PLoS ONE: Tonic og fasisk glatmuskelkontraktion er ikke reguleret af PKCa - CPI-17 Pathway i Swine Mave antrum og Fundus

Abstrakt

Regulering af myosin let kæde fosfatase (MLCP) via protein kinase C ( PKC) og 17 kDa PKC-forstærket inhibitor af myosin let kæde phosphatase (CPI-17) er blevet rapporteret som en Ca ^{2+ overfølsomhed signalvejen i glat muskulatur (SM), og kan således være involveret i tonic vs. fasiske sammentrækninger. Denne undersøgelse undersøgte protein-ekspression og rumlig-tidsmæssige fordeling af PKCa og CPI-17 i intakte SM væv. KCI eller carbachol (CCh) stimulering af tonic mave fundus SM genererer en vedvarende kontraktion mens phasic mave antrum genererer en forbigående sammentrækning. Derudover tonic fundus genererer større relativ kraft end fasisk antrum med 1 uM phorbol 12, 13-dibutyrat (PDBu) stimulering, som er rapporteret at aktivere PKCa - CPI-17-vejen. Western blot-analyser viste, at denne kontraktile forskel ikke var forårsaget af en forskel i proteinet ekspression af PKCa eller CPI-17 mellem disse to væv. Immunohistokemiske resultater viser, at fordelingen af ​​PKCa i de langsgående og cirkulære lag af fundus og antrum ikke adskiller sig, idet overvejende lokaliseret nær SM celleplasmamembranen. Stimulering af enten væv med en uM PDBu eller 1 pM CCh ændrer ikke denne perifere PKCa fordeling. Der er ingen forskel mellem disse to væv til CPI-17 distribution, men i modsætning til PKCa distribution, CPI-17 synes at være diffust fordelt i hele cytoplasmaet under afslappede væv betingelser, men skifter til en primært perifer fordeling på plasmamembranen med stimulering af vævene med 1 uM PDBu eller 1 uM CCh. Resultater fra dobbeltmærkning viser, at hverken PKCa eller CPI-17 co-lokalisere på adherens junction (vinculin /Talin) på membranen, men de co-lokalisere med hinanden og med caveoli (caveolin) ved membranen. Denne mangel på forskel tyder på, at PKCa - CPI-17 vej er ikke ansvarlig for tonic vs. fasiske sammentrækninger observeret i maven fundus og antrum}

Henvisning: Zhang Y, Hermanson ME, Eddinger TJ (2013) Tonic. og fasisk glatmuskelkontraktion er ikke reguleret af PKCa - CPI-17 Pathway i Swine mave antrum og Fundus. PLoS ONE 8 (9): e74608. doi: 10,1371 /journal.pone.0074608

Redaktør: Wenhui Hu, Temple University School of Medicine, USA

Modtaget: Marts 13, 2013; Accepteret: 4. august, 2013; Udgivet: 18 september, 2013 |

Copyright: © 2013 Zhang et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af National Science Foundation (NSF), Biologisk Fakultet Institut og Graduate School, Marquette University. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Den mekanisme (r) bestemme tonic (vedvarende) vs. fasiske (forbigående) glatte muskulatur (SM) sammentrækninger stadig uløst. Diverse innervation og cirkulerende signalmolekyler i tillæg til unikke receptor og protein (isoform) udtryk og intracellulære signalveje komplicere sagen. Ikke uventet er der flere foreslåede hypoteser til at forklare tonic kraft vedligeholdelse i SM herunder: slowly- eller ikke-cykle glat muskulatur myosin tværgående broer kaldet låsen broer [1], [2], [3], [4]; rekruttering af ikke-muskel myosin II [5], [6], [7]; dannelse af caldesmon eller calponin afhængige actin-til-myosin cross-links [8], [9]; dannelse af cytoskeletale kraft-bærende konstruktioner [10], [11], [12]; og regulering af myosin LC _{20 fosforylering via second messenger veje påvirker myosin let kæde kinase (MLCK) og myosin let kæde fosfatase (MLCP) aktivitet [13], [14], [15], [16], [17] , [18]. Denne sidste kategori er af interesse på grund af den rapporterede forskellen udtryk, lokalisering og regulering af disse second messenger proteiner i forskellige SM væv. Variabel regulering af MLCK og MLCP aktivitet kunne ikke blot et middel for Ca ^{2+ sensibilisering, men også en mulig mekanisme for tonic vs. phasic sammentrækning. Inaktivering af MLCP via PKCa -CPI-17-vejen ville give mulighed for fortsat høje myosin let kæde (MLC 20) phosphorylering og dermed en vedvarende sammentrækningskraft. En undladelse af at inaktivere MLCP ville reducere MLC 20 phosphorylering og kraft, hvilket resulterer i en transient sammentrækning. Mave fundus SM genererer en tonic (vedvarende) kontraktion, mens maven antrum SM genererer en phasic (forbigående) kontraktion som svar på en række stimuli.}}

