PLOS NËMMEN: Noutebild an Phasic lafe Muskel Kontraktioun Ass nët reglementéiert vun der PKCα - CPI-17 Passerelle an dontknow Mo. Antrum an Fundus

Wat VerfÜgung

Reglement vun myosin Liicht Kette phosphatase (MLCP) via FAQ kinase C (PKC) an der 17. kDa PKC-potentiated inhibitor vun myosin Liicht Kette phosphatase (CPI-17) huet als eng Ca gemellt ginn 2+ drëm sécher Passerelle an glat Fleesch (SM), an dofir vläicht an Tonic vs. phasic contractions Équipe ginn. Dës Etude iwwerpréift d'FAQ Ausdrock a raimlech-séchert Verdeelung vun PKCα an CPI-17 zu intakt SM Stoffer. KCl oder carbachol (CCH) Stimulatioun vun Tonic Mo. fundus SM generéiert eng nohalteg Kontraktioun während der phasic Mo. antrum eng flüchteg Kontraktioun generéiert. Zousätzlech, generéiert der Tonic fundus grouss famill force wéi phasic antrum mat 1 μM bor 12, 13-dibutyrate (PDBu) Stimulatioun déi de PKCα ze aktivéieren gemellt ass - CPI-17 Passerelle. Western blot Analysë bewisen, dass dësen contractile Differenz net vun engem Ënnerscheed an d'FAQ Ausdrock vun PKCα oder CPI-17 tëscht deenen zwee Stoffer ëmmer war. Immunohistochemical Resultater weisen, dass d'Verdeelung vun PKCα an der longitudinal an kreesfërmeg Schichten vun der fundus an antrum net ënnerscheeden, virun allem bei de SM Zell Plasma Membran en der Wiesen. Stimulatioun entweder Otemschwieregkeeten mat 1 μM PDBu oder 1 μM CCH net ofzeänneren dëser Randerscheinung PKCα Verdeelung. Et gi keng Ënnerscheeder tëscht deenen zwee Stoffer fir den CPI-17 Distributioun, mä am Géigesaz zu der PKCα Distributioun, CPI-17 schéngt diffusely uechter d'Zytoplasma ënner relax Otemschwieregkeeten Konditiounen verdeelt gin mee Unzéiungskraaft fir eng primär Randerscheinung Distributioun bei de Plasma Membran mat Stimulatioun Stoffer mat 1 μM PDBu oder 1 μM CCH. Resultater vun double Etikette weisen, datt weder PKCα nach CPI-17 op der adherens Potaschbierg (vinculin /talin) an der Membran Co-localize mä si do mat denen aneren a mat caveoli (caveolin) an der Membran Co-localize. Dëst opgepasst Ënnerscheed hindeit, datt d'PKCα - CPI-17 Passerelle net responsabel fir d'Tonic vs. phasic contractions am Mo. fundus an antrum observéiert ass VerfÜgung

Fro: Zhang Y, Hermanson ME, Eddinger TJ (2013) Noutebild. an Phasic lafe Muskel Kontraktioun Ass nët reglementéiert vun der PKCα - CPI-17 Passerelle an dontknow Mo. Antrum an Fundus. PLoS NËMMEN 8 (9): e74608. Doi: 10.1371 /journal.pone.0074608 VerfÜgung

Redakter: Wenhui Hu, Temple University School of Medezin, Vereenegt Staate vun Amerika VerfÜgung

Arnaque: 13. Mäerz 2013; Akzeptéiert: 4 August, 2013; Publizéiert: 18. September 2013 VerfÜgung

Copyright: © 2013 Zhang et al. Dëst ass eng oppen-Zougang Artikel ënnert de Bedingunge vun der Lizenz BY Creative Commons verdeelt, déi bereet benotzen Genehmegungen, Distributioun, an Reproduktioun vun all mëttelgrouss, gëtt d'Original Auteur an d'Quell Kaiser sinn VerfÜgung

Funding:. Dës Aarbecht gouf vun der National Science Foundation (NSF), biologesch Sciences Pompjeeën an CSL School, Marquette University ënnerstëtzt. D'funders hu keng Roll am Etude Design, Daten Kollektioun an Analyse, Décisioun, oder Virbereedung vun der mëttelalterlech Handschrëft ze publizéieren VerfÜgung

Wettsträit Interessen:.. D'Auteuren hunn deklaréiert, datt keng Competitioun Interessen existéieren VerfÜgung

