PLOS ONE: Tónico y fásica contracción del músculo liso no está regulado por la PKCa - CPI-17 Camino en el estómago de los cerdos del antro y Fundus

Extracto

Regulación de la fosfatasa de la cadena ligera de la miosina (PCML) a través de la proteína quinasa C ( PKC) y el inhibidor de PKC-potenciada de 17 kDa de la miosina de cadena ligera fosfatasa (CPI-17) ha sido reportado como Ca ^{2 + vía de señalización de la sensibilización en el músculo liso (SM), y por lo tanto pueden estar involucrados en el vs. tónico contracciones fásicas. Este estudio examinó la expresión de la proteína y la distribución espacio-temporal de PKCa y CPI-17 en tejidos intactos SM. KCl o carbacol (CCh) estimulación de tónico SM fundus del estómago genera una contracción sostenida mientras que el antro del estómago fásica genera una contracción transitoria. Además, el fondo de ojo tónico genera una mayor fuerza relativa de antro fásico con forbol 1 M 12, la estimulación 13-dibutirato (PDBu) que se informa para activar la PKCa - CPI-17 vía. Los análisis de transferencia de Western demostró que esta diferencia de contracción no fue causada por una diferencia en la expresión de la proteína de PKCa o CPI-17 entre estos dos tejidos. resultados de inmunohistoquímica muestran que la distribución de PKCa en las capas longitudinales y circulares del fondo de ojo y el antro no difieren, siendo localizado predominantemente cerca de la membrana plasmática de la célula SM. La estimulación de los tejidos, ya sea con 1 M PDBu o 1 M CCh no altera esta distribución PKCa periférica. No hay diferencias entre estos dos tejidos para la distribución CPI-17, pero a diferencia de la distribución PKCa, CPI-17 parece estar distribuido de forma difusa por todo el citoplasma en condiciones de tejido relajado, pero cambia a una distribución principalmente periférica en la membrana plasmática con la estimulación de los tejidos con 1 M PDBu o 1 M CCh. Los resultados de doble etiquetado muestran que ni PKCa ni CPI-17 co-localizan en la unión adherente (vinculina /talina) en la membrana pero que no co-localizar entre sí y con caveolas (caveolina) en la membrana. Esta falta de diferencia sugiere que la PKCa - vía CPI-17 no es responsable de la tónica frente a las contracciones fásicas observados en fundus del estómago y el antro}

Visto: Zhang Y, Hermanson ME, Eddinger TJ (2013) Tonic. la contracción fásica y el músculo liso no está regulado por la PKCa - CPI-17 Camino en el estómago de los cerdos del antro y del fondo de ojo. PLoS ONE 8 (9): e74608. doi: 10.1371 /journal.pone.0074608

Editor: Wenhui Hu, Escuela de Medicina de la Universidad de Temple, Estados Unidos de América

Recibido: 13 Marzo, 2013; Aceptado: August 4, 2013; Publicado: 18 Septiembre 2013

Derechos de Autor © 2013 Zhang et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan

Financiación:. Este trabajo fue apoyada por la National Science Foundation (NSF), Departamento de Ciencias Biológicas y Escuela de Graduados de la Universidad de Marquette. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito

Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia

Introducción

El mecanismo (s) que determina tónica (sostenido) frente a las contracciones fásicas (transitorio) del músculo liso (SM) permanece sin resolver. inervación diversa y moléculas de señalización de circulación, además de receptor único y la expresión de proteínas (isoforma) y vías de señalización intracelular complican el problema. Como era de esperar, hay varias hipótesis propuestas para explicar el mantenimiento tónico vigor en SM incluyendo: miosina del músculo liso puentes cruzados lentamente- o no cíclicas llamados puentes de enganche [1], [2], [3], [4]; reclutamiento de la miosina no muscular II [5], [6], [7]; formación de caldesmón o calponin dependiente de actina-miosina a enlaces cruzados [8], [9]; formación de estructuras de soporte de la fuerza de citoesqueleto [10], [11], [12]; y la regulación de la miosina LC _{20 fosforilación a través de segundas vías de mensajería que afectan a la quinasa de cadena ligera de miosina (MLCK) y la miosina fosfatasa de la cadena ligera (PCML) la actividad [13], [14], [15], [16], [17] , [18]. Esta última categoría es de interés debido a los informes sobre la expresión diferencial, la localización y la regulación de estas segundas proteínas mensajeras en diversos tejidos SM. la regulación variable de la actividad MLCK y PCML podría proporcionar no sólo un medio para la sensibilización Ca ^{2 +, pero también un posible mecanismo para el tónico contra la contracción fásica. La inactivación del PCML través de la vía PKCa -CPI-17 permitiría la cadena mantenido alta la luz de la miosina (MLC 20) fosforilación y por lo tanto una fuerza contráctil sostenida. Un fallo para inactivar MLCP reduciría MLC 20 fosforilación y la fuerza, lo que resulta en una contracción transitoria. Estómago fundus SM genera una contracción tónica (sostenido) mientras antro del estómago SM genera una contracción fásica (transitoria) en respuesta a una variedad de estímulos.}}

