Финансирование:. Эта работа Работа выполнена при поддержке Национального научного фонда (NSF), отдел биологических наук и Высшей школы, Маркетт университета. Доноры не играет никакой роли в дизайн исследования, сбора и анализа данных, решение о публикации или подготовки рукописи
<р> Конкурирующие интересы:.. Авторы заявили, что не существует никаких конкурирующих интересов
Введение Методы органов и тканей Обработка Механические измерения Результаты Поскольку PKCα предлагается активировать CPI-17, мы исходили для определения пространственно-временного распределения CPI-17 в этих тканях при одинаковых условиях. На рисунке 5 показаны результаты immuohistochemical для распределения CPI-17 в продольных и кольцевых слоев глазного дна и антрального. Под условия покоя в тихом и спокойном решение, когда нет формирования сил тканью, ИВК-17, как представляется, диффузно распределены по всему SMCS (рис. 5- PSS, рис. S1). Стимуляция тканей с 1 мкМ ЦХ (30 ') (но не 1 мкМ ЦХ для 3', данные не показаны) или 1 мкМ PDBu (30 ') приводит к существенному изменению этого распределения таким образом, что в настоящее время появляется ИВК-17 чтобы быть главным образом на периферии клетки в распределении аналогичный наблюдаемому для PKCα (рис. 5, рис. S2). Отношение распределения CPI-17 вблизи плазматической мембраны по отношению к общему количеству ИВК-17 (периферический + цитозольная) использовали для количественной оценки возможных изменений в распределении этого белка в этих различных условиях. На рисунке 4 показаны результаты как отношение периферического к сумме CPI-17. Соотношение CPI-17 (периферическая /всего) колебался от 0.49-0.67 во всех тканях и условиях обследованных. Отношение CPI-17 периферического /общее в облегченных условиях не значительно отличается от 0,5 (означает 0.49-0.5; P > 0,19), что указывает, что CPI-17 диффузно распределены по всему гладкомышечных клеток при этом условии. Это не меняет следующие 3 '1 мкМ CCH стимуляции, как до сих пор нет существенной разницы от облегченных условиях (имеется в виду = 0.53-0.55; P > 0,05), за исключением тканей глазного дна, где окружная /общее отношение CPI-17 значительно больше (р ≪ 0,05) на 3 '(фиг. 4). С 30 'либо 1 мкМ ЦХ или 1 мкМ PDBu стимуляции, распределение ИВК-17 становится значительно больше, чем 0,5 для всех тканей и слоев (средства = 0.62-0.67, P ≪ 0,01), что указывает, что ИВК-17 в настоящее время находится в основном на периферии клеток (она более не является "равномерно" распределен по всей клетке), аналогично распределению PKCα (рис. 4). Обсуждение
<р> механизм (ы) определения тоники (устойчивого) против фазических сокращений (переходная) гладких мышц (СМ) остается нерешенной. Различные иннервации и циркулирующих сигнальных молекул в дополнение к уникальным рецептором и экспрессии (изоформы) белка и внутриклеточных сигнальных путей усложняет проблему. Неудивительно, что существует несколько предложенных гипотез, объясняющих тонизирующее поддержания силы в СМ в том числе: slowly- или езда на велосипеде не-гладких мышц миозина поперечных мостиков называемых защелок мосты [1], [2], [3], [4]; набор немышечно-миозина II [5], [6], [7]; формирование кальдесмона или calponin зависимых актин-к-миозина поперечных связей [8], [9]; формирование цитоскелета силовых несущих конструкций [10], [11], [12]; и регулирование миозина LC <югу> 20 фосфорилирования с помощью второго вестника путей, влияющих на миозина легкой цепи киназы (КЛЦМ) и легкой цепи миозина фосфатазы (МЛКП) деятельности [13], [14], [15], [16], [17] , [18]. Эта последняя категория представляет интерес из-за отчётный дифференциальной экспрессии, локализации и регуляции этих вторичного мессенджера белков в различных тканях SM. Переменная регулирование КЛЦМ и МЛКП деятельности может обеспечить не только средство для Са 2 + сенсибилизации, но и возможный механизм тоника против фазовое сокращение. Инактивация МЛКП через PKCα -CPI-17 пути позволит поддерживается высокой легкой цепи миозина (MLC <югу> 20) фосфорилирования и, таким образом, устойчивой сократительной силы. Неспособность инактивировать МЛКП уменьшит MLC <суб> 20 фосфорилирование и силы, что приводит к транзиторной сжатия. Желудок фундус SM формирует тоником (устойчивый) сокращение в то время как желудок Антрум SM формирует фазовое (переходную) сокращение в ответ на различные раздражители.