Aféierung VerfÜgung

D'Mechanismus (s) Bestëmmung Tonic (nohalteg) vs. phasic (flüchteg) glat Fleesch (SM) contractions bleift ongeléister. Verschiddenste innervation an libre sécher Molekülle an Nieft eenzegaarteg receptor an FAQ (isoform) Ausdrock an intracellular sécher Weeër komplizéiere de Problem. Net onerwart, do si verschidde proposéiert hypotheses Tonic Kraaft Ënnerhalt vun SM dorënner ze erklären: slowly- oder Net-Vëlos glat Muskel myosin Kräiz-Brécke genannt latch Brécke [1], [2], [3], [4]; Recrutement vun Net-Fleesch myosin II [5], [6], [7]; Opstellung vun caldesmon oder calponin ofhängeg actin-ze-myosin Kräiz-Linken [8], [9]; Opstellung vun cytoskeletal Kraaft-Träger Strukturen [10], [11], [12]; a Regulatioun vun myosin LC _{20 phosphorylation via zweet Messenger Weeër myosin Liicht Kette kinase Auswierkungen (MLCK) an myosin Liicht Kette phosphatase (MLCP) Aktivitéit [13], [14], [15], [16], [17] , [18]. Dat lescht Kategorie ass interessant, well vun der Untersuchungshaft Ënnerscheed Ausdrock, Lokalisatioun a Regulatioun vun dësen zweete Messenger Proteinen zu verschiddenen SM Stoffer. Verännerleche Regulatioun vun MLCK an MLCP Aktivitéit kéint déi net nëmmen e Mëttel fir Ca 2+ drëm, mä och eng méiglech Mechanismus fir Tonic vs. phasic Kontraktioun. Inactivation vun MLCP via de PKCα -CPI-17 Passerelle géif fir haten héich myosin Liicht Kette (MLC 20) phosphorylation an domat eng nohalteg contractile Kraaft erlaben. A Echec MLCP zu inactivate géif MLC 20 phosphorylation a Kraaft, déi zu engem flüchteg Kontraktioun reduzéieren. Mo. fundus SM generéiert e Tonic (nohalteg) Kontraktioun iwwerdeems Mo. antrum SM generéiert e phasic (flüchteg) Kontraktioun an Äntwert zu enger Rei vun stimuli. VerfÜgung}

Ca 2+ drëm, wéi den Aktivéierungscode vu G- implizéiert FAQ-kräftegen zweet Messenger Weeër datt d'contractile Proteinen ze [Ca 2+ _{i] vun MLCP inhibiting, sensitize kënne vun all vu ville Weeër geschéien. Ee vun de Rapport Weeër fir inhibition vun MLCP Aktivitéiten gehéieren d'FAQ kinase C /C-kinase ageschalt PP1 inhibitor FAQ vun 17 kDa (PKC /CPI-17) Passerelle [19], [20]. G-kräftegen FAQ receptor (GCPR) Aktivéierung an Aktivéierung vun phospholipase C (GmbH) doraus, hydrolyzes phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (Pip 2) inositol 1,4,5-trisphosphate (IP 3) ze produzéieren an diacylglycerol (Dag). Dag ass bekannt PKC ze aktivéieren déi phosphorylation vun CPI-17 verursaache kënnen ze selektiv MLCP (iwwer- fir visceral SM zu [17]) inhibit. PKC ass gegleeft duerch seng Aktivéierung a raimlech Verdeelung an der Zell regulariséiert ginn, dee gëtt kontrolléiert vum Proteinen verankert dass kruet bis an d'Lag vun PKC ze bestëmmter Regioun vun der Zell [21] beschränken, [22]. Zum Beispill, Rapporten vun constitutively aktiv L-Typ Ca 2+ Chaînen an hir Regulatioun vun PKC [23], [24] hindeit datt PKC bei der Membran an glat Muskel Zellen en der ass. D'bewosst Funktioun vun CPI-17 an d'Zell hätt op sengem Niveau vun FAQ Ausdrock variéieren jee an ob et an der Géigend vun de Plasma Membran ass wou PKCα läit /ausgeléist, oder mat der contractile myosin décke Filamenter verbonne wou MLCP etabléiert wier fir de -phosphorylate myosin Liicht Kette 20 (MLC 20). VerfÜgung}

Den Ausdrock vun PKCα an CPI-17 an hir raimlech-séchert du-Verdeelung op Otemschwieregkeeten Aktivéierung hunn zu Ca proposéiert ginn 2+ drëm vun glat Muskel Stoffer (fir review [14], [15], [16], [17]). Esou ass et méiglech, datt Differenzen an hiren Ausdrock an bewosst Lokalisatioun /br konnt vs. phasic contractile Äntwerte vun Bestëmmung Tonic Équipe ginn. Fir dës zwou Proteinen am inhibiting MLCP Aktivitéit während Otemschwieregkeeten Aktivéierung, an domat eng Tonic oder phasic Äntwert dauernd Équipe Deel vun enger Passerelle ze ginn, brauchen si um passenden Niveau an hir op déi richteg Plaz an der Zell am richtege Moment ausgedréckt gin. Well PKC vum Dag (eng Membran gebonnen phospholipid) ageschalt ass, et muss och op d'mannst temporally um Membran ginn fir dat ze geschéien. A wann CPI-17 fiert de MLCP aus dephosphorylating MLC _{20 op der décke Filamenter, CPI-17 iergendwann zu inhibit Besoinen am Zytosol mat den décke Filamenter presentéieren do verbonne ginn. Mat dësen zwee Schrëtt an zwee spatially verschidde Regioune vun der Zell geschitt, een oder zwee vun dësen Proteinen huet zu der aner Regioun ze translocate fir hinnen d'Passerelle zesummekomm a komplett. VerfÜgung}