Ca ^{sensibilización 2+, que implica la activación de G- segundo mensajero vías acoplados a la proteína que sensibilizan las proteínas contráctiles en [Ca 2 + _{i] mediante la inhibición de PCML, pueden producirse por cualquiera de numerosas vías. Una de las vías reportados para la inhibición de la actividad MLCP incluye el /C-quinasa activada PP1 proteína de la proteína quinasa C inhibidor de 17 kDa (PKC /CPI-17) vía [19], [20]. la activación del receptor acoplado a la proteína-G (GCPR) resulta en la activación de la fosfolipasa C (PLC), hidroliza fosfatidilinositol 4,5-bifosfato (PIP 2) para producir inositol 1,4,5-trifosfato (IP 3) y diacilglicerol (DAG). DAG es conocida por activar PKC que puede causar la fosforilación de CPI-17 para inhibir selectivamente MLCP (revisado para visceral SM en [17]). PKC se cree que está regulada por su activación y la distribución espacial dentro de la célula, estando el último controlado por el anclaje de las proteínas que se unen a y restringen la ubicación de PKC a las regiones específicas de la célula [21], [22]. Por ejemplo, los informes de Ca canales constitutivamente activa de tipo L + 2 y su regulación por la PKC [23], [24] sugiere que la PKC se localiza cerca de la membrana en las células del músculo liso. La función celular de CPI-17 en la célula podría variar en función de su nivel de expresión de la proteína y si se encuentra cerca de la membrana plasmática donde se encuentra PKCa /activa, o asociada con los filamentos contráctiles miosina gruesas donde se ubicaría PCML a De -phosphorylate cadena ligera de la miosina 20 (MLC 20).}}

La expresión de PKCa y CPI-17 y su espacio-temporal redistribución tras la activación del tejido se han propuesto en Ca ^{2 + sensibilización de los tejidos del músculo liso (para su revisión [14], [15], [16], [17]). Así, es posible que las diferencias en su expresión y localización celular /translocación podrían estar involucrados en la determinación de tónico vs. respuestas contráctiles fásica. Por estas dos proteínas para formar parte de una vía que participan en la inhibición de la actividad MLCP durante la activación del tejido, y por lo tanto causando un tónico o respuesta fásica, necesitan ser expresadas en niveles apropiados y ubicado en la posición correcta en la célula en el momento correcto. Debido a que la PKC es activada por el DAG (un fosfolípido unido a la membrana), sino que también debe estar en la membrana, al menos temporalmente, para que esto suceda. Y si CPI-17 va a inhibir la MLCP de dephosphorylating MLC _{20 en los filamentos gruesos, CPI-17 en algún momento tiene que estar en el citosol asociado con los filamentos gruesos presentes allí. Con estos dos pasos que ocurren en dos regiones espacialmente distintas de la célula, una o ambas de estas proteínas tiene que trasladar a la otra región de interactuar y completar la vía
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El propósito de este estudio fue probar la hipótesis de que la PKCa - CPI-17 Ca ^{vía de sensibilización 2+ está involucrado en la determinación de tónico (sostenido) y fásicas (transitorios) respuestas contráctiles de los músculos lisos. Para ello se determinó la expresión de la proteína y la distribución espacio-temporal de PKCa y CPI-17 en el antro del estómago fásica y tónica fundus del estómago en condiciones relajadas y activados. Los resultados muestran diferencias significativas en la expresión de cualquiera de estas dos proteínas, ni en su distribución periférica entre estos dos tejidos son incompatibles con la hipótesis de que la PKCα- CPI-17 Ca 2 + vía de sensibilización es el factor determinante para la tónico vs. respuestas contráctiles fásicas observados en estos tejidos.}