Ca ^{2+ sensibilisering, som involverer aktivering af G- protein-koblede second messenger veje, der bevidstgøre de kontraktile proteiner til [Ca 2+ _{i] ved at hæmme MLCP, kan ske ved en hvilken som helst af talrige veje. En af de rapporterede veje til inhibering af MLCP aktivitet omfatter proteinkinase C /C-kinase aktiveret PP1 inhibitor protein på 17 kDa (PKC /CPI-17) pathway [19], [20]. G-koblet protein receptor (GCPR) aktivering resulterer i aktivering af phospholipase C (PLC), hydrolyserer phosphatidylinositol 4,5-bisphosphat (PIP 2) for at fremstille inositol 1,4,5-trisphosphat (IP 3) og diacylglycerol (DAG). DAG er kendt for at aktivere PKC, som kan forårsage phosphorylering af CPI-17 til selektivt at inhibere MLCP (gennemgået for visceral SM i [17]). PKC menes at være reguleret af dens aktivering og rumlige fordeling i cellen, hvor sidstnævnte er styret ved at forankre proteiner, der binder til og begrænser placeringen af ​​PKC til specifikke områder af cellen [21], [22]. For eksempel rapporter om grundlæggende aktiv L-type Ca 2 + kanaler og deres regulering af PKC [23], [24] tyder på, at PKC er lokaliseret nær membranen i glatte muskelceller. Den cellulære funktion af CPI-17 i cellen kunne variere afhængigt af dens niveau af proteinekspression og om den ligger i nærheden af ​​plasmamembranen, hvor PKCa ligger /aktiveres, eller associeret med de kontraktile myosin tykke filamenter hvor MLCP ville være placeret på de -phosphorylate myosin let kæde 20 (MLC 20).}}

udtryk for PKCa og CPI-17 og deres rumlige-tidsmæssige omfordeling på væv aktivering er blevet foreslået i Ca ^{2+ overfølsomhed af glatte muskelvæv (til gennemsyn [14], [15], [16], [17]). Det er således muligt, at forskelle i deres udtryk og cellulære lokalisering /translokation kan inddrages i fastlæggelsen tonic vs. phasic kontraktile respons. For disse to proteiner for at være en del af en vej der er involveret i inhibering MLCP aktivitet under væv aktivering, og således bevirker en tonic eller fasisk respons, de har brug for at blive udtrykt på passende niveauer og placeret ved den korrekte placering i cellen på det korrekte tidspunkt. Fordi PKC aktiveres af DAG (en membran bundet phospholipid), skal den også være på membranen i det mindste midlertidigt for at dette kan ske. Og hvis CPI-17 vil inhibere MLCP fra dephosphorylere MLC _{20 på de tykke filamenter, CPI-17 på et tidspunkt skal være i cytosolen forbundet med de tykke filamenter stede der. Med disse to trin, der forekommer i to rumligt adskilte områder af cellen, en eller begge af disse proteiner har til at translokere til den anden region for dem at interagere og fuldføre pathway.}}

Formålet med denne undersøgelse var at teste den hypotese, at PKCa - CPI-17 Ca ^{2+ overfølsomhed vej er involveret i fastlæggelsen tonic (vedvarende) og fasiske (forbigående) kontraktile respons i glatte muskler. For at gøre dette har vi bestemt protein udtryk og rumlige-tidsmæssige fordeling af PKCa og CPI-17 i phasic mave antrum og tonic mave fundus under afslappede og aktiverede betingelser. Resultaterne viser ingen signifikant forskel i ekspressionen af ​​en af ​​disse to proteiner, og heller ikke i deres perifere fordeling mellem disse to væv er i modstrid med den hypotese, at den PKCα- CPI-17 Ca 2+ overfølsomhed vej er den afgørende faktor for tonic vs. fasiske kontraktile respons observeret i disse væv.}