Den Zweck vun dëser Etude war bis Test der Hypothes, datt déi PKCα - CPI-17 Ca 2+ drëm Passerelle an Bestëmmung Tonic (nohalteg) an phasic (flüchteg) contractile Äntwerte vun glat Muskelen Équipe ass. Fir dat do alles mir d'FAQ Ausdrock a raimlech-séchert Verdeelung vun PKCα an CPI-17 an d'phasic Mo. antrum an Tonic Mo. fundus ënner relax a ageschalt Konditiounen. D'Resultater kee groussen Ënnerscheed zu Ausdrock vun entweder vun dësen zwou Proteinen weist, nach zu hire Randerscheinung Verdeelung tëschent deenen zwee Stoffer sinn onkompatibel mam Hypothes, datt déi PKCα- CPI-17 Ca 2+ drëm Passerelle ass den entscheedende Faktor fir d' Tonic vs. an dëse Stoffer observéiert Äntwerte phasic contractile. VerfÜgung

zu menge

Uergel an Ray mat VerfÜgung

dontknow Stoffer (Mamm) sech aus Hansen Fleesch Service (Franksville, allem) kritt an no an kal gestallt Salz Léisung (PSS; (am mm): 140,1 NaCl, 4,7 KCl, 1,2 Na _{2HPO 4, 2.0 MOPS (pH 7,4), 0,02 Na 2EDTA, 1,2 MgSO 4, 1,6 CaCl 2, an 5,6 Zocker). Mamm sech vu Blutt, lockere connective Otemschwieregkeeten gebotzt, an an e puer Fäll, déi mucosa, an gefruer direkt oder zu PSS an de Frigo fir 0-2 Deeg gespäichert. Verschidde Organer sech frësch gefruer sou séier wéi méiglech folgende Post-Eenzegartegkeet vum Fall bestätegt (60-90 Minutten). Verschidde Organer sech zu PSS an /oder stimuléiert mat 1.0 μM CCH oder PDBu (Fläch) bei 37 ° C fir verschidden Zäit Punkten virum dagsiwwer incubated. Verännerleche incubation Mol an agonist Konzentratioune goufen och getest. Fir immunohistochemistry war all Otemschwieregkeeten gefruer gespäichert bis sectioned an immunoreacted. Dagsiwwer an all Fäll Équipe Placement Stécker vun Stoffer oder Otemschwieregkeeten Strips vun isopentane gi si vun flëssegem Stéckstoff vum Stockage bei -80 ° C gefollegt. Fënnef bis sechs μm Rubriken vun der gefruer Stoffer op eng Leica CM1900 cryostat geschnidde goufen, ofgeholl op Glas drënner an gespäichert gefruer (0-1 Deeg) bis immunoreacted. VerfÜgung}

Immunoreactions an Reagents VerfÜgung

D' antibodies gebraucht goufen aus de folgende Quelle kritt: PKCα (H-7 an C-20) an CPI-17 (H-60) aus Santa Cruz Biotech, Santa Cruz CA; Vinculin an Talin aus Fläch, Saint Louis, Missouri; Caveolin 1 aus BD Biosciences, San Jose, CA; Cy2 an Cy3 Iesel anti Maus oder Kanéngchen Secondaire d'vun Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA; Alexa Fluor 594-phalloidin an DAPI aus cuisine Ämter, Eugene, OR. All dës antibodies hu virdrun an eiser Labo fir immunohistochemistry a westlech blotting gi wou se Spezifizitéit fir eng Band vun der korrekt molekulare Gewiicht fir déi jeeweileg FAQ uginn [25], [26], [27] weisen benotzt. Negativ kontrolléiert, wou de primären antibody ass show fir dës Gruppen a kee immunofluorescence op Otemschwieregkeeten Rubriken kee ofbaubar net abegraff. VerfÜgung

mëchs Otemschwieregkeeten Rubriken ofgeholl op Glas drënner an sech bei Raumtemperatur thawed an dann mat 2% paraformaldehyde fir 10 fix Minutt, permeabilized vun 0,5% Triton X-100 fir 10 Minutten an virbildlech mat 5 mg /ml BSA fir 1 Stonn virum Iwwernuechtung (4 ° C) an dann de passenden Secondaire antibody fir eng Stonn bei Raumtemperatur mat der Primärschoul antibody zu reagéiert. No der Première antibody, goufen d'Stoffer mat DAPI (0,5 μM), phalloidin (10-50 nm) oder DAPI /phalloidin wéi ubruecht staining Kären an /oder filamentous actin incubated. Multiple Mëtten goufen folgend der Primärschoul an de Lycée incubations benotzt ginn, an den counterstaining. Cover Brëll sech schéi gefiermt mat 75% glycerol mat 0,2% n-et muss een gallate staark ze minimiséieren. , 1% tween-: All immunoreacting Léisungen sech zu PBS-Tween [(NaCl 8.0, KH _{2PO 4 0,2, Na 2HPO 4 1.15, KCl 0,2, an g /Liter) gemaach 20, pH 7.4] mat 0,1% BSA. Negativ Kontrollen agebaut 0,1% BSA ouni d'Primärschoul antibody, an huet kee immunoreaction. VerfÜgung}

