PLOS ONE: Tonic e Phasic contração do músculo liso não é regulado pela PKCα - CPI-17 Caminho no estômago Swine antro e Fundus

Abstract

Regulamento da fosfatase da miosina de cadeia leve (MLCP) via da proteína quinase C ( PKC) e o inibidor de 17 kDa da PKC-potenciada de miosina fosfatase da cadeia leve (CPI-17) tem sido relatado como uma Ca ^{2+ via de sinalização de sensibilização em músculo liso (SM), e assim podem estar envolvidos na tónico vs. contrações fásicas. Este estudo analisou a expressão da proteína e distribuição espaço-temporal da PKCα e CPI-17 em tecidos SM intactas. estimulação KCl ou carbacol (CCh) do tónico SM fundo do estômago gera uma contração sustentada enquanto o antro do estômago fásica gera uma contração passageira. Além disso, o fundo tónico gera uma maior força relativa do antro fásica com 1 uM de forbol 12, 13-dibutirato de estimulação (PDBu), que é relatado para activar o PKCα - IPC-17 via. As análises de transferência de Western demonstrou que esta diferença não contráctil foi causado por uma diferença na expressão da proteína de PKCα ou CPI-17 entre estes dois tecidos. Immunohistochemical resultados mostram que a distribuição de PKCα nas camadas circulares e longitudinais do fundo ocular e antro não diferem, sendo predominantemente localizada perto da membrana plasmática da célula SM. Estimulação de qualquer tecido com 1 PM PDBu ou 1? M CCh não altera esta distribuição PKCα periférica. Não existem diferenças entre esses dois tecidos para a distribuição de CPI-17, mas ao contrário da distribuição PKCα, CPI-17 parece ser distribuição difusa por todo o citoplasma sob condições de tecido relaxado, mas desloca-se para uma distribuição principalmente periférica na membrana plasmática com estimulação de os tecidos com 1 uM ou 1 uM PDBu CCh. Os resultados de marcação dupla mostram que nem PKCα nem CPI-17 co-localizar na junção aderente (vinculina /talina) na membrana mas eles co-localizar um com o outro e com cavéolas (caveolina) na membrana. Esta falta de diferença sugere que o PKCα - via CPI-17 não é responsável pela tônica vs. contrações fásicas observados no fundo do estômago e antro}

Citation: Zhang Y, Hermanson ME, Eddinger TJ (2013) Tonic. e Phasic contração do músculo liso é não reguladas pelas PKCα - CPI-17 Caminho no estômago Swine antro e Fundus. PLoS ONE 8 (9): e74608. doi: 10.1371 /journal.pone.0074608

editor: Wenhui Hu, da Escola de Medicina da Universidade de Temple, Estados Unidos da América

Recebido: 13 Março, 2013; Aceito: 04 de agosto de 2013; Publicação: 18 de setembro de 2013

Direitos de autor: © 2013 Zhang et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiada pela National Science Foundation (NSF), Departamento de Ciências Biológicas e da Graduate School, Universidade Marquette. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

O mecanismo (s) que determinam tónico (sustentada) vs. fásicas contrações (transitória) do músculo liso (SM) continua por resolver. inervação diversificada e circulando moléculas de sinalização, além de receptor único e expressão da proteína (isoforma) e vias de sinalização intracelular complicar a questão. Não inesperadamente, existem várias hipóteses propostas para explicar tónico manutenção vigor em SM incluindo: lisa miosina muscular pontes cruzadas slowly- ou não ciclismo chamadas pontes de trava [1], [2], [3], [4]; recrutamento de miosina não-muscular II [5], [6], [7]; formação de caldesmona ou calponina ligações cruzadas dependentes de actina-a-miosina [8], [9]; formação de estruturas de suporte de força do citoesqueleto [10], [11], [12]; e regulação da LC miosina _{20 fosforilação via segundos mensageiros que afectam quinase de miosina de cadeia leve (MLCK) e miosina fosfatase de cadeia leve atividade (MLCP) [13], [14], [15], [16], [17] , [18]. Esta última categoria é de interesse por causa da expressão diferencial relatado, localização e regulação destas proteínas segundo mensageiro em vários tecidos SM. regulação variável da atividade MLCK e MLCP pode prestar não só um meio para Ca ^{2 + sensibilização, mas também um possível mecanismo para tónico vs. contração fásica. Inactivação de MLCP através do PKCα -CPI-17 via permitiria mantida cadeia leve alta miosina (MLC 20) fosforilação e, portanto, uma força contrátil sustentado. Uma falha para inactivar MLCP reduziria MLC 20 fosforilação e força, o que resulta numa contracção transiente. Fundus de estômago SM gera um tónico (sustentada) contracção enquanto antro do estômago SM gera uma contracção fásica (transiente) em resposta a uma variedade de estímulos.}}