Metoder

organer og væv håndtering

Svin væv (maver) blev opnået fra Hansen Kød service (Franksville, WI) og sat i kold fysiologisk saltopløsning (PSS; (i mM): 140,1 NaCl, 4,7 KCI, 1,2 Na _{2HPO 4, 2,0 MOPS (pH 7,4), 0,02 Na 2EDTA, 1,2 MgSO 4, 1.6 CaCl 2, og 5,6 glucose). Maverne blev renset for blod, løst bindevæv, og i nogle tilfælde, slimhinden og frosset straks eller opbevares i PSS i køleskab i 0-2 dage. Nogle organer var frisk frosset så hurtigt som muligt efter post-mortem (60-90 minutter). Nogle organer blev inkuberet i PSS og /eller stimuleret med 1,0 uM CCh eller PDBu (Sigma) ved 37 ° C i forskellige tidspunkter før frysning. Variable inkubationstider og agonist koncentrationer blev også testet. For immunhistokemi alle væv blev opbevaret frosset indtil sektioneret og immunoreageret. Frysning i alle tilfælde involveret placere stykker af væv eller vævsstrimler i isopentan afkølet i flydende nitrogen efterfulgt af opbevaring ved -80 ° C. Fem til seks um sektioner af de frosne væv blev skåret på en Leica CM1900 kryostat, samlet op på objektglas og opbevares nedfrosset (0-1 dage), indtil immunoreageres.}

immunreaktioner og reagenser

anvendte antistoffer blev opnået fra følgende kilder: PKCa (H-7 og C-20) og CPI-17 (H-60) fra Santa Cruz Biotech, Santa Cruz CA; Vinculin og Tallinn fra Sigma, Saint Louis, Missouri; Caveolin 1 fra BD Biosciences, San Jose, Californien; CY2 og Cy3 æsel-anti mus eller kanin sekundære s fra Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA; Alexa Fluor 594-phalloidin og DAPI fra Molecular Probes, Eugene, OR. Alle disse antistoffer er tidligere blevet anvendt i vores laboratorium for immunhistokemi og western blotting hvor de viser specificitet for et bånd med den korrekte molekylvægt for det respektive protein angivet [25], [26], [27]. Negative kontroller hvor det primære antistof ikke er inkluderet viser ingen reaktivitet for disse bånd og ingen immunofluorescens på vævssnit.

Frosne vævssnit plukket på objektglas blev optøet ved stuetemperatur og derefter fikseret med 2% paraformaldehyd i 10 minutter, permeabiliserede i 0,5% Triton X-100 i 10 minutter og blokeret med 5 mg /ml BSA i 1 time før omsætning med det primære antistof natten over (4 ° C) og derefter det passende sekundære antistof i en time ved stuetemperatur. Efter det sekundære antistof blev vævene inkuberet med DAPI (0,5 uM), phalloidin (10-50 nM) eller DAPI /phalloidin som passende til farvning kerner og /eller filamentøse actin. Multiple vaske blev anvendt efter den primære og sekundære inkubationer, og kontrastfarvning. Dækglas blev monteret under anvendelse af pufret 75% glycerol med 0,2% n-propylgallat at minimere fading. Alle immunreagere løsninger blev fremstillet i PBS-Tween [(i g /liter: NaCl 8,0, KH _{2PO 4 0,2, Na 2HPO 4 1.15, KCl 0,2,), 1% tween- 20, pH 7,4] med 0,1% BSA. Negative kontroller omfattede 0,1% BSA uden det primære antistof, og viste ingen immunreaktion.}