<Р> Ca 2 + сенсибилизация, которая включает в себя активацию G- белком второго мессенджера пути, которые ознакомлению сократительных белков [Са 2 + <югу> I] путем ингибирования МЛКП, может происходить любым из многочисленных путей. Один из сообщенных путей для ингибирования активности МЛКП включает в себя протеинкиназы C /C-киназы активированный PP1 ингибитор протеин 17 кДа (ПКС /ИВК-17) пути [19], [20]. G-связывающий рецептор белка (GCPR) активации приводит к активации фосфолипазы С (PLC), гидролизует фосфатидилинозитол 4,5-бисфосфат (ПИП <суб> 2) для производства инозитол-1,4,5-трифосфата (IP-<суб> 3) и диацилглицеринацилтрансферазы (ДАГ). ДАГ известно, активирует PKC, который может вызвать фосфорилирование CPI-17 для селективного ингибирования МЛКП (обзор для висцерального СМ в [17]). ПКС, как полагают, регулируется с помощью его активации и пространственное распределение внутри клетки, причем последний контролируется анкеровки белки, которые связываются с и ограничить расположение ПКС в конкретных регионах клетки [21], [22]. Например, сообщения о Ca каналы конститутивно активный L-типа 2+ и их регулирование с помощью PKC [23], [24] позволяет предположить, что PKC локализована вблизи мембраны в клетках гладких мышц. Клеточная функция CPI-17 в клетке может варьироваться в зависимости от уровня экспрессии белка и является ли он расположен вблизи плазменной мембране, где PKCα находится /активированной или связанного с толстыми нитями сократительной миозина, где МЛКП будет находиться в де -phosphorylate легкой цепи миозина 20 (MLC <суб> 20).
<р> выражение PKCα и CPI-17 и их пространственно-временного перераспределения после активации ткани были предложены в Са 2 + сенсибилизация тканей гладких мышц (для обзора [14], [15], [16], [17]). Таким образом, вполне возможно, что различия в их экспрессии и клеточной локализации /транслокации могут быть вовлечены в определении тоником против ответов фазическая сократительной. Для того чтобы эти два белка, чтобы быть частью пути, участвующих в подавлении активности МЛКП во время активации ткани, и тем самым вызывая тонизирующий или фазовое ответ, они должны быть выражены на соответствующих уровнях и расположены в правильном месте в ячейке в нужное время. Поскольку ПКС активируется DAG (связанный с мембраной фосфолипида), она также должна быть на мембране, по крайней мере временно, чтобы это произошло. И если ИВК-17 будет ингибировать МЛКП из dephosphorylating MLC <суб> 20 на толстых нитей, CPI-17 в какой-то момент должен быть в цитозоле, связанной с толстыми нитями, присутствующих там. С помощью этих двух шагов, формируемых в двух пространственно отдельных областях клетки, один или оба из этих белков к транслокации в другой области для них, чтобы взаимодействовать и завершить путь.
<Р> Цель данного исследования состояла в том, чтобы проверить гипотеза о том, что PKCα - CPI-17 Ca 2+ сенсибилизация путь участвует в определении тоником (устойчивого) и (переходные фазовые) сократительные ответы в гладких мышцах. Для этого мы определили экспрессию белка и пространственно-временное распределение PKCα и CPI-17 в фазического антрума желудка и тонизирующего желудка глазного дна при расслабленных и активированных условиях. Результаты не показывая никаких существенных различий в экспрессии любого из этих двух белков, ни в их периферического распределения между этими двумя тканями не согласуются с гипотезой о том, что PKCα- CPI-17 Ca 2+ сенсибилизация путь является определяющим фактором для тоник против реакций сократительных фазических наблюдаемые в этих тканях.