Microscopy VerfÜgung

Am Moment huet mat enger Olympus IX70 microscope mat epifluorescence Wiederwelt observéiert. Digital Biller waren geholl mat enger 16 bëssen Princeton Instrumenter (Princeton, NJ) CCD Kamera, kontrolléiert duerch e Quelltext Verwaltungsrot via IPLab fir Windows op engem PC (Haaptbanalitéite 3.6, Scanalytics;. Well, VA). Biller waren benotzt entweder eng 100 × (1,3 NA) oder 60 × (1.25 NA) Ueleg Lënsen- oder eng op den PC × (0,9 NA) Loft Lëns an gespäichert 40 geholl. Emissioun Filter benotzt goufen 405, 490 an 570 nm. Sektiounen goufen och eng Nikon confocal microscope (Nikon A1 confocal Sonnendäischtert Ti) gekuckten benotzt. D'Ziler benotzt goufen 100 × (1,4 NA) Ueleg Lëns bei 425, 488 an 561 nm. Ähnlech Resultater goufen am immunofluorescence distributions mat dësen zwou verschidden Systemer observéiert. VerfÜgung

Image Analys vun Distribution vun PKC /CPI-17 vun Individuell BTS an Stoffer VerfÜgung

Profiler vun fluorescence Intensitéit huet fir eenzel Zellen geholl an Queeschformat Otemschwieregkeeten Sektiounen. Sektiounen sech um niddereg Vergréisserung (10-20x) observéiert Beräicher vun visuell artifacts ze vermeiden (Otemschwieregkeeten folding, KHTML Schued, etc). An en äerdzougedréiter Säit gratis gekësst huet d'Vergréisserung zu 40-100x fräi, a Biller sech op dës héich vergréissert geholl. Dräi verschidde Beräicher bannent ee Otemschwieregkeeten Rubrik sech dëse Match gaangen Fotoen ze huelen. Z-opruffen Serie sech individuell fir all eenzel vun den dräi Faarwen Riewe benotzt geholl. 1 μm décke Z Rubriken sech geholl, an 15-25 Z Rubriken huet fir all Otemschwieregkeeten Sektioun (Zuelen S1 & S2 weisen Z-opruffen Beispiller vun CPI-17 immunoreactivity zu antrum mat an ouni Otemschwieregkeeten Aktivéierung) geholl. All Z opruffen Serie war fir all Kapitel iwwerpréift Zentrum z Bild ze identifizéieren, an dësem Bild ass herrlech ze a.bmp Datei, déi zu Nis-Elements ar 3.0 (Nikon) op engem PC importéiert war d'Daten ze analyséieren. VerfÜgung

Profiler vun PKCα an Phalloidin fluorescence Intensitéit huet fir eenzel Zellen am Queeschformat Otemschwieregkeeten Rubriken kritt. Eng Linn war an der Mëtt vum Bild Beräich zréckgräifen. Ten vun der Linn duerchge- Zellen sech fir Miessunge ausgewielt. Baséierend op eiser leschter Ëmwelt- [25], déi éischt fënnef Pixel (~0.7 μm) op all Säit gouf vun der Zell wou de phalloidin Intensitéit staark aus baseline eropzesetzen wéi d'Peripherie vun der Zell definéiert. Fir cytosolic Miessunge, war eng Linn op d'mannst 2 μm ewech vun der Zell Peripherie geluecht. Intensitéit Miessungen huet mat enger Regioun vun interesséieren (ROI) ongeféier am Zentrum vun der Zell (fir cytosolic Miessunge) feieren, oder laanscht der Membran senger Zell (fir Randerscheinung Miessunge). Fir Konstanz, ass d'Gréisst vun der ROI konstant Réckstand fir d'Randerscheinung an cytosolic Miessungen. Zellen an der Rubrik mat ganz klengen Duerchmiesser oder mat Käre präsent (siichtbar DAPI staining wou raimlech Aschränkungen an perinuclear organelles konnt d'Verdeelung verwiesselt) (net konnt cytosolic ROI mannst 2 μm aus der Peripherie ze moossen) sech aus Analyse ausgeschloss. Fir PKCα, d'Verhältnis vun der Moyenne Intensitéit vun PKCα op der Peripherie iwwer de ganzen PKCα Intensitéit (Zomm vun PKCα Intensitéit vum ROI op Peripherie an ROI am Zytosol) benotzt gouf. Zéng Zellen pro Terrain an dräi verschidde Beräicher sech fir Daten Analyse fir all Otemschwieregkeeten Regioun ze Miessung ënnerworf, i.e. drësseg Zellen huet gezielt a averaged fir all Prouf (n = 1). D'Finale Prouf Gréisst gouf n = 5.The selwecht Prozeduren sech applizéiert d'Intensitéit vun CPI-17 ze moossen, ausser datt nëmmen een Terrain vun 10 Zellen fir all Prouf gebraucht goufen (n = 1), mat enger definitiver Prouf Gréisst vun n = 3. VerfÜgung

mechanesch Miessunge VerfÜgung

direkt virun benotzen, goufen Otemschwieregkeeten Strips Géigewier an op all Enn clamped, mat de Klameren tëscht erlaabt op eng permanent Metal Staang an eng isometric Kraaft Better gëtt reduzéiert (Harvard Staatsapparat geséchert, Holliston, MA), an PSS bubbled mat 95% O _{2/5% CO 2 am Waasser-jacketed Muskel CHAMBERS (Radnoti Glass Technology, Monrovia, CA) bei 37 ° C. D'Längt vun all Sträif war vun Repositionéierung de permanente Metal Staang variéiert. VerfÜgung}