Mikroskopi

Snit blev observeret ved anvendelse af et Olympus IX70 mikroskop med epifluorescensbelysning. Digitale billeder blev taget med et 16 bit Princeton Instruments (Princeton, NJ) CCD-kamera, styres via en PCI bord via IPLab til Windows på en pc (Ver 3.6, Scanalytics;. Fairfax, VA). Billeder blev taget ved hjælp af enten en 100 × (1,3 NA) eller 60 × (1,25 NA) olie linse eller en 40 × (0,9 NA) luft linse og gemmes på pc'en. Emissionsfiltre anvendt, var 405, 490 og 570 nm. Sektioner blev også ses ved hjælp af et Nikon konfokal mikroskop (Nikon A1 konfokale Eclipse Ti). Målene blev anvendt, var 100 × (1,4 NA) olie linse på 425, 488 og 561 nm. Lignende resultater blev observeret i immunofluorescens distributioner ved hjælp af disse to forskellige systemer.

billedanalyse af Fordeling af PKC /CPI-17 af de enkelte celler i væv

Profiler af fluorescensintensitet blev taget for individuelle celler i tværgående vævssnit. Snit blev observeret ved lav forstørrelse (10-20x) for at undgå områder med tilsyneladende artefakter (væv foldning, frostskader, osv). I et artefakt friareal forstørrelsen blev øget til 40-100x, og billeder blev taget ved disse højere forstørrelser. Tre forskellige områder inden for én vævssnit blev udvalgt til at tage billeder. Z-stack serien blev taget individuelt for hver af de tre farvekanaler anvendte. 1 um tykke Z snit blev taget, og 15-25 Z snit blev taget for hvert væv sektion (tal S1 & S2 show Z-stack eksempler på CPI-17 immunoreaktivitet i antrum med og uden væv aktivering). Hver Z stack serien blev undersøgt for hver sektion for at identificere center z billedet, og billedet blev konverteret til a.bmp fil, der blev importeret til NIS-Elements AR 3.0 (Nikon) på en pc for at analysere data.

Profiler af PKCa og Phalloidin fluorescensintensitet blev opnået for individuelle celler i tværgående vævssnit. En linje blev trukket hen over midten af ​​billedfeltet. Ti celler krydses af linjen blev udvalgt til målinger. Baseret på vores tidligere protokoller [25], de første fem pixels (~0.7 um) på hver side af den celle, hvor den phalloidin intensiteten steg kraftigt fra baseline blev defineret som periferien af ​​cellen. For cytosoliske målinger blev en linje placeres mindst 2 um væk fra cellen periferien. Intensitet målinger blev foretaget under anvendelse af et område af interesse (ROI) omtrent ved midten af ​​cellen (for cytosoliske målinger), eller langs cellens membran (for perifere målinger). For konsistens, er størrelsen af ​​ROI holdes konstant i de perifere og cytosoliske målinger. Celler i afsnittet med meget små diametre (ikke i stand til at måle cytosolisk ROI mindst 2 um fra periferien) eller med kerner stede (synlige DAPI-farvning, hvor rumlige begrænsninger og perinukleære organeller kunne forvirre fordelingen) blev udelukket fra analysen. For PKCa, blev forholdet mellem den gennemsnitlige intensitet af PKCa ved periferien over den samlede PKCa intensitet (sum af PKCa intensitet fra ROI ved periferien og ROI i cytosol), der anvendes. Ti celler pr og tre forskellige felter blev underkastet måling til dataanalyse for hvert væv region, dvs. tredive celler blev talt, og gennemsnittet for hver prøve (n = 1). Slutprøven størrelse var n = 5.Den samme procedurer blev anvendt til at måle intensiteten af ​​CPI-17, bortset fra at kun ét felt af 10 celler blev anvendt for hver prøve (n = 1), med en endelig prøvestørrelse på n = 3.

Mekaniske Målinger

Umiddelbart før brug, blev væv strimler skåret og fastspændt på hver ende, med klemmerne sikret mellem kroge på en stationær metalstang og en isometrisk krafttransducer (Harvard Apparatus, Holliston, MA), i PSS boblede med 95% O _{2/5% CO 2 i vand med kappe muskel kamre (Radnoti Glass Technology, Monrovia, CA) ved 37 ° C. Længden af ​​hver strimmel blev varieret ved repositionering af stationære metalstang.}

