od KPSS inducirane vršne snage , malo kontrakcija je generirana u antruma s PDBu stimulacije. Od fundusa i antruma predstavljaju dvije osnovne vrste glatkih mišića, tonik i fazna odnosno, čini se logičnim pripisati razlika u snazi ​​generacije do različitih svojstava fazna i tonik mišića. Woodsome et al [41] izvijestili su da je razina ekspresije CPI-17 u tonusa krvnih žila SM je veći nego u faznim vaskularne SM. To bi moglo objasniti različite sposobnosti tonik mišiće da zadrži silu (visoku koncentraciju CPI-17 inhibira MLCP čime MLC _{20 fosforilacija ostati visoka i sila s kojom treba održavati u tonik SM). Ova studija ispituje PKCα i CPI-17 izražavanje i distribuciju proteina u visceralne svinjskom želucu. Na naše iznenađenje, nema značajne razlike u razini ekspresije proteina od PKCα ili CPI-17 otkrivena je između fundusa i antruma (Sl. 2).}

• PLoS ONE: Nikotin slabi Aktivacija tkiva rezidentnim makrofagima u miša želuca kroz P2 razgradnja Receptor
• PLoS ONE: kirurško liječenje bolesnika s Krukenberg tumor želuca porijekla: klinički ishod i prognostički čimbenici Analysis