Ca ^{2+ sensibilização, que envolve a activação de G- segundo caminhos do mensageiro acoplados à proteína que sensibilizam as proteínas contrácteis de [Ca 2+ _{I] através da inibição MLCP, pode ocorrer por qualquer uma de numerosas vias. Uma das vias relatados para a inibição da actividade MLCP inclui o C-quinase activada proteína quinase C de proteína /inibidor de PP1 de 17 kDa (PKC /IPC-17) via de [19], [20]. receptor de proteína G-acoplada (GCPR) activação resultando na activação de fosfolipase C (PLC), hidrolisa fosfatidilinositol 4,5-bifosfato (PIP 2) para a produção de inositol 1,4,5-trifosfato (IP 3) e diacilglicerol (DAG). DAG é conhecida para activar a PKC que pode causar a fosforilação de CPI-17 para inibir selectivamente MLCP (revisto por SM visceral em [17]). PKC é acreditado para ser regulada pela sua activação e distribuição espacial no interior da célula, o último ser controlado por ancoragem de proteínas que se ligam a e restringem a localização da PKC a regiões específicas da célula [21], [22]. Por exemplo, os relatórios de Ca 2 + canais do tipo L constitutivamente ativo e sua regulação por PKC [23], [24] sugere que PKC está localizada perto da membrana das células musculares lisas. A função celular de CPI-17 na célula pode variar dependendo do seu nível de expressão da proteína e se ele está localizado perto da membrana do plasma onde PKCα está localizado /activado, ou associada com os filamentos grossos contráctil miosina onde MLCP seriam localizados para de -phosphorylate cadeia leve de miosina 20 (MLC 20).}}

A expressão de PKCα e CPI-17 e seu espaço-temporal re-distribuição após a ativação do tecido têm sido propostos na Ca ^{2 + sensibilização dos tecidos musculares lisas (para revisão [14], [15], [16], [17]). Assim, é possível que as diferenças na sua expressão e localização celular /translocação poderia estar envolvida na determinação tónico vs respostas contrácteis fásica. Para estas duas proteínas a serem parte de uma via envolvida na inibição da actividade MLCP durante a activação do tecido, e assim causando um tónico ou resposta fásica, eles precisam de ser expressa em níveis adequados e posicionado na localização correcta na célula na altura correcta. Uma vez que a PKC é activada pelo DAG (uma membrana de fosfolípido ligado), que deve também estar na membrana, pelo menos temporariamente para que isso aconteça. E se CPI-17 vai inibir a desfosforilação de MLCP MLC _{20 sobre os filamentos grossos, a CPI-17 em algum ponto tem de ser no citosol associado com os filamentos grossos ali presentes. Com estes dois passos que ocorrem em duas regiões espacialmente distintas da célula, uma ou ambas destas proteínas tem de se translocar para o outro região para que eles interajam e completar a via.}}

O objectivo deste estudo foi para testar a hipótese de que o PKCα - IPC-17 Ca ^{2+ via sensibilização está envolvido na determinação tónico (sustentada) e fásica (transitória) respostas contrácteis de músculos lisos. Para fazer isso, determinou-se a expressão da proteína e distribuição espaço-temporal da PKCα e CPI-17 no antro do estômago fásicas e fundo do estômago tónico em condições relaxado e ativados. Os resultados demonstram que não há diferença significativa na expressão de qualquer uma destas duas proteínas, nem na sua distribuição periférica entre estes dois tecidos são inconsistentes com a hipótese de que o PKCα- CPI-17 Ca 2 + via de sensibilização é o fator determinante para o tónico vs. respostas contráteis fásicas observadas nesses tecidos.}