glat muskelvæv strimler (mave antrum og fundus) blev ækvilibreret i 1 time og strækkes til en passiv spænding tilnærme Lo anvendelse af en forkortet længde-spændingskurve . Til kontrakt væv blev PSS erstattet med K ^{+ - PSS (109 mM KCl erstattes iso-osmotisk for NaCl) [28]. Musklen strimler blev aktiveret gentagne gange med strækning af vævet mellem hver aktivering, indtil maksimale kraftpåvirkning ikke længere viste en signifikant stigning i forhold til sammentrækning. Chambers blev skyllet tre gange med PSS efter hvert væv aktivering. Mindst to gentagelige successive K + - PSS sammentrækninger blev brugt til at få en standard kraft spor med en 10 minutters pause mellem hver sammentrækning, før du starter eksperimentet. Vævene blev derefter aktiveret med 1 uM carbachol og afslappet igen, som blev udført i K + - PSS sammentrækninger. Efterfølgende sammentrækninger omfattede alle 1 uM phentolamin og propranolol at blokere α- og β - adrenerge receptorer hhv. Efter den endelige 1 uM CCh sammentrækning og vask blev vævene aktiveret med en uM PDBu at indspille deres mekaniske respons.}

Analyse af force data

Spænding signaler fra krafttransducere blev digitaliseret af PowerLab 400 eller 4 SP hardware (ADInstruments, Castle Hill, Australien) visualiseret på en computerskærm (figur v3.6 eller 4.0, ADInstruments) som force (g) ved 10 Hz og lagret software kommando ved til en harddisk til senere analyser. Tal blev foretaget med regnearksprogrammet Excel 2000 (Microsoft, Redmond, WA).

gelelektroforese og vestlige Blotting

Proteinekspression blev analyseret som tidligere [29] beskrevet. Væv blev homogeniseret ved 50 mg /ml i 0,125 M Tris, 2% natriumdodecylsulfat (vægt /volumen), 20% glycerol, 0,1% bromphenolblåt (vægt /volumen) og 20 mM dithiothreitol. Proteiner blev opløst på lave tværbindende natriumdodecylsulfat geler [30] og immunoblotting blev udført som tidligere beskrevet [31]. Den PKCa antistof anerkendt enten en enkelt band eller oftere en dublet på ~76 kD, mens CPI-17 antistof anerkendt et enkelt bånd på ~17 kD. Disse størrelser er i overensstemmelse med den forventede størrelse for disse proteiner baseret på gel mobilitet. For at sikre nøjagtigheden af ​​Western blots, blev lastning kurver gjort for både mave fundus og antrum prøver over en 5-dobbelt række belastninger (4-20 pi) for actin (Coomassieblåt farvning) og PKCa og CPI-17 (western blotting) . Resultaterne viste et lineært forhold i dette interval for alle tre proteiner fra begge væv (R ^{2 > 0,98 for alle resultater, n = 3). Kvantificering af PKCa og CPI-17-proteinekspression blev udført på western blots under anvendelse af 5-10 pi belastninger, der var inden denne lineære interval (n = 6).}

Statistik Salg

Statistiske sammenligninger blev foretaget hjælp MINITAB (Minitab Inc. State College, PA). En én prøve t-test blev anvendt til at teste distributionen af ​​PKCa /CPI-17 (en perifer til indhold af 0,5 ROI samlede angiver et "ensartet" distribution i glatte muskelceller (SMC'er)) i antrum og fundus under hvilende tilstand. Envejs-ANOVA blev udført for at teste for PKC /CPI-17 distributions- forskelle for de to væv med forskellige stimulerende parametre. To eksempel t-tests blev anvendt til at teste betydningen af ​​forskel for ekspressionsniveauet af PKCa eller CPI-17 i antrum og fundus. En to-halet F-test for ligestilling af to standardafvigelser (SDS) bestemmes en signifikant lavere SD i forholdet caveolin til PKCa sammenlignet med SD af forholdet mellem vinculin til PKCa. En værdi på P < 0,05 blev betragtet som signifikant for alle statistiske tests. Ingen statistiske tests blev udført på kraften data og figur 1 er repræsentative for tilsvarende data fra 6 forskellige dyr. Western blot data er fra seks dyr. PKCa data distribution er et gennemsnit på tredive celler målt for hvert dyr og fem dyr blev testet. CPI-17 data distribution er et gennemsnit på 10 celler målt for hvert dyr og tre dyr blev testet. Protein co-lokalisering data er baseret på en 'n' på mindst 20 celler fra mindst 3 dyr.