<р> Свиньи ткани (желудки) были получены от Hansen службы Мясо (Franksville, WI) и положить в холодную физиологический солевой раствор (PSS; (в мМ): 140,1 NaCl, 4,7 KCl, 1,2 Na <югу> 2HPO <суб> 4, 2,0 MOPS (рН 7,4), 0,02 Na <югу> 2EDTA, 1,2 MgSO <суб> 4, 1.6 CaCl <югу> 2, и 5,6 глюкозы). Желудки были очищены от крови, рыхлой соединительной ткани, а в некоторых случаях, слизистая оболочка, и замораживают немедленно или хранить в PSS в холодильнике в течение 0-2 дней. Некоторые органы были свежемороженая, как можно скорее после аутопсии (60-90 минут). Некоторые органы, инкубировали в ПСС и /или стимулировали 1,0 мкМ ЦХ или PDBu (Sigma) при 37 ° С в течение различные моменты времени перед замораживанием. Переменные времени инкубации и концентрации агониста были также испытаны. Для иммуногистохимии все ткани хранили в замороженном виде до секционного и immunoreacted. Замораживание Во всех случаях для размещения кусков ткани или полос ткани в изопентан охлаждают в жидком азоте с последующим хранением при -80 ° С. От пяти до шести мкм срезы замороженных тканей были вырезаны на криостат Leica CM1900, взял на стеклах и хранили замороженными (0-1 дней), пока не immunoreacted.
Immunoreactions и реагенты
<р> антитела, используемые были получены из следующих источников: PKCα (H-7 и C-20) и CPI-17 (Н-60) от Santa Cruz Biotech, Santa Cruz CA; Винкулина и Талин от Sigma, Сент-Луис, штат Миссури; Кавеолин 1 из BD Biosciences, Сан-Хосе, штат Калифорния; Cy2 и Су3 Осел против мыши или кролика вторичные от Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA; Alexa Fluor 594-фаллоидином и DAPI от Molecular Probes, Eugene, OR. Все эти антитела были использованы ранее в нашей лаборатории для иммуногистохимии и вестерн-блоттинга, где они показывают специфичность в отношении полосу нужного молекулярного веса для соответствующего белка, указанного [25], [26], [27]. Отрицательные контроли, где первичное антитело не включены не проявляют реакционной способности этих полос и не иммунофлюоресценции на срезах ткани.
<Р> секции Замороженную ткань поднял их на предметные стекла оттаивают при комнатной температуре, а затем фиксировали 2% параформальдегидом в течение 10 минут, проницаемыми в 0,5% Triton X-100 в течение 10 минут и блокировали 5 мг /мл бычьего сывороточного альбумина в течение 1 часа до начала реакции с первичным антителом в течение ночи (4 ° C), а затем соответствующим вторичным антителом в течение одного часа при комнатной температуре. После вторичного антитела, ткани, инкубировали с DAPI (0,5 мкМ), фаллоидином (10-50 нМ) или DAPI /фаллоидином в случае необходимости для окрашивания ядер и /или нитчатых актина. Несколько промывные использовали следующие первичные и вторичные инкубирования, а также counterstaining. Покровные стекла были установлены с использованием забуференной 75% глицерина с 0,2% н-пропилгаллат, чтобы минимизировать выцветанию. Все immunoreacting решения были сделаны в PBS-Tween [(в г /л: NaCl 8,0, KH <суб> 2PO <суб> 4 0,2, Na <суб> 2HPO <суб> 4 1,15, KCl 0,2,), 1% tween- 20, рН 7,4] с 0,1% БСА. Отрицательные контроли включали 0,1% БСА без первичного антитела, и не показал иммунореакцию.