lafe Muskel Otemschwieregkeeten Strips (Mo antrum an fundus) waren fir 1 h equilibrated an dozweschent un engem passiv Spannungen approximating Lo eng Gewerkschaftsbond Längt-Spannungen Kéier benotzt . Fir Kontrakt Stoffer, war PSS mat K ersat + - PSS (109 mm KCl ass wuel ISO-osmotically fir NaCl) [28]. D'Fleesch Strips Gette mat Belounung vun der Otemschwieregkeeten tëscht all Aktivéierung ausgeléist, bis kee Héichpunkt Kraaft méi eng bedeitend méi wéi virdrun Kontraktioun gewisen. CHAMBERS waren dräi mol mat PSS folgend eenzel Otemschwieregkeeten Aktivéierung Ofwaasser. Op d'mannst zwee repeatable successive K + - PSS contractions sech benotzt e Liewesniveau Kraaft Spuer mat engem 10 Minutt Rescht virum Start vum Experiment tëscht all Kontraktioun ze kréien. Stoffer sech dann mat 1 μM carbachol an entspaant erëm ausgeléist, wéi während K + Leeschtung war - PSS contractions. Kierzunge contractions inclus all 1 μM phentolamine an propranolol ze blockéieren α- an β - adrenergic kenne, bzw.. No der definitiver 1 μM CCH Kontraktioun an wäschen, sech Stoffer mat 1 μM PDBu ageschalt fir hir mechanesch Äntwert Rekord. VerfÜgung

Analys vun Force Data VerfÜgung

Volt Signaler aus Kraaft transducers sech duerch PowerLab Radio 400 oder 4 SP Hardware (ADInstruments, Castle Hill, Australien) op engem Computerbildschierm (Charts v3.6 oder 4.0, ADInstruments) visualized als force (g) um 10 Hz an duerch Software Kommando zu engem Festplack fir spéider Analysë gespäichert. Zuele goufen mat der spreadsheet Programm Excel 2000 (Microsoft, Redmond, jeeweils) gemaach. VerfÜgung

gelies Electrophoresis a Western Blotting VerfÜgung

Protein Ausdrock analyséiert gouf wéi virdru beschriwwen [29]. Stoffer goufen um 50 mg /ml vun 0,125 M Tris, 2% Natrium dodecylsulfate (virstellen /vol), 20% glycerol, 0,1% bromophenol blo (virstellen /vol) an 20 mm dithiothreitol homogenized. Proteinen sech eréischt op niddereg Kräiz-Joreswiessel Natrium dodecylsulfate gels [30] an immunoblotting Leeschtung war wéi virdru beschriwwen [31]. D'PKCα antibody entweder engem eenzege Band oder méi oft eng achromateschem um ~76 Beien zB stéiert dat unerkannt während der CPI-17 antibody engem eenzege Band um ~17 Beien zB stéiert dat unerkannt. Dës Diameter konsequent mat der erwaart Gréisst fir dësen Proteinen baséiert op gelies Mobilitéit. Fir Richtegkeet vun der westlecher blots garantéieren, waren Luede Kéiren fir béid Mo. fundus an antrum Echantillon iwwer e 5-fantastesch Gamme vun loadings (4-20 μl) fir actin (coomassie blo staining) an PKCα an CPI-17 (westlech blotting) gemaach . D'Resultater weisen eng linear Relatioun iwwer dëse Beräich fir all dräi Proteinen aus zwee Stoffer (R 2 > 0,98 fir all Resultater, n = 3). Quantitation vun PKCα an CPI-17 FAQ Ausdrock war op westlech blots gemaach 5-10 μl loadings benotzt datt bannent dëser linear Rei war (n = 6). VerfÜgung

Statistics VerfÜgung

statistique Vergläicher sech eraus gedroen Hëllef MINITAB (Minitab Galaxy Staat College, PA). A een Prouf T-Test gouf benotzt d'Verdeelung vun PKCα /CPI-17 bis Test (eng Randerscheinung zu total ROI Inhalt vun 0,5 beweist eng "Uniform" Verdeelung vun glat Muskel Zellen (SMCs)) an antrum an fundus ënner Rou Zoustand. Een Wee ANOVA war standing fir PKC /CPI-17 Verdeelung Ennerscheeder fir déi zwee Stoffer mat verschiddene Spannend Parameteren ze testen. Zwee Prouf T-Tester goufen benotzt d'Bedeitung vun Ënnerscheed fir Ausdrock Niveau vun PKCα oder CPI-17 zu antrum an fundus ze testen. A zwee-tailed F-Test fir Gläichheet vun zwee Standard Hitparad (SDs) sech un PKCα e wesentlech méi Fils am Verhältnis vun caveolin wéini de Fils vum Verhältnis vu vinculin zu PKCα Verglach. A Wäert vu P &Si besteet; 0,05 war fir all Statistik Tester däitlech considéréiert. Nee statistesch Tester goufen op de force Donnéeë gemaach a Gestalt 1 ass Vertrieder vun ähnlechen Daten aus 6 verschidden Déieren. Western blot Donnéeën ass aus sechs Déieren. PKCα Verdeelung Donnéeën ass eng Moyenne vun drësseg Zellen gemooss pro Déier a fënnef Déiere getest goufen. CPI-17 Verdeelung Donnéeën ass eng Moyenne vun 10 Zellen gemooss pro Déier an dräi Déieren getest goufen. Protein Co-Lokalisatiouns Donnéeë baséiert op engem 'n' vun op d'mannst 20 Zellen aus op d'mannst 3 Déieren. VerfÜgung