Resultater

Svin mave fundus er et primært tonic glat muskelvæv, der reagerer på stimulering med en vedvarende kontraktion mens antrum er et primært fasisk glat muskelvæv, der reagerer på stimulering med en forbigående kontraktion (fig. 1). I væv er disse reaktioner sandsynligvis et resultat af direkte stimulering af den glatte muskulatur som tilsætning af 1 pM propranolol (β agonist blokker) og phentolamin (α agonist blokker) blev anvendt til at forhindre aktivering af adrenerge receptorer som følge af potentielle frigivelse af sympatiske neurotransmittere. Stimulering af glat muskulatur med PDBu anvendes rutinemæssigt til at forårsage kontraktion af glat muskulatur via PKC-aktivering [32], [33], [34]. Én uM PDBu forårsager en lille langsom nedgang i maven fundus strimler (~ 40% af K ^{+ stimulation respons), mens antrum viser væsentlige ingen respons (< 5% K + stimulation) (Fig. 1). Forskellen mellem langvarig og forbigående reaktioner af disse to væv til KPSS og CCh, og tilstedeværelsen eller fraværet af et kontraktilt respons på PDBu stimulering kunne skyldes ekspressionen og /eller rumlig-tidsmæssige fordeling af de nedstrøms second messengers (PKCa og CPI-17), som foregav at være ansvarlige for MLCP hæmning med PDBu stimulering. For at undersøge dette målte vi ekspressionsniveauerne og bestemmes den rumlige-tidsmæssige fordeling af PKCa og CPI-17 i disse væv.}

Figur 2 viser western blot-resultaterne for ekspression af CPI-17 og PKCa i maven antrum og fundus. Væv blev forarbejdet kontrolleret for proteinkoncentration, og resultaterne blev beregnet ud fra intensiteten af ​​det respektive protein signal og normaliseret til actin proteinekspression (fig. 2). Begge metoder (kun normaliserede data vist) indikerede, at hverken ekspressionen af ​​CPI-17-protein eller denne PKCa protein er signifikant forskellige (p > 0,23 & p > 0,28 henholdsvis n = 6) ved sammenligning af disse to SM væv. Kontroller blev udført under anvendelse af en række belastninger at bekræfte række linearitet lastning, og at prøver, der anvendes til kvantificering var inden for dette interval (data ikke vist, se metoder). Fordi der er ingen forskelle i udtrykket for disse to proteiner mellem disse to væv, vi næste fortsatte med at afgøre, om forskelle i deres rumlige-tidsmæssige fordeling kunne forklare forskellen i deres svar på PDBu stimulation.

Figur 3 viser immuohistochemical resultater for fordelingen af ​​PKCa i de langsgående og cirkulære lag af fundus og antrum. Under hvilebetingelser i afslappende løsning, når der ikke er nogen styrkegenerering af vævet, vises PKCa at være entydigt fordeles fortrinsvis nær periferien af ​​SMC'er (fig. 3- grøn farve, PSS). Stimulering af væv med en uM CCh (3 ') eller en uM PDBu (10 og 30'), ændrer ikke denne perifere fordeling af PKCa. Forholdet mellem fordelingen af ​​PKCa nær plasmamembranen i forhold til totalt cellulært PKCa blev anvendt til at kvantificere eventuelle ændringer i fordelingen af ​​dette protein under disse forskellige betingelser. Figur 4 viser resultaterne som forholdet mellem PKCa på cellens periferi i forhold til de samlede PKCa stede i cellen (perifer /(perifer + cytosol), se metoder). Et forhold på 0,5 ville indikere en "ensartet" fordeling af proteinet i hele cellen. Den PKCa ratio (perifer /total) varierede fra 0,64 til 0,68 i alle betingelser undersøgt. Disse værdier er signifikant større end 0,5 (p < 0,05), hvilket indikerer, at PKCa er placeret primært på cellens periferi (den er ikke "jævnt" fordelt i cellen), og at denne fordeling ikke ændrer mellem den afslappede eller stimulerede betingelser <. br>