Métodos

Órgãos e tecidos Handling

tecidos de Suínos (estômagos) foram obtidos a partir Hansen Meat Serviço (Franksville, WI) e colocar em solução salina fisiológica fria (PSS; (em mM): 140,1 NaCl, 4,7 KCl, 1,2 na _{2HPO 4, 2,0 MOPS (pH 7,4), 0,02 na 2EDTA, 1,2 MgSO 4, 1,6 CaCl 2, e 5,6 glucose). Os estômagos foram limpos de sangue, tecido conjuntivo frouxo, e, em alguns casos, a mucosa, e congelou-se imediatamente ou armazenado em PSS no frigorífico durante 0-2 dias. Alguns órgãos estavam frescas congelado o mais rapidamente possível após post-mortem (60-90 minutos). Alguns órgãos foram incubadas em PSS e /ou estimuladas com 1,0 uM CCh ou PDBu (Sigma) a 37 ° C, durante diferentes intervalos de tempo antes da congelação. tempos de incubação variáveis ​​e as concentrações agonistas foram também testados. Para imuno-histoquímica todo o tecido foi armazenada congelada até serem seccionados e imunorreagiu. Congelamento em todos os casos envolviam colocando pedaços de tecidos ou tiras de tecidos em isopentano arrefecido em azoto líquido seguida de armazenamento a -80 ° C. Cinco a seis ^ m seções dos tecidos congelados foram cortadas num criostato Leica CM1900, pegou em lâminas de vidro e armazenado congelado (0-1 dias) até imunorreagir.}

immunoreactions e reagentes

A os anticorpos utilizados foram obtidos a partir das seguintes fontes: PKCα (H-7 e C-20) e CPI-17 (H-60) a partir de Santa Cruz Biotech, Santa Cruz, CA; Vinculin e Talin da Sigma, Saint Louis, Missouri; Caveolin 1 da BD Biosciences, San Jose, CA; Cy2 e Cy3 Donkey anti rato ou coelho da secundárias de Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA; Alexa Fluor 594-faloidina e DAPI de Molecular Probes, Eugene, OR. Todos estes anticorpos têm sido utilizados anteriormente no nosso laboratório para imuno-histoquímica e Western blotting, onde eles mostram especificidade para uma banda com o peso molecular correcto para a respectiva proteína indicada [25], [26], [27]. Os controlos negativos, onde o anticorpo primário não está incluído mostram nenhuma reactividade para estas bandas e não imunofluorescência em secções de tecido.

secções de tecido congeladas apanhados em lâminas de vidro foram descongeladas à temperatura ambiente e em seguida fixadas com 2% de paraformaldeído durante 10 minutos, permeabilizadas em 0,5% de Triton X-100 durante 10 minutos e bloquearam-se com 5 mg /ml de BSA durante 1 hora antes da reacção com o anticorpo primário durante a noite (4 ° C) e, em seguida, o anticorpo secundário adequado, durante uma hora à temperatura ambiente. Depois do anticorpo secundário, os tecidos foram incubados com DAPI (0,5 uM), faloidina (10-50 nM) ou DAPI /faloidina conforme apropriado para a coloração de núcleos e /ou a actina filamentosa. Múltiplas lavagens foram usadas seguindo as incubações primárias e secundárias, e a de contraste. Vidros de cobertura foram montados usando tamponada 75% de glicerol com 0,2% de galato de n-propilo para minimizar desbotamento. Todas as soluções foram feitas imunorreagir em PBS-Tween [(em g /litro: 8,0 de NaCl, KH _{2 PO? 4 0,2, Na 2HPO 4 1,15, KCl 0,2,), 1% tween- 20, pH 7,4], com 0,1% de BSA. Os controlos negativos incluíram 0,1% BSA sem o anticorpo primário, e não mostrou nenhum imunorreacção.}