Métodos

Órganos y tejidos Manejo

tejidos de los cerdos (estómagos) se obtuvieron de Hansen Servicio carne (Franksville, WI) y poner en solución salina fisiológica fría (PSS; (en mM): 140,1 NaCl, 4,7 KCl, 1,2 Na _{2HPO 4, 2.0 MOPS (pH 7,4), 0,02 Na 2EDTA, 1.2 MgSO 4, 1,6 CaCl 2, y 5.6 de la glucosa). Los estómagos fueron limpiados de la sangre, el tejido conectivo laxo, y en algunos casos, la mucosa, y se congelaron inmediatamente o almacenada en PSS en el refrigerador durante 0-2 días. Algunos órganos eran frescos congelados tan pronto como sea posible después de post-mortem (60-90 minutos). Algunos órganos se incubaron en PSS y /o estimulados con 1,0 M CCh o PDBu (Sigma) a 37 ° C para diferentes puntos de tiempo antes de la congelación. También se ensayaron tiempos de incubación variables y concentraciones de agonista. Para la inmunohistoquímica todo el tejido se almacenó congelado hasta que se seccionaron y se immunoreacted. La congelación en todos los casos consistía en colocar piezas de tejidos o tiras de tejido en isopentano enfriado en nitrógeno líquido seguido de almacenamiento a -80 ° C. De cinco a seis micras secciones de los tejidos congelados se cortaron en un criostato Leica CM1900, recogido en portaobjetos de vidrio y se almacenó congelado (0-1 días) hasta que immunoreacted.}

inmunorreacciones y Reactivos

La anticuerpos utilizados se obtuvieron de las siguientes fuentes: PKCa (H-7 y C-20) y CPI-17 (H-60) de Santa Cruz Biotech, Santa Cruz CA; Vinculina y Talin de Sigma, Saint Louis, Missouri; Caveolina 1 de BD Biosciences, San Jose, CA; Cy2 y Cy3 burro anti ratón de conejo o de secundaria de Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA; Alexa Fluor 594-faloidina y DAPI de Molecular Probes, Eugene, OR. Todos estos anticuerpos se han utilizado previamente en nuestro laboratorio para la inmunohistoquímica y transferencia Western en el que muestran especificidad para una banda del peso molecular correcto para la proteína respectiva se indica [25], [26], [27]. Los controles negativos en los que no se incluye el anticuerpo primario no muestran reactividad para estas bandas y no de inmunofluorescencia en secciones de tejido.

secciones de tejido congeladas recogieron en portaobjetos de vidrio se descongelaron a temperatura ambiente y después se fijaron con paraformaldehído al 2% para 10 minutos, permeabilizadas en 0,5% de Triton X-100 durante 10 minutos y se bloquearon con 5 mg /ml de BSA durante 1 hora antes de hacer reaccionar con el anticuerpo primario durante la noche (4 ° C) y luego el anticuerpo secundario apropiado durante una hora a temperatura ambiente. Después de que el anticuerpo secundario, los tejidos se incubaron con DAPI (0,5 M), faloidina (10-50 nM) o DAPI /faloidina como apropiado para la tinción de los núcleos y /o actina filamentosa. Múltiples lavados se utilizaron siguiendo las incubaciones primarios y secundarios, y la contratinción. cubreobjetos se montaron utilizando tamponada 75% de glicerol con galato de n-propilo 0,2% para minimizar la decoloración. Todas las soluciones se hicieron reaccionar inmunológicamente en PBS-Tween [(en g /litro: NaCl 8,0, KH _{2 PO 4 0,2, Na 2HPO 4 1,15, KCl 0,2,), 1% Tween- 20, pH 7,4] con 0,1% de BSA. Los controles negativos incluyeron 0,1% de BSA sin el anticuerpo primario, y no mostraron ninguna inmunorreacción.}