Resultater VerfÜgung

dontknow Mo. fundus ass eng primär Tonic glat Muskel Otemschwieregkeeten datt zu Stimulatioun reagéiert mat enger nohalteger Kontraktioun iwwerdeems ass d'antrum engem allem phasic glat Muskel Otemschwieregkeeten dat mat engem flüchteg Kontraktioun (Figebam. 1) zu Stimulatioun reagéiert. An Stoffer sinn dës Äntwerte wahrscheinlech e Resultat vun enger direkter Stimulatioun vun den doucen Muskel als Zousätzlech vun 1 μM propranolol (β agonist Blocker) an phentolamine (α agonist Blocker) war benotzt Aktivatioun vun adrenergic kenne wéinst Potential release vun Nereïden neurotransmitters ze verhënneren. Stimulatioun vun glat Muskel mat PDBu ass Zäitche ze féieren glat Muskel Kontraktioun via PKC Aktivéierung [32], [33], [34] benotzt. One μM PDBU bewierkt eng kleng luesen Kontraktioun am Mo. fundus Strips (~40% vun K + Stimulatioun Äntwert) während de antrum weist am Fong keng Äntwert (&Si besteet; 5% K + Stimulatioun) (Lalumi 1.). Den Ënnerscheed tëscht der nohalteg a flüchteg Äntwerte vun dësen zwee Stoffer zu KPSS an CCH, a Presenz oder Feele vun enger contractile Äntwert ze PDBu Stimulatioun wéinst dem Ausdrock kéint an /oder raimlech-séchert Verdeelung vun der afgerappt zweet Vermëttler (PKCα an CPI-17), déi fir MLCP inhibition mat PDBu Stimulatioun responsabel gin sin purported. Ënnersicht dat gemoos mir den Ausdrock Niveauen a sech d'raimlech-séchert Verdeelung vun PKCα an CPI-17 vun dëse Stoffer. VerfÜgung

Dorënner 2 weist westlech blot Resultater fir den Ausdrock vun CPI-17 an PKCα am Mo. antrum an fundus. Stoffer goufen Kontrollen fir FAQ Konzentratioun Filteren, an d'Resultater sech baséiert op d'Intensitéit vun der jeweileger FAQ Signal berechent, an normalized zu actin FAQ Ausdrock (Figebam. 2). Béid Methoden (nëmmen normalized Donnéeë gewisen) uginn, dass weder de Wëllen vun CPI-17 FAQ nach déi vun PKCα FAQ vill anescht ass (p > 0,23 & p > 0,28 respektiv, n = 6) wann dës zwee SM Stoffer vergläichen. Kontrollen waren gemaach enger Rei vun loadings mat der Gamme vun linearity vun Luede ze bestätegen, an dat fir quantitation benotzt Echantillon bannent dësem Beräich sech (Donnéeën net gewisen, gesinn Methoden). Well do keng Ennerscheeder an den Ausdrock fir dës zwee Proteinen tëscht deenen zwee Stoffer sinn, mir dunn nächst festzestellen, wann Differenzen an hir raimlech-séchert Verdeelung kéint d'Differenz vun hirer Äntwerte PDBu Stimulatioun erklären. VerfÜgung

Dorënner 3 weisen immuohistochemical Resultater fir d'Verdeelung vun PKCα an der longitudinal an kreesfërmeg Schichten vun der fundus an antrum. Ënner Rou Konditiounen zu Léisung rouegen wann et keng Kraaft Generatioun vun der Otemschwieregkeeten ass, schéngt de PKCα eendeiteg zéien bei der Peripherie vun der SMCs (Figebam. 3- grénger Faarf, PSS) gin verdeelt. Stimulatioun vun Stoffer mat 1 μM CCH (3) oder 1 μM PDBu (10. a 30. ') ofzeänneren net dat Randerscheinung Verdeelung vun PKCα. D'Verhältnis vun der Verdeelung vun der PKCα bei de Plasma Membran famill ze total bewosst PKCα benotzt war ënner dëse verschiddene Konditiounen méiglech Ännerungen an der Verdeelung vun dëser FAQ fir ofgedonkelt. Figur 4 weist d'Resultater wéi d'Verhältnis vun de PKCα op der Zell Peripherie relativ zu de ganzen PKCα präsent an der Zell (Randerscheinung /(Randerscheinung + Zytosol), gesinn Methoden). A Verhältnis vun 0,5 wär eng "Uniform" Verdeelung vun de FAQ uechter d'Zell unzeginn. D'PKCα Verhältnis (Randerscheinung /total) gounge vun 0.64-0.68 an all d'Konditiounen iwwerpréift. Dës Wäerter sinn vill méi grouss wéi 0,5 (p &Si besteet; 0,05), wat beweist, datt PKCα allem bei der Zell Peripherie wellkomm ass (et ass net "uniform" an der Zell verdeelt) an datt dës Verdeelung net tëscht d'relax oder stimuléiert Konditiounen änneren <. br>