Microscopia

Os cortes foram observados usando um microscópio Olympus IX70 com iluminação de epifluorescência. As imagens digitais foram tiradas com uma câmera CCD de 16 bits Princeton Instruments (Princeton, NJ), controlada através de uma placa PCI através IPlab para Windows em um PC (Ver 3.6, Scanalytics;. Fairfax, VA). As imagens foram tiradas utilizando um × (1.25 NA) 100 × lente óleo (1,3 NA) ou 60 ou um (NA 0.9) de ar da lente 40 × e armazenado no PC. filtros de emissão utilizados foram 405, 490 e 570 nm. Seções também foram vistos usando um microscópio confocal Nikon (Nikon A1 confocal Eclipse Ti). Os objectivos utilizados foram de 100 × (1,4 NA) da lente de óleo a 425, 488 e 561 nm. Resultados semelhantes foram observados nas distribuições de imunofluorescência usando esses dois sistemas diferentes.

Análise de Imagem de Distribuição de PKC /CPI-17 das células individuais em tecidos

Perfis de intensidade de fluorescência foram tomadas para células individuais em secções de tecido transversais. As secções foram observadas a baixa ampliação (10-20x) para evitar áreas de artefactos aparentes (dobragem do tecido, congelar dano, etc.). Em uma área livre de artefato a ampliação foi aumentado para 40-100x, e fotos foram tiradas nessas ampliações. Três áreas diferentes dentro de uma secção de tecido foram escolhidos para tirar fotos. série Z-pilha foram levados individualmente para cada um dos três canais de cor utilizados. 1 mm seções Z espessura foram tomadas, e 15-25 seções Z foram tomadas para cada secção de tecido (figuras S1 & exemplos S2 mostram Z-stack de CPI-17 imunorreatividade no antro com e sem activação de tecido). Cada série Z pilha foi examinada para cada seção para identificar a imagem central z, e esta imagem foi convertida a.bmp arquivo, que foi importado para NIS-Elements AR 3.0 (Nikon) em um PC para analisar os dados.

Perfis de PKCα e faloidina intensidade de fluorescência foram obtidos para células individuais em secções de tecido transversais. Uma linha foi traçada no centro do campo de imagem. Dez células cruzados pela linha foram selecionados para as medições. Com base nos nossos protocolos anteriores [25], os cinco primeiros pixels (~ 0,7 uM) em ambos os lados da célula, onde a intensidade faloidina aumentou acentuadamente a partir da linha de base foram definidos como a periferia da célula. Para medições citosólicas, uma linha foi colocada, pelo menos, 2 m de distância a partir da periferia da célula. medições de intensidade foram feitas usando uma região de interesse (ROI) mais ou menos no centro da célula (para medições citosólicas), ou ao longo da membrana da célula (para medições de periféricos). Por razões de consistência, o tamanho do ROI é mantida constante durante as medições periféricos e citosólicos. As células na secção com diâmetros muito pequenos (não é capaz de medir o ROI citosólica, pelo menos 2 um a partir da periferia) ou com a presença de núcleos (coloração DAPI visível onde as limitações espaciais e organelas perinucleares pudessem confundir a distribuição) foram excluídos da análise. Para PKCα, foi utilizada a razão entre a intensidade média de PKCα na periferia sobre a intensidade total PKCα (soma da intensidade PKCα de ROI na periferia e no citosol ROI). Dez células por campo e três campos diferentes foram submetidos a medição para análise de dados para cada região de tecido, isto é, trinta e as células foram contadas e calculada a média para cada amostra (N = 1). O tamanho final da amostra foi N = 5.O mesmos procedimentos foram utilizados para medir a intensidade de CPI-17, excepto que apenas um campo de 10 células foram usadas para cada amostra (n = 1), com um tamanho de amostra final de n = 3.

medições mecânicas

imediatamente antes da utilização, tiras de tecido foram cortadas e fixadas em cada extremidade, com os grampos garantidos entre os ganchos em uma haste de metal estacionário e um transdutor de força isométrica (Aparelho Harvard, Holliston, MA), no PSS aeradas com 95% O _{2/5% de CO 2 em câmaras musculares jaqueta de água (tecnologia de vidro Radnoti, Monrovia, CA) a 37 ° C. O comprimento de cada tira foi variada por reposicionamento do varão de metal estacionária.}