se observaron Microscopía

Secciones usando un microscopio Olympus IX70 con iluminación de epifluorescencia. Las imágenes digitales fueron tomadas con una cámara CCD de 16 bits de Princeton Instruments (Princeton, Nueva Jersey), controlados a través de una tarjeta PCI a través de IPLab para Windows en un PC (Ver 3.6, Scanalytics;. Fairfax, VA). Las imágenes fueron tomadas usando un × (1,25 NA) Lente de aceite de 100 × (1,3 NA) o 60 o un (ND 0.9) Lente de aire 40 × y almacenados en el PC. filtros de emisión utilizados fueron 405, 490 y 570 nm. Las secciones también fueron vistos usando un microscopio confocal Nikon (Nikon Eclipse confocal A1 Ti). Los objetivos utilizados fueron 100 × (1,4 NA) Lente de aceite a 425, 488 y 561 nm. Resultados similares se observaron en las distribuciones de inmunofluorescencia utilizando estos dos sistemas diferentes.

Análisis de Imágenes de Distribución de la PKC /CPI-17 de las células individuales en los tejidos

Los perfiles de intensidad de fluorescencia se tomaron de las células individuales en secciones de tejido transversales. Se observaron las secciones a bajo aumento (10-20x) para evitar las zonas de artefactos aparentes (plegadora de toallitas, los daños por congelación, etc.). En una zona de libre artefacto de la ampliación se incrementó a 40-100x, y las imágenes fueron tomadas en estos aumentos superiores. Tres áreas diferentes dentro de una sección de tejido fueron elegidos para tomar fotografías. Serie Z-pila se tomaron de forma individual para cada uno de los tres canales de color que se utilizan. Se tomaron secciones de 1 m de espesor Z, y se tomaron secciones 15-25 Z para cada sección de tejido (figuras S1 & S2 ejemplos muestran Z-pila de CPI-17 inmunoreactividad en el antro con y sin activación del tejido). Cada serie Z pila se examinó para cada sección para identificar la imagen central z, y esta imagen se convirtió en .bmp archivo, que fue importado a NIS-Elements AR 3.0 (Nikon) en un PC para analizar los datos.

Los perfiles de intensidad de fluorescencia PKCa y faloidina se obtuvieron para las células individuales en secciones de tejido transversales. Una línea se dibuja a través del centro del campo de imagen. Se seleccionaron diez células atravesado por la línea para las mediciones. En base a los protocolos anteriores [25], los primeros cinco pixeles (~ 0,7 M) a cada lado de la celda en la intensidad faloidina aumentó bruscamente desde la línea de base se define como la periferia de la célula. Para las mediciones de citosólicas, una línea se colocó al menos 2 m de distancia de la periferia de la célula. mediciones de la intensidad se hicieron utilizando una región de interés (ROI) más o menos en el centro de la célula (para mediciones citosólicas), o a lo largo de la membrana de la célula (para las mediciones periféricas). Por consistencia, el tamaño de la ROI se mantiene constante para las mediciones periféricas y citosólicas. Las células en la sección con diámetros muy pequeños (no es capaz de medir el ROI citosólico al menos 2 m de la periferia) o con núcleos presentes (DAPI visibles donde las limitaciones espaciales y orgánulos perinuclear podrían confundir la distribución) se excluyeron del análisis. Para PKCa, se utilizó la relación de la intensidad media de PKCa en la periferia sobre la intensidad total PKCa (suma de la intensidad de PKCa de ROI en la periferia y ROI en el citosol). Diez células por campo y tres campos diferentes fueron sometidas a medición para el análisis de datos para cada región de tejido, es decir, treinta células se contaron y promediaron para cada muestra (n = 1). El tamaño de la muestra final fue n = se aplicaron 5.Los mismos procedimientos para medir la intensidad de CPI-17, excepto que sólo un campo de 10 células se utilizaron para cada muestra (n = 1), con un tamaño de muestra final de n = 3.