Микроскопия
<р> Разделы наблюдали с использованием микроскопа Olympus IX70 с эпифлуоресцентной подсветкой. Цифровые изображения были взяты с ПЗС-камерой 16 бит Princeton Instruments (Принстон, Нью-Джерси), управляется с помощью платы PCI с помощью IPLab для ОС Windows на ПК (версия 3.6, Scanalytics;. Fairfax, VA). Изображения были сделаны с использованием либо 100 × (1.3 NA) или 60 × (1,25 NA) масляный объектив или 40 × (0,9 NA) воздуха объективом и хранится на ПК. фильтры выбросов были использованы 405, 490 и 570 нм. Срезы также просмотрены с помощью конфокальной микроскопии Nikon (Nikon A1 конфокальной Eclipse, Ti). Цели были использованы 100 × (1,4 NA) линзы масла на 425, 488 и 561 нм. Аналогичные результаты наблюдались в распределений иммунофлуоресценции с использованием этих двух различных систем.
Image Анализ распределения ПКС /CPI-17 отдельных клеток в тканях
<р> Профили интенсивности флуоресценции были взяты для отдельных клеток разделы поперечные ткани. Срезы наблюдались при малом увеличении (10-20x), чтобы избежать области видимых артефактов (складывания ткани, заморозить повреждения и т.д.). В артефакта свободной площади Увеличение было увеличено до 40-100x, и снимки были сделаны на этих более высоких увеличениях. Три различные области в пределах одной секции ткани были выбраны для съемки. Z-стек серии были взяты по отдельности для каждого из трех цветовых каналов, используемых. были взяты 1 мкм срезы толщиной Z, и 15-25 секций Z были взяты для каждой секции ткани (рисунки S1 &Amp; примеры S2 показывают Z-стек из CPI-17 иммунореактивности в антральном с и без активации ткани). Каждая серия Z стек был рассмотрен для каждой секции, чтобы идентифицировать центр г изображение, и этот образ был преобразован в a.bmp файл, который был импортирован в NIS-Elements AR 3.0 (Nikon) на ПК для анализа данных.
<р> Профили интенсивности флуоресценции PKCα и фаллоидином были получены для отдельных клеток в участках поперечных тканей. Линия была разработана по центру поля изображения. Десять клетки пересекаемых линии были выбраны для проведения измерений. На основе наших предыдущих протоколов [25], первые пять пикселей (~0.7 мкм) по обе стороны от ячейки, где интенсивность фаллоидином резко возросла по сравнению с исходными были определены как периферии клетки. Для цитоплазмы измерений, линия была помещена по меньшей мере, 2 мкм от периферии клетки. Измерения интенсивности были проведены с использованием области интереса (ROI) примерно в центре ячейки (для цитозольных измерений), или вдоль клеточной мембраны (для периферийных измерений). Для согласованности, размер ROI поддерживается постоянным для периферийных и цитозольных измерений. Клетки в секции с очень малого диаметра (не в состоянии измерить ROI цитозольного по меньшей мере, 2 мкм от периферии) или с ядрами настоящего (видны DAPI окрашивания, где пространственные ограничения и перинуклеарные органеллы может запутать распределение) были исключены из анализа. Для PKCα, использовалось отношение средней интенсивности PKCα на периферии по общей интенсивности PKCα (сумма интенсивности PKCα от ROI на периферии и ROI в цитозоле). Десять клеток на поле и три различных полей были подвергнуты измерению для анализа данных для каждой области ткани, то есть тридцать клетки подсчитывают и усредняют для каждой выборки (п = 1). Окончательный размер выборки N = 5.The такие же процедуры были применены для измерения интенсивности CPI-17, за исключением того, что только одно поле из 10 клеток использовали для каждой выборки (п = 1), с окончательным размером выборки п = 3.
<р> Непосредственно перед использованием тканевых полосок были вырезаны и зажимается на обоих концах, с зажимами, закрепленную между крюками на неподвижном металлическом стержне и датчика изометрической силы (Harvard Apparatus, Холлистон, MA), в PSS продувают 95% O <суб> 2/5% CO <суб> 2 в водяной рубашкой камерах мышц (Радноти Glass Technology, Монровия, Калифорния) при 37 ° C. Длина каждой полосы изменялась путем перестановки неподвижного металлического стержня.