O músculo liso tiras de tecido (antro do estômago e fundus) foram equilibrados durante 1 h e esticado a uma tensão passiva aproximação Lo usando uma curva de tensão-comprimento abreviado . Para contratar tecidos, PSS foi substituído por K ^{+ - PSS (KCl 109 mM é substituído iso-osmoticamente para NaCl) [28]. As tiras de músculo foram activadas repetidamente com alongamento do tecido entre cada activação, até que a força de pico não mostrou um aumento significativo sobre a contracção anterior. Chambers estavam coradas três vezes com PSS após cada ativação do tecido. Pelo menos dois sucessivos K + repetíveis - PSS contrações foram usadas para obter um rastreamento força normal com um descanso de 10 minutos entre cada contração antes de iniciar o experimento. Os tecidos foram então activado com carbacol 1 uM e relaxados de novo, tal como foi realizada durante k + - contracções PSS. contracções subsequentes todos incluídos fentolamina 1 uM e propanolol para bloquear α- e β - adrenérgicos, respectivamente. Após a 1 PM CCh contração final e lavagem, os tecidos foram activadas com 1 PM PDBu para gravar sua resposta mecânica.}

Análise da Força de dados

sinais de tensão de transdutores de força foram digitalizados por PowerLab 400 ou 4 hardware SP (ADInstruments, Castle Hill, Austrália) visualizado na tela do computador (v3.6 Gráfico ou 4.0, ADInstruments) como força (g) a 10 Hz e armazenada pelo comando de software para um disco rígido para as análises posteriores. Figuras foram feitas com o programa de planilhas Excel 2000 (Microsoft, Redmond, WA).

eletroforese em gel e Western Blotting

A expressão proteica foi analisada como descrito anteriormente [29]. Os tecidos foram homogeneizados em 50 mg /ml em 0,125 M de Tris, 2% dodecilsulfato de sódio (peso /vol), 20% de glicerol, 0,1% de azul de bromofenol (p /v) e ditiotreitol 20 mM. As proteínas foram resolvidas em géis de ligação cruzada de baixo dodecilsulfato de sódio [30], e imunotransferência foi realizada como previamente descrito [31]. O anticorpo PKCα reconhecida seja uma única banda, ou mais frequentemente um gibão na ~76 kD enquanto o anticorpo CPI-17 reconheceu uma única banda a ~17 kD. Estes tamanhos são consistentes com o tamanho esperado para essas proteínas com base na mobilidade no gel. Para garantir a precisão dos western blots, as curvas de carregamento foi feito para ambas as amostras fundus e antro do estômago ao longo de um intervalo de 5 vezes de cargas (4-20 ul) para a actina (coloração com azul de Coomassie) e PKCα e IPC-17 (Western blotting) . Os resultados demonstraram uma relação linear ao longo deste intervalo de todas as três proteínas de ambos os tecidos (R ^{2 > 0,98 para todos os resultados, n = 3). Quantificação de PKCα e expressão da proteína CPI-17 foi feito em Western blot utilizando 5-10 cargas ul que foi dentro desta faixa linear (n = 6).}

Estatísticas

As comparações estatísticas foram realizadas usando MINITAB (Minitab Inc. State College, PA). Uma amostra de um teste-t foi utilizada para testar a distribuição de PKCα /IPC-17 (um periférico ao teor total de ROI de 0,5 indica uma distribuição "uniforme", em células de músculo liso (SMC)) no antro e do fundo do olho sob a condição de descanso. Uma maneira ANOVA foi realizada para testar a PKC /CPI-17 diferenças de distribuição para os dois tecidos com diferentes parâmetros de estimulação. Duas amostras de testes t foram usadas para testar a significância das diferenças de nível de expressão de PKCα ou CPI-17 no antro e do fundo do olho. A F-teste bilateral de igualdade de dois desvios padrões (SDS) a uma determinada SD significativamente inferior na proporção de caveolin para PKCα quando comparado com o DP da proporção de vinculina para PKCα. Um valor de P < 0,05 foi considerado significativo para todos os testes estatísticos. Sem testes estatísticos foram realizados com os dados de força e a Figura 1 é representativo de dados semelhantes a partir dos 6 animais diferentes. dados de transferência de Western é de seis animais. dados de distribuição PKCα é uma média de trinta células medidos por animal e cinco animais foram testados. dados de distribuição de CPI-17 é uma média de 10 células por animal e medidos três animais foram testados. Dados de co-localização da proteína baseia-se num "n" de pelo menos 20 células de pelo menos 3 animais.