medidas mecánicas

Inmediatamente antes de su uso, las tiras de tejido se cortan y se sujetan en cada extremo, con las abrazaderas asegurados entre ganchos en una barra de metal estacionaria y un transductor de fuerza isométrica (Harvard Apparatus, Holliston, MA), en PSS burbujear con 95% de O _{2/5% de CO 2 en cámaras musculares con camisa de agua (Radnoti Glass Technology, Monrovia, CA) a 37 ° C. La longitud de cada tira se varió cambiando la posición de la barra de metal estacionario.}

músculo liso tiras de tejido (antro del estómago y del fondo de ojo) se equilibraron durante 1 h y se estiran a una tensión pasiva aproximar Mín usando una curva longitud-tensión abreviado . Para contraer tejidos, PSS fue reemplazado con K ^{+ - PSS (mM KCl 109 está sustituido iso-osmóticamente para NaCl) [28]. Las tiras de músculo se activaron repetidamente con el estiramiento del tejido entre cada activación, hasta que el pico de fuerza ya no mostró un aumento significativo sobre la contracción anterior. Las cámaras se vacían tres veces con PSS después de cada activación del tejido. Al menos dos sucesivas K + repetibles - contracciones PSS se utilizaron para obtener una traza la fuerza de serie con 10 minutos de descanso entre cada contracción antes de comenzar el experimento. Los tejidos se conecta después con carbacol 1 mM y relajado de nuevo, como se llevó a cabo durante la K + - contracciones PSS. contracciones posteriores han incluido fentolamina 1 M y propranolol para bloquear α- y β - adrenérgicos, respectivamente. Tras el final de 1 mM CCh contracción y lavado, los tejidos se activaron con 1 M PDBu para grabar su respuesta mecánica.}

Análisis de Datos Fuerza

Las señales de voltaje de transductores de fuerza se digitalizaron 400 de Powerlab 4 o hardware SP (ADInstruments, Castle Hill, Australia) visualizado en una pantalla de ordenador (v3.6 o Gráfico 4.0, ADInstruments) como la fuerza (g) a 10 Hz y almacenada por el comando de software para un disco duro para su posterior análisis. Las figuras se hicieron con el programa de hoja de cálculo de Excel 2000 (Microsoft, Redmond, WA).

electroforesis en gel y Western Blot

La expresión de proteínas se analizó como se describe anteriormente [29]. Los tejidos se homogeneizaron en 50 mg /ml en 0,125 M de Tris, 2% de dodecilsulfato de sodio (peso /vol), 20% de glicerol, 0,1% de azul de bromofenol (vol peso /) y ditiotreitol 20 mM. Las proteínas se resolvieron en geles de bajos de reticulación dodecilsulfato sódico [30] y se realizó la inmunotransferencia como se ha descrito anteriormente [31]. El anticuerpo reconoce PKCa ya sea una sola banda o con mayor frecuencia un doblete a ~76 kD mientras que el anticuerpo CPI-17 reconoce una única banda en ~17 kD. Estos tamaños son consistentes con el tamaño esperado para estas proteínas en base a la movilidad en gel. Para asegurar la precisión de las transferencias de Western, las curvas de carga se realizaron tanto para fondo de ojo y el antro del estómago muestras en un intervalo de 5 veces de cargas (4-20 mu l) para la actina (tinción con azul Coomassie) y PKCa y CPI-17 (Western Blot) . Los resultados mostraron una relación lineal a lo largo de este intervalo para las tres proteínas a partir de ambos tejidos (R ^{2 > 0,98 para todos los resultados, n = 3). La cuantificación de PKCa y CPI-17 expresión de la proteína se realizó en transferencias Western utilizando cargas 5-10 l que estaba dentro de este rango lineal (n = 6).}

Estadísticas

Las comparaciones estadísticas se llevaron a cabo usando Minitab (Minitab Inc. State College, PA). Se utilizó una prueba t de una muestra para probar la distribución de PKCa /CPI-17 (un periférico al contenido total de retorno de la inversión de 0,5 indica una distribución "uniforme" en las células musculares lisas (CML)) en el antro y fondo de ojo en condiciones de reposo. Una forma ANOVA se realizó para comprobar si la PKC /CPI-17 diferencias de distribución para los dos tejidos con diferentes parámetros de estimulación. Dos pruebas t de muestras se utilizaron para probar la significación de la diferencia de nivel de expresión de PKCa o CPI-17 en antro y fondo de ojo. Un F-prueba de dos colas para la igualdad de dos desviaciones estándar (DE) determina una SD significativamente menor en la relación de la caveolina a PKCa si se compara con la desviación estándar de la relación de vinculina a PKCa. Un valor de P < 0,05 fue considerado significativo para todas las pruebas estadísticas. No hay pruebas estadísticas se realizaron en los datos de la fuerza y ​​la figura 1 es representativa de datos similares de 6 animales diferentes. Western blot datos es de seis animales. datos de distribución PKCa es un promedio de treinta células medidos por animal y cinco animales se pusieron a prueba. datos de distribución de CPI-17 es un promedio de 10 células medidos por animal y tres animales se pusieron a prueba. de datos de proteínas co-localización se basa en una "n" de al menos 20 células de al menos 3 animales.