Well PKCα proposéiert ass CPI-17 ze aktivéieren, dunn hu mir d'raimlech-séchert Verdeelung vun CPI-17 vun dëse Stoffer ënner ähnleche Konditiounen ze bestëmmen. Figur 5 weisen immuohistochemical Resultater fir d'Verdeelung vun CPI-17 an d'longitudinal an kreesfërmeg Schichten vun der fundus an antrum. Ënnert de Konditiounen an entspaanter Léisung Rou wann et keng Kraaft Generatioun vun der Otemschwieregkeeten ass, schéngt de CPI-17 diffusely uechter d'SMCs (Figebam. 5- PSS, Figebam. S1) verdeelt gin. Stimulatioun vun Stoffer mat 1 μM CCH (30. ') (mee net 1 μM CCH fir 3', Donnéeën net gewisen) oder 1 μM PDBu (30. ') Resultater an engem groussen Changement vun dëser Verdeelung esou datt de CPI-17 elo schéngt virun allem an der Peripherie vun der Zell gläicht, datt fir PKCα (Figebam. 5, Figebam. S2) observéiert zu enger Verdeelung gin. D'Verhältnis vun der Verdeelung vun den CPI-17 bei de Plasma Membran famill ze total CPI-17 (Randerscheinung + cytosolic) gouf benotzt fir méiglech Ännerungen an der Verdeelung vun dëser FAQ ënnert dëse verschiddene Konditiounen ofgedonkelt. Figur 4 weist d'Resultater wéi d'Verhältnis vun Randerscheinung-ze-total CPI-17. D'CPI-17 Verhältnis (Randerscheinung /total) gounge vun 0.49-0.67 zu all Stoffer an iwwerpréift Konditiounen. D'Verhältnis vun CPI-17 Randerscheinung /total an entspaant Konditiounen ass net vill anescht wéi 0,5 (heescht 0.49-0.5; P > 0.19) soen dass déi CPI-17 diffusely uechter d'Fonctionnéieren Muskel Zellen ënnert dëser Bedingung verdeelt ass. Dat heescht änneren net folgenden 3 'vun 1 μM CCH Stimulatioun wéi et ass nach kee groussen Ënnerscheed aus der relax Konditiounen (heescht = 0.53-0.55; P > 0,05) mat der Ausnam vun der fundus Stoffer wou den CPI-17 Randerscheinung /total Verhältnis ass vill méi grouss (p &Si besteet; 0,05) op 3 "(Lalumi 4.). No 30 'vun entweder 1 μM CCH oder 1 μM PDBu Stimulatioun, gëtt den CPI-17 Verdeelung bedeitend méi grouss wéi 0,5 fir all Stoffer an Schichten (heescht = 0.62-0.67, P &Si besteet; 0.01), wat beweist, datt CPI-17 elo virun allem ass op der Zellen Peripherie (et ass net méi "uniform" uechter d'Zell verdeelt), ähnlech zu der Verdeelung vun PKCα (Figebam. 4). VerfÜgung

d'Haaptsaach Randerscheinung Verdeelung vun PKCα (ënner souwuel relax a stimuléiert Konditiounen) an CPI-17 (folgende 30 'Stimulatioun mat CCH oder PDBu) ass net eenheetlech op der Zell Peripherie, mä punctate zu Verdeelung (Figebam. 6). Et ass och eng punctate Verdeelung vun de Kierperbau an System z'ënnerscheedde adherens junctions an caveoli um SMC Plasma Membran [26]. Fir ob d'Verdeelung vun den PKCα an CPI-17 op der dënner mat der punctate ze bestëmmen Muster vun adherens junctions entsprécht, hu mir duebel Etikette mat zwee adherens menaarbecht verbonne Proteinen, vinculin an talin. De Stellvertrieder Muster vun der Verdeelung vun de rouden a gréng fluorophores um Schläimhait weisen datt d'PKCα an CPI-17 net Co-localize mat entweder vinculin oder talin (Figebam. 6) suggeréiert, dass d'PKCα an CPI-17 do Associé net mat der adherens menaarbecht komplex ënnert de Konditiounen mir iwwerpréift. Well caveoli Stellvertrieder mat der adherens junctions um Randerscheinung Membran [26], PKCα an CPI-17 kënne mat der caveoli Co-localize. Fir festzestellen, ob de punctate Verdeelung vun de PKCα an CPI-17 op der dënner mat der punctate Muster vun der caveoli entsprécht, mir och duebel Etikette vun PKCα mat caveolin gemaach. D'Verdeelung vun PKCα an caveolin Co-localize um Membran an zwee zeréck ze zeien an ageschalt Konditiounen wéi kann duerch d'Opkommen vun der giel /orange fluorescence anstatt z'ënnerscheedde rout a gréng fluorescence (Figebam. 6) observéiert ginn. A zwee-tailed F-Test fir Gläichheet vun zwee Standard Hitparad (SDs) sech un PKCα e wesentlech méi Fils am Verhältnis vun caveolin wéini de Fils vum Verhältnis vu vinculin zu PKCα Verglach (n = 20 Zellen; p &Si besteet; 0,05) . Zousätzlech, duebel Etikette vun PKCα mat CPI-17 folgenden Aktivatioun vun der Otemschwieregkeeten weist och wichteg Co-Lokalisatiouns (n ​​= 20 Zellen; p &Si besteet; 0,05) vun dësen zwou Proteinen bei de Plasma Membran (Figebam 7.). Dës Donnéeë weisen datt PKCα ass virun allem en der Géigend vun der caveloi um SMC Plasma Membran bei allen Zäiten, an dass dëse Otemschwieregkeeten Aktivéierung, e groussen Deel vun der cytosolic CPI-17 translocates zu der caveoli um Plasma wou et Co-localizes mat PKCα. VerfÜgung