Resultados

suína fundo do estômago é um tecido muscular liso principalmente tónico que responde à estimulação com uma contracção sustentada enquanto o antro é um tecido muscular liso principalmente fásico que responde à estimulação com uma contracção transiente (Fig. 1). Em tecidos estas respostas são provavelmente o resultado da estimulação directa do músculo liso como a adição de 1 ^ M de propranolol (β bloqueador agonista) e de fentolamina (α bloqueador agonista) foi utilizada para prevenir a activação dos receptores adrenérgicos, devido ao potencial de libertação de neurotransmissores simpáticos. A estimulação do músculo liso com PDBu é utilizada rotineiramente para provocar a contracção do músculo liso por meio de activação de PKC [32], [33], [34]. Uma uM PDBu provoca uma pequena contracção lenta em tiras de fundo do estômago (~ 40% de K ^{+ resposta a estimulação), enquanto o antro mostra essencialmente nenhuma resposta (< 5% K + estimulação) (Fig. 1). A diferença entre as respostas sustentadas e transientes destes dois tecidos para KPSS e CCh, e a presença ou ausência de uma resposta contráctil à estimulação PDBu podia ser devido à expressão e /ou distribuição espacial-temporal dos segundos mensageiros a jusante (PKCα e CPI-17), que têm o propósito de ser responsável pela inibição da estimulação com MLCP PDBu. Para examinar esta medimos os níveis de expressão e determinou a distribuição espaço-temporal de PKCα e CPI-17 nesses tecidos.}

A Figura 2 mostra resultados de Western blot para a expressão de CPI-17 e PKCα no antro do estômago e fundo de olho. Os tecidos foram processados ​​para controlar a concentração de proteína, e os resultados foram calculados com base na intensidade do sinal de proteína respectiva, e normalizada para a expressão da proteína actina (Fig. 2). Ambos os métodos (apenas dados normalizados mostrados) indicou que nem a expressão da proteína de CPI-17 nem a da proteína PKCα é significativamente diferente (p > 0,23 & P > 0,28, respectivamente, n = 6) quando se compara estes dois tecidos SM. Os controlos foram feitos usando uma gama de cargas para confirmar a gama de linearidade de carregamento, e que as amostras utilizadas para quantificação foram dentro desta gama (dados não mostrados, ver métodos). Como não existem diferenças na expressão para estas duas proteínas entre estes dois tecidos, o próximo passou para determinar se as diferenças na sua distribuição espacial-temporal poderia explicar a diferença em suas respostas à estimulação PDBu.

A Figura 3 mostra immuohistochemical resultados para a distribuição de PKCα nas camadas circulares e longitudinais do fundo e antro. Em condições de repouso em solução relaxar quando não há geração de força por parte do tecido, o PKCα parece ser distribuído exclusivamente preferencialmente perto da periferia do (cor verde Fig. 3, PSS) PMEs. A estimulação dos tecidos com 1 uM CCh (3 ') ou 1 uM PDBu (10 e 30') não altera esta distribuição periférica do PKCα. A razão da distribuição do PKCα perto da membrana plasmática em relação ao PKCα celular total foi usada para quantificar possíveis alterações na distribuição da proteína sob estas condições diferentes. A Figura 4 mostra os resultados como a relação entre a PKCα na periferia da célula em relação ao total de PKCα presentes na célula (periférico /(+ citosol periférica), ver métodos). Uma razão de 0,5 indicaria uma distribuição "uniforme" da proteína em toda a célula. A proporção PKCα (periférico /total) variou 0,64-0,68 em todas as condições examinadas. Estes valores são significativamente maiores do que 0,5 (p < 0,05), indicando que PKCα está localizada principalmente na periferia da célula (que não é "uniforme" distribuído na célula) e que esta distribuição não muda entre as condições de relaxamento ou estimuladas <. br>