Resultados

porcina fundus del estómago es un tejido de músculo liso principalmente tónica que responde a la estimulación con una contracción sostenida mientras que el antro es un tejido de músculo liso principalmente fásico que responde a la estimulación con una contracción transitoria (Fig. 1). En los tejidos estas respuestas son probablemente el resultado de la estimulación directa del músculo liso como la adición de 1 M propranolol (β bloqueador de agonista) y la fentolamina (α bloqueador de agonista) se utilizó para evitar la activación de los receptores adrenérgicos debido a la liberación potencial de neurotransmisores simpáticos. La estimulación del músculo liso con PDBu se utiliza rutinariamente para provocar la contracción del músculo liso vía activación de PKC [32], [33], [34]. Una M PDBu causa una pequeña contracción lenta en tiras fundus del estómago (~ 40% de K ^{+ respuesta de estimulación), mientras que el antro muestra esencialmente ninguna respuesta (< 5% K + estimulación) (Fig. 1). La diferencia entre las respuestas sostenidas y transitorias de estos dos tejidos a KPSS y CCh, y la presencia o ausencia de una respuesta contráctil a la estimulación PDBu podría ser debido a la expresión y /o la distribución espacial-temporal de los segundos mensajeros corriente abajo (PKCa y CPI-17) que se pretende que sea responsable de la inhibición PCML con la estimulación PDBu. Para examinar esta medimos los niveles de expresión y se determinó la distribución espacio-temporal de PKCa y CPI-17 en estos tejidos.}

La figura 2 muestra los resultados de Western blot para la expresión de CPI-17 y PKCa en el antro del estómago y fundus. Los tejidos se procesaron para el control de la concentración de proteína, y los resultados se calcularon en base a la intensidad de la señal de la proteína respectiva, y se normalizó a la expresión de proteína actina (Fig. 2). Ambos métodos (sólo los datos normalizados se muestran) indican que ni la expresión de la proteína CPI-17 ni el de la proteína PKCa es significativamente diferente (p > 0,23 & p > 0,28, respectivamente, n = 6) al comparar estos dos tejidos SM. Los controles se realizaron utilizando una gama de cargas para confirmar el rango de linealidad de la carga, y que las muestras utilizadas para la cuantificación estaban dentro de este rango (datos no mostrados, véase métodos). Debido a que no hay diferencias en la expresión de estas dos proteínas entre estos dos tejidos, el próximo procedió a determinar si las diferencias en su distribución espacial-temporal podría explicar la diferencia en sus respuestas a la estimulación PDBu.

Figura 3 muestran resultados inmunohistoquímico diferencial para la distribución de PKCa en las capas longitudinales y circulares del fondo de ojo y el antro. En condiciones de reposo en solución relajante cuando no hay generación de la fuerza por el tejido, la PKCa parece estar distribuido de forma única preferentemente cerca de la periferia de la (color verde Fig. 3, PSS) SMCs. La estimulación de los tejidos con 1 M CCh (3 ') o 1 M PDBu (10 y 30') no altera esta distribución periférica de PKCa. La relación de la distribución de la PKCa cerca de la membrana plasmática en relación con PKCa celular total se utilizó para cuantificar los posibles cambios en la distribución de esta proteína bajo estas diferentes condiciones. La Figura 4 muestra los resultados como la relación de la PKCa en la periferia de la célula en relación con los PKCa totales presentes en la célula (periférica /(periférica + citosol), ver métodos). Una proporción de 0,5 indicaría una distribución "uniforme" de la proteína a través de la célula. La relación PKCa (periférica /total) osciló entre 0.64-0.68 en todas las condiciones examinadas. Estos valores son significativamente mayores que 0,5 (p < 0,05), lo que indica que PKCa se encuentra principalmente en la periferia de la célula (no se "uniforme" distribuye en la célula) y que esta distribución no cambia entre las condiciones relajadas o estimuladas <. br>