Diskussioun VerfÜgung

lafe Muskel Stoffer sinn als entweder "Tonic" (generéieren engem luesen haten isometric Kontraktioun) oder "phasic" Zäitche charakteriséiert (eng schnell flüchteg isometric Kontraktioun generéieren). Force Generatioun an /oder Otemschwieregkeeten shortening an SM sinn gegleeft ze nik myosin Liicht Kette phosphorylation, ATP Konsum an Kräiz Bréck Vëlos verlaangen. Eng méiglech Mechanismus responsabel fir dës zwou Zorte vun contractions ass Ënnerscheed Ca 2+ drëm. Ca 2+ drëm zu glat Fleesch ass am groussen Deel gegleeft wéinst der inhibition vun MLCP concurrent gin mat oder Kierzunge fir d'Aktivatioun vun MLCK während Otemschwieregkeeten Aktivéierung [15], [35]. Eng vun de groussen Weeër an Ca gin Équipe proposéiert 2+ drëm ass via G-FAQ Koppel kenne (GPCR) /phospholipase C (GmbH) /diacylglycerol (Dag) /PKC /CPI-17 bis MLCP inhibit. GPCR ass, GmbH, an dag sinn all läit um /am Plasma Membran. D'Lag vun der MLCP ass manner sécher, mä iergendwann zu Zäit folgend Otemschwieregkeeten Aktivéierung brauch MLCP mat MLC _{20 op der myosin Protein vun der décke Filamenter an Uerdnung verbonne ginn dës FAQ fir dephosphorylate. Well décke Filamenter hunn gemellt gouf uechter d'SMC Zytoplasma [36], [37], [38], [39] verdeelt gin, brauch der MLCP wäert och iergendwann während Entspanung [40] uechter d'Zytoplasma verdeelt gin. Wann MLCP am Zytosol etabléiert ass an der Géigend MLC 20 während Kontraktioun, an PKCα an CPI-17 eng Roll spillen MLCP während Kontraktioun am inhibiting, dann op d'mannst CPI-17 géif erwaart ginn am Zytosol iergendwann etabléiert ginn während Kontraktioun. D'Resultater vun dëser Etude weisen, datt PKCα zéien bei de Plasma Membran während relax a ageschalt Konditiounen en der ass an datt CPI-17 och bei de Plasma Membran während ageschalt Konditiounen zéien en der ass. Sou, proposéiere dës Donnéeën, déi Differenzen an der PKCα- CPI-17 Ca 2+ drëm Passerelle kann net Tonic an phasic SM contractions am Mo. fundus an antrum a weider Aarbecht erklären ass néideg, fir festzestellen, wéi d'raimlech-séchert Verdeelung vun CPI- 17 mat Otemschwieregkeeten Aktivatioun kann MLCP regléieren Ca ze féieren 2+ drëm vun SM Kontraktioun am intakt SM Stoffer. VerfÜgung}

Iwwerdeems PDBu engem luesen Kontraktioun am fundus Ursaachen déi ~40% vun der KPSS entschlof Héichpunkt Kraaft ass , wéineg Kontraktioun verschwonnen ass an der antrum mat PDBu Stimulatioun entsteet. Zanter fundus an antrum vertrieden zwee Rapporte Zorte vun glat Muskel, Tonic an phasic respektiv, schéngt et logesch den Ënnerscheed zu Kraaft Generatioun zu z'ënnerscheedde Eegeschafte vun phasic an Tonic Muskel ze ascribe. Woodsome et al [41] gemellt, dass d'Ausdrock Niveau vun CPI-17 zu Tonic wiere SM ass méi héich wéi déi vun phasic wiere SM. Dëst hätt der anerer Fähegkeet vun Tonic Muskelen erklären Kraaft ze erhalen (eng héich Konzentratioun vu CPI-17 bremst MLCP MLC Délaie _{20 phosphorylation zu Tonic SM ze ënnerhale héich a Kraaft ze bleiwen). Dës Etude iwwerpréift PKCα an CPI-17 FAQ Ausdrock an Verdeelung vun den visceral dontknow Moo. Fir eis iwwerraschen, kee groussen Ënnerscheed an d'FAQ Ausdrock Niveau vun PKCα oder CPI-17 war tëscht der fundus an antrum fonnt (Figebam. 2).}

• PLOS NËMMEN: Nikotin Attenuates Activatiounscode vum Ray Residentepräiser Macrophages an der Mouse Mo duerch d'β2 Nicotinic Acetylcholine Receptor
• PLOS NËMMEN: Surgical Prefabrizéierten fir kennen mat Krukenberg entholl vun Mo. Origin: Séminairen Konklusiounen an Prognostic fir op Analysis