Da PKCa foreslås at aktivere CPI-17, vi fortsatte med at bestemme den rumlige-tidsmæssige fordeling af CPI-17 i disse væv under lignende forhold. Figur 5 viser immuohistochemical resultater for distribution af CPI-17 i de langsgående og cirkulære lag af fundus og antrum. Under hvilende betingelser i afslappende løsning, når der ikke er nogen styrkegenerering af vævet, CPI-17 synes at være diffust fordelt i SMC'er (fig. 5- PSS, fig. S1). Stimulering af væv med 1 uM CCh (30 ') (men ikke 1 uM CCh i 3', data ikke vist) eller 1 uM PDBu (30 ') resulterer i en betydelig ændring i denne fordeling, således at CPI-17 synes nu primært at være ved periferien af ​​cellen i en fordeling svarende til den observeret for PKCa (fig. 5, fig. S2). Forholdet mellem fordelingen af ​​CPI-17 nær plasmamembranen i forhold til den samlede CPI-17 (perifer + cytosoliske) blev anvendt til at kvantificere eventuelle ændringer i fordelingen af ​​dette protein under disse forskellige betingelser. Figur 4 viser resultaterne som forholdet mellem perifere-to-total CPI-17. CPI-17-forholdet (perifer /total) varierede fra 0.49-0.67 i alle væv og betingelser undersøgte. Forholdet mellem CPI-17 perifer /total i afslappede forhold ikke er væsentligt anderledes end 0,5 (betyder 0,49-0,5; P > 0,19), hvilket indikerer, at CPI-17 diffust er fordelt over hele de glatte muskelceller under denne betingelse. Dette ændrer ikke efter 3 'af 1 pM CCh stimulation da der stadig ingen signifikant forskel fra den afslappede forhold (betyder = 0,53-0,55; P > 0,05) med undtagelse af fundus væv, hvor CPI-17 perifere /total-forholdet er signifikant større (p < 0,05) ved 3 '(fig. 4). Med 30 'af enten en uM CCh eller en uM PDBu stimulation, bliver CPI-17 fordeling signifikant større end 0,5 for alle væv og lag (middel = 0.62-0.67, P < 0,01), hvilket indikerer, at CPI-17 nu ligger primært på celler periferien (det er ikke længere "jævnt" fordelt gennem cellen), svarende til fordelingen af ​​PKCa (fig. 4).

primært perifer fordeling af PKCa (under både afslappede og stimulerede betingelser) og CPI-17 (efter 30 'stimulation med CCh eller PDBu) ikke er ensartet på cellens periferi, men punktformig i distribution (fig. 6). Der er også en punktformig fordeling af anatomisk og funktionelt forskellige adherensovergange og caveoli på SMC plasmamembranen [26]. For at bestemme, om fordelingen af ​​PKCa og CPI-17 ved membranen svarer til punktformet mønster af adherensovergange, gjorde vi dobbeltmærkning med to adherens junction associerede proteiner, vinculin og Tallinn. Den alternative mønster af fordeling af de røde og grønne fluoroforer på membranerne viser, at PKCa og CPI-17 ikke co-lokalisere med enten vinculin eller Tallinn (fig. 6), hvilket tyder på, at PKCa og CPI-17 ikke forbinder med den adherens krydset kompleks under de betingelser, vi undersøgte. Fordi caveoli veksler med de adherensovergange på perifere membran [26], PKCa og CPI-17 kan co-lokalisere med caveoli. For at bestemme om punktformig fordeling af PKCa og CPI-17 ved membranen svarer til punktformet mønster af caveoli, vi også gjorde dobbelt mærkning af PKCa med caveolin. Fordelingen af ​​PKCa og caveolin co-lokalisere på membranen i både afslappet og aktiverede betingelser som dåsen blevet observeret ved fremkomsten af ​​den gul /orange fluorescens snarere end tydelig rød og grøn fluorescens (fig. 6). En to-halet F-test for ligestilling af to standardafvigelser (SDS) bestemmes en signifikant lavere SD i forholdet caveolin til PKCa sammenlignet med SD af forholdet mellem vinculin til PKCa (n = 20 celler; p < 0,05) . Desuden dobbelt mærkning af PKCa med CPI-17 efter aktivering af vævet også viser signifikant co-lokalisering (n = 20 celler; p < 0,05) af disse to proteiner nær plasmamembranen (fig. 7). Disse data viser, at PKCa primært er lokaliseret nær caveloi på SMC plasmamembranen på alle tidspunkter, og at følgende væv aktivering, en betydelig del af den cytosoliske CPI-17 translokerer til caveoli på plasmaet, hvor det co-lokaliserer med PKCa.