Porque PKCα é proposto para ativar CPI-17, procedeu-se a determinar a distribuição espaço-temporal da CPI-17 nesses tecidos sob condições semelhantes. A Figura 5 mostra resultados immuohistochemical para a distribuição de CPI-17 nas camadas circulares e longitudinais do fundo ocular e antro. Sob condições de repouso em solução relaxante quando não há geração de força por parte do tecido, a CPI-17 parece ser difusamente distribuídos ao longo do SMC (Fig. 5- PSS, Fig. S1). A estimulação dos tecidos com 1 uM CCh (30 ') (mas não 1 uM CCh para 3', dados não mostrados) ou 1 uM PDBu (30 ') resulta em uma mudança significativa nesta distribuição de tal modo que o CPI-17 aparece agora ser principalmente na periferia da célula em uma distribuição semelhante à observada para PKCα (Fig. 5, Fig. S2). A razão da distribuição do CPI-17 perto da membrana plasmática em relação ao total de CPI-17 (+ citosólico periférico) foi utilizado para quantificar possíveis alterações na distribuição da proteína sob estas condições diferentes. A Figura 4 mostra os resultados como a relação de periférica em relação ao total de CPI-17. O rácio de CPI-17 (periférico /total) variou de 0,49-0,67 em todos os tecidos examinados e condições. A proporção de CPI-17 periférica /Total em condições relaxadas não é significativamente diferente do que 0,5 (significa 0,49-0,5; P > 0,19) indicando que o CPI-17 é difusamente distribuído por todas as células do músculo liso sob esta condição. Isto não se alterou após a 3 'de 1 uM CCh estimulação como ainda não existe uma diferença significativa a partir das condições de relaxamento (significa = 0,53-0,55; P > 0,05) com a excepção de os tecidos de fundo de olho, onde a relação periférica /total de CPI-17 é significativamente maior (p < 0,05) em 3 '(Fig. 4). Com 30 'de qualquer um uM CCh ou uma estimulação uM PDBu, a distribuição de CPI-17 torna-se significativamente maior do que 0,5 para todos os tecidos e camadas (meio = 0.62-0.67, P < 0,01), indicando que o CPI-17 é agora localizado principalmente na periferia células (que já não é "uniforme" distribuído por toda a célula), semelhante à distribuição de PKCα (Fig. 4).

a distribuição principalmente periférica de PKCα (em ambas as condições relaxadas e estimuladas) e CPI-17 (após 30 'estimulação com CCh ou PDBu) não é uniforme na periferia das células, mas ponteada na distribuição (Fig. 6). Há também uma distribuição pontuada dos anatomicamente e funcionalmente distintos junções aderentes e cavéolas na membrana plasmática SMC [26]. A fim de determinar se a distribuição do PKCα e IPC-17 na membrana corresponde ao padrão salpicado de pontos de junções aderentes, fizemos marcação dupla com duas adherens junção associada proteínas, vinculina e talina. O padrão alternativo de distribuição dos fluoróforos vermelhos e verdes com as membranas mostram que a PKCα e IPC-17 não co-localizar tanto com vinculina ou talina (Fig. 6), sugerindo que a PKCα e IPC-17 não associar o complexo adherens junção nas condições que examinamos. Porque alternativo cavéolas com as junções aderentes na membrana periférica [26], PKCα e CPI-17 pode co-localizar com o cavéolas. Para determinar se a distribuição punctata do PKCα e CPI-17 na membrana corresponde com o padrão pontuada das cavéolas, nós também fez dupla rotulagem dos PKCα com caveolin. A distribuição de PKCα e caveolin co-localizar-se a membrana em condições tanto relaxado e activadas como se pode observar pelo aparecimento de fluorescência amarelo /cor de laranja em vez de fluorescência vermelha e verde distinta (Fig. 6). A F-teste bilateral de igualdade de dois desvios padrões (SDS) determinado um SD significativamente inferior na proporção de caveolin para PKCα quando comparado com o DP da proporção de vinculina para PKCα (n = 20 células; p < 0,05) . Além disso, a dupla marcação de PKCα com CPI-17 a seguir à activação do tecido também mostra a co-localização significativa (n = 20 células; p < 0,05) destas duas proteínas perto da membrana do plasma (fig. 7). Estes dados mostram que PKCα está localizada principalmente perto da caveloi na membrana plasmática SMC em todos os momentos, e que a seguir à activação do tecido, uma parte significativa do citosólica CPI-17 transloca-se para o cavéolas no plasma em que se co-localiza com PKCα.