Dado que se propone PKCa para activar CPI-17, se procedió a determinar la distribución espacio-temporal de CPI-17 en estos tejidos en condiciones similares. La Figura 5 muestra los resultados inmunohistoquímico diferencial para la distribución de CPI-17 en las capas longitudinales y circulares del fondo de ojo y el antro. Bajo condiciones de reposo en solución relajante cuando no hay generación de la fuerza por el tejido, el CPI-17 parece estar distribuido de forma difusa a lo largo de la SMC (Fig. 5- PSS, fig. S1). La estimulación de los tejidos con 1 M CCh (30 ') (pero no 1 M CCh para 3', los datos no presentados) o 1 M PDBu (30 ') resulta en un cambio significativo en esta distribución de tal manera que ahora aparece el CPI-17 que es principalmente en la periferia de la célula en una distribución similar a la observada para PKCa (Fig. 5, fig. S2). La relación de la distribución de la CPI-17 cerca de la membrana de plasma en relación con el total de CPI-17 (periférica + citosólico) se utilizó para cuantificar los posibles cambios en la distribución de esta proteína bajo estas diferentes condiciones. La Figura 4 muestra los resultados como la relación de-periférica total CPI-17. La relación CPI-17 (periférica /total) osciló entre 0.49-0.67 en todos los tejidos y las condiciones examinadas. La relación de CPI-17 periférica /Total en condiciones relajadas no es significativamente diferente de 0,5 (medio de 0,49 a 0,5; P > 0,19) que indica que el CPI-17 se distribuye de manera difusa a través de las células del músculo liso bajo esta condición. Esto no cambia después de 3 'de 1 M CCh estimulación que aún no existe una diferencia significativa entre las condiciones relajadas (significa = 0,53-0,55; p > 0,05) con la excepción de los tejidos de fondo de ojo, donde la relación periférica /total del IPC-17 es significativamente mayor (p < 0,05) en 3 '(Fig. 4). Con 30 'de cualquiera de 1 M CCh o 1 estimulación M PDBu, la distribución de CPI-17 se vuelve significativamente mayor que 0,5 para todos los tejidos y capas (medio = 0.62-0.67, P < 0,01), lo que indica que CPI-17 se encuentra ahora principalmente en la periferia de células (que ya no se "uniforme" distribuida por toda la célula), similar a la distribución de PKCa (Fig. 4).

la distribución principalmente periférica de PKCa (tanto en condiciones relajadas y estimuladas) y CPI-17 (después de 30 'de la estimulación con CCh o PDBu) no es uniforme en la periferia de la célula, pero punteada en la distribución (Fig. 6). También hay una distribución puntiforme de las uniones adherentes y caveolas anatómicamente y funcionalmente distintos en la membrana plasmática SMC [26]. Con el fin de determinar si la distribución de la PKCa y CPI-17 en la membrana corresponde con el patrón punteado de las uniones adherentes, hicimos el doble etiquetado con dos proteínas de unión adherente asociado, vinculina y Talin. El patrón alternativo de distribución de los fluoróforos rojos y verdes en las membranas muestran que la PKCa y CPI-17 no co-localizar con cualquiera vinculina o Talin (Fig. 6), lo que sugiere que la PKCa y CPI-17 no se asocian con el complejo de unión adherente en las condiciones que hemos examinado. Debido a que se alternan con las caveolas uniones adherentes en la membrana periférica [26], PKCa y CPI-17 puede co-localizar con la caveolas. Para determinar si la distribución punteada de la PKCa y CPI-17 en la membrana se corresponde con el patrón puntiforme de las caveolas, también hicimos doble etiquetado de PKCa con caveolina. La distribución de PKCa y caveolina co-localizar en la membrana en condiciones relajado y activadas como se puede observar por la aparición de la fluorescencia amarillo /naranja en lugar de fluorescencia roja y verde distinta (Fig. 6). Un F-test de dos colas para la igualdad de dos desviaciones estándar (DE) determina una SD significativamente menor en la proporción de la caveolina a PKCa cuando se compara con la SD de la relación de vinculina a PKCa (n = 20 células; p < 0,05) . Además, el doble etiquetado de PKCa con CPI-17 tras la activación del tejido también muestra significativa co-localización (n = 20 células; p < 0,05) de estas dos proteínas cerca de la membrana plasmática (Fig. 7). Estos datos muestran que PKCa se localiza principalmente cerca de la caveloi en la membrana plasmática SMC en todo momento, y que después de la activación de tejido, una parte significativa de la citosólica CPI-17 se transloca al caveolas en el plasma donde se co-localiza con PKCa.