diskussion

Glatte muskelvæv rutinemæssigt karakteriseret som værende enten "tonic" (generere en langsom opretholdt isometrisk kontraktion) eller "fasiske" (generere en hurtig forbigående isometrisk kontraktion). Kraft generation og /eller væv afkortning i SM menes at kræve forhøjet myosin let kæde fosforylering, ATP forbrug og cross bro cykling. En mulig mekanisme er ansvarlig for disse to typer af sammentrækninger er forskellen Ca ^{2+ overfølsomhed. Ca 2+ overfølsomhed i glatte muskulatur menes for en stor del skyldes hæmning af MLCP samtidig med eller efter aktivering af MLCK under væv aktivering [15], [35]. En af de store veje foreslået at være involveret i Ca 2+ sensibilisering er via G-protein-koblede receptorer (GPCR) /phospholipase C (PLC) /diacylglycerol (DAG) /PKC /CPI-17 til at inhibere MLCP. GPCR s, PLC, og DAG er alle placeret på /i plasmamembranen. Placeringen af ​​MLCP er mindre sikkert, men på et tidspunkt efter væv aktivering behov MLCP at være forbundet med MLC _{20 om myosin molekyle af de tykke filamenter for at dephosphorylere dette protein. Fordi tykke filamenter er blevet rapporteret at blive fordelt i hele SMC cytoplasmaet [36], [37], [38], [39], vil MLCP skal også fordeles over hele cytoplasmaet på et tidspunkt under afslapning [40]. Hvis MLCP ligger inden cytosolen og nær MLC 20 under sammentrækning, og PKCa og CPI-17 spiller en rolle ved inhibering MLCP under kontraktion, så i det mindste ville forventes CPI-17 at være placeret inden cytosolen på et tidspunkt under sammentrækning. Resultaterne af denne undersøgelse viser, at PKCa præferentielt lokaliseret nær plasmamembranen under afslappede og aktiverede betingelser, og at CPI-17 er også fortrinsvis lokaliseret nær plasmamembranen under aktiverede forhold. Således antyder disse data, at forskelle i PKCα- CPI-17 Ca 2+ overfølsomhed vej kan ikke forklare tonic og fasiske SM sammentrækninger i maven fundus og antrum og yderligere arbejde er påkrævet for at bestemme, hvordan den rumlige-tidsmæssige fordeling af CPI 17 med væv aktivering kan regulere MLCP at forårsage Ca 2+ sensibilisering af SM sammentrækning i intakte SM væv.}}

Mens PDBu forårsager en langsom nedgang i fundus, som er ~ 40% af KPSS inducerede peak kraft , lille sammentrækning genereres i antrum med PDBu stimulering. Da fundus og antrum repræsenterer to grundlæggende typer af glat muskulatur, tonic og fasisk henholdsvis forekommer det logisk at tilskrive forskellen i kraft generation til distinkte egenskaber fasisk og tonic muskel. Woodsome et al [41] rapporterede, at ekspressionsniveauet af CPI-17 i tonic vaskulær SM er højere end i fasisk vaskulær SM. Dette kunne forklare den forskellige evne toniske muskler til at opretholde kraft (en høj koncentration af CPI-17 inhiberer MLCP tillader MLC _{20 phosphorylering at blive høj og kraft til at blive fastholdt i tonic SM). Denne undersøgelse undersøgte PKCa og CPI-17 protein-ekspression og distribution i visceral svin mave. Til vores overraskelse blev påvist nogen signifikant forskel i proteinet ekspressionsniveauet af PKCa eller CPI-17 mellem fundus og antrum (fig. 2).}

• PLoS ONE: Nikotin Dæmper Aktivering af Tissue Resident makrofager i Mouse mave gennem β2 nikotinacetylcholinreceptoren
• PLoS ONE: Kirurgisk behandling for patienter med Krukenberg Tumor af mave Oprindelse: Klinisk Outcome og prognostiske faktorer Analyse