Discussão

tecidos musculares lisas são rotineiramente caracterizada como sendo ou "tónico" (gerando uma contração isométrica mantido lento) ou "fásica" (gerando uma rápida contração isométrica transitória). geração de força e /ou encurtamento de tecidos em SM Acredita-se que exigem elevados fosforilação da cadeia leve da miosina, o consumo de ATP e ciclismo ponte cruz. Um possível mecanismo responsável por esses dois tipos de contrações é diferencial Ca ^{2 + sensibilização. Ca 2+ sensibilização no músculo liso é acreditado em grande parte, ser devido à inibição da MLCP simultânea com ou subsequente à activação do MLCK durante a activação do tecido [15], [35]. Uma das principais vias propostas para serem envolvidos em Ca 2+ sensibilização é através de receptores acoplados à proteína G (GPCR) /fosfolipase C (PLC) /diacilglicerol (DAG) /PKC /IPC-17 para inibir a MLCP. GPCR de, PLC, e DAG estão todos localizados no /na membrana plasmática. A localização do MLCP é menos certa, mas em algum ponto no tempo após a activação MLCP tecido tem de ser associada com o MLC _{20 na molécula de miosina de os filamentos grossos, a fim de desfosforilar esta proteína. Porque filamentos grossos têm sido relatados para ser distribuída por todo o citoplasma SMC [36], [37], [38], [39], o MLCP também terá de ser distribuído por todo o citoplasma, em algum momento durante o relaxamento [40]. Se MLCP está localizado no interior do citosol e perto MLC 20 durante a contracção, e PKCα e IPC-17 desempenham um papel na inibição MLCP durante a contracção, em seguida, pelo menos, CPI-17 seria de esperar que ser localizada dentro do citosol em algum momento durante a contração. Os resultados deste estudo mostram que PKCα é preferencialmente localizada perto da membrana plasmática durante condições relaxado e ativados e que CPI-17 também é preferencialmente localizada perto da membrana plasmática durante condições ativada. Assim, estes dados sugerem que as diferenças na PKCα- CPI-17 Ca 2 + via de sensibilização não pode explicar tônico e contrações SM fásicas em fundo do estômago e antro e mais trabalho é necessário para determinar como a distribuição espaço-temporal da CPI- 17 com a ativação do tecido pode regular MLCP para causar Ca 2 + sensibilização da contração SM em tecidos SM intactas.}}

Enquanto PDBu provoca uma contração lenta no fundo do olho que é ~ 40% do KPSS induzida pico de força , pequena contracção é gerado no antro com estimulação PDBu. Desde fundo e antro representam dois tipos básicos de músculo liso, tônico e fásico respectivamente, parece lógico atribuir a diferença na geração de força para as propriedades distintas de fásicas e muscular tônica. Woodsome et al [41] relataram que o nível de expressão de CPI-17 em SM tónico vascular é maior do que em SM vascular fásica. Isso poderia explicar a diferente capacidade dos músculos tónico para manter a força (a alta concentração de CPI-17 inibe MLCP permitindo MLC _{20 fosforilação para ficar alta e força a ser mantidos em SM tónico). Este estudo analisou a expressão da proteína PKCα e CPI-17 e de distribuição no estômago suína visceral. Para nossa surpresa, não foi detectada nenhuma diferença significativa no nível de PKCα ou CPI-17 expressão da proteína entre o fundo e antro (Fig. 2).}

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