Discusión

tejidos de músculo liso se caracterizan habitualmente por ser ya sea "tónico" (generando una contracción isométrica mantenida lento) o "fásico" (generando una rápida contracción isométrica transitoria). generación de la fuerza y ​​/o acortamiento del tejido en CC se cree que requieren elevados fosforilación de la miosina de cadena ligera, el consumo de ATP y el puente en bicicleta cruz. Un posible mecanismo responsable de estos dos tipos de contracciones es diferencial Ca ^{2 + sensibilización. Ca 2 + sensibilización en el músculo liso se cree en gran parte a ser debido a la inhibición de la MLCP concurrente con o después de la activación de MLCK durante la activación del tejido [15], [35]. Una de las principales vías propuso estar involucrado en Ca 2 + sensibilización es a través de receptores acoplados a proteína G (GPCR) /fosfolipasa C (PLC) /diacilglicerol (DAG) /PKC /CPI-17 para inhibir MLCP. GPCR, PLC, y DAG están ubicados en /en la membrana plasmática. La ubicación de la MLCP es menos seguro, pero en algún punto en el tiempo después de la activación de tejido MLCP necesita ser asociado con MLC _{20 en la molécula de miosina de los filamentos gruesos con el fin de desfosforilar esta proteína. Debido a que se ha informado de filamentos gruesos para ser distribuidos por todo el citoplasma SMC [36], [37], [38], [39], el PCML también tendrá que ser distribuido por todo el citoplasma en algún momento durante la relajación [40]. Si PCML se encuentra en el citosol y cerca MLC 20 durante la contracción, y PKCa y CPI-17 desempeñar un papel en la inhibición PCML durante la contracción, por lo menos se esperaría CPI-17 que se encuentra en el citosol en algún momento durante la contracción. Los resultados de este estudio muestran que PKCa está preferentemente localizada cerca de la membrana plasmática en condiciones relajadas y activadas y que CPI-17 también se localiza preferentemente cerca de la membrana plasmática en condiciones activadas. Por lo tanto, estos datos sugieren que las diferencias en la PKCα- CPI-17 Ca 2 + vía de sensibilización no puede explicar las contracciones tónicas y fásicas SM en fundus del estómago y el antro y más trabajo es necesario para determinar la forma en la distribución espacio-temporal de CPI- 17 con la activación del tejido puede regular PCML para causar Ca 2 + sensibilización de SM contracción de los tejidos intactos SM
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Mientras PDBu provoca una contracción lenta en el fondo de ojo, que es ~ 40% de la fuerza máxima inducida KPSS , poco contracción se genera en el antro con la estimulación PDBu. Desde fundus y antro representan dos tipos básicos de músculo liso, tónica y fásica, respectivamente, parece lógico atribuir la diferencia en la generación de la fuerza de propiedades distintas de fásica y tónica muscular. Woodsome et al [41] informaron de que el nivel de expresión de CPI-17 en SM vascular tónico es más alta que en SM vascular fásica. Esto podría explicar la diferente capacidad de los músculos tónicos para mantener la fuerza (una alta concentración de CPI-17 inhibe PCML permitiendo MLC _{20 fosforilación para alojarse alta y la fuerza para ser mantenido en tónico SM). Este estudio examinó la expresión de proteínas PKCa y CPI-17 y la distribución en el estómago porcina visceral. Para nuestra sorpresa, no se detectó ninguna diferencia significativa en el nivel de expresión de la proteína de PKCa o CPI-17 entre el fondo de ojo y el antro (Fig. 2).}

• PLOS ONE: La nicotina atenúa la activación de los macrófagos del tejido residente en el estómago del ratón a través de la β2 nicotínico de acetilcolina de los receptores
• PLOS ONE: Tratamiento quirúrgico de pacientes con tumor de Krukenberg de origen de estómago: Resultados clínicos y factores pronósticos de los análisis