<Р> Гладкая мышечная ткань полоски (антрального желудка и глазного дна) уравновешивали в течение 1 ч и потянулся к пассивному напряженности, аппроксимирующей Lo, используя сокращенную кривую длины натяжения , Для того, чтобы заключить контракт тканей, PSS была заменена K + - PSS (109 мМ KCl замещен изо-осмотически для NaCl) [28]. Мышечные полосы были активированы многократно с растяжением ткани между каждой активации, до тех пор, пиковое усилие больше не наблюдалось значительное увеличение по сравнению с предыдущим сжатием. Камеры были сброшены три раза PSS после каждой активации ткани. По крайней мере, два последовательных повторяемых K + - PSS Схватки были использованы для получения стандартной силы следа с 10-минутного перерыва между каждым сокращением перед началом эксперимента. Затем ткани активируется с 1 мкМ карбахол и расслаблены снова, как это было выполнено в течение K + - PSS сокращений. Последующие сокращения все включено 1 мкМ фентоламин и пропранолол блокировать α- и β - адренергические рецепторы, соответственно. После окончательного 1 мкМ CCh сокращение и мыть, ткани были активированы с 1 мкМ PDBu, чтобы записать их механическую реакцию.
Анализ данных Force
<р> Сигналы напряжения от датчиков силы были оцифрованы PowerLab 400 или 4 SP аппаратных средств (ADInstruments, Castle Hill, Австралия) визуализируются на экране компьютера (Chart v3.6 или 4.0, ADInstruments) в качестве силы (г) при 10 Гц и хранятся команды программного обеспечения на жесткий диск для последующего анализа. Рисунки были сделаны с помощью программы электронных таблиц Excel 2000 (Microsoft, Редмонд, штат Вашингтон).
выражение гель электрофорез и вестерн-блоттинга
<р> Белок анализировали, как описано ранее [29]. Ткани гомогенизируют при 50 мг /мл в 0,125 М Трис, 2% додецилсульфата натрия (вес /объем), 20% глицерина, 0,1% бромфенол голубой (вес /объем) и 20 мМ дитиотреитола. Белки разделяли на низких сшивающих додецилсульфата натрия гелей [30] и иммуноблоттинг проводили, как описано ранее [31]. Антитело PKCα признали либо одну полосу или чаще дуплетом в ~76 кД в то время как CPI-17 антитело распознает одну полосу на ~17 кД. Эти размеры соответствуют ожидаемому размеру для этих белков на основе подвижности в геле. Для того, чтобы обеспечить точность западных помарки, кривые загрузки были сделаны как для желудка глазного дна и антрального образцов более чем 5-кратным диапазоне нагрузок (4-20 мкл) для актина (кумасси синий окрашивание) и PKCα и CPI-17 (вестерн-блоттинг) , Результаты показали линейную зависимость в этом диапазоне для всех трех белков из обеих тканей (R 2 &GТ; 0,98 для всех результатов, п = 3). Количественное PKCα и экспрессии белка CPI-17 было сделано на Вестерн-блоттинга с использованием 5-10 мкл нагрузки, которые находилась в пределах этого диапазона линейности (п = 6).
Статистика
<р> Статистические сравнения проводились с помощью Minitab (Minitab Inc. State College, PA). Т-тест один образец был использован для проверки распределения PKCα /CPI-17 (периферийный к общему содержанию ROI от 0,5 указывает на "равномерное распределение" в гладкомышечных клетках (SMCS)) в антральном и глазного дна при условии покоя. Один из способов ANOVA проводили для проверки ПКС /CPI-17 распределения разностей для двух тканей с различными параметрами, стимулирующими. Два образца Т-тесты были использованы для проверки достоверности различий для уровня экспрессии PKCα или CPI-17 в антральном и глазного дна. Два хвостами F-тест для равенства двух стандартных отклонений (ДСН) определяется значительно более низкую SD в соотношении кавеолином к PKCα по сравнению с SD соотношения винкулина к PKCα. Значение P < 0,05 считалось значимым для всех статистических тестов. Нет статистические тесты не были сделаны по данным силовых и цифра 1 является представителем подобных данных из 6 различных животных. Вестерн-блот-данные из шести животных. Данные распределения PKCα составляет в среднем тридцать клеток, измеренных на животное и пять животных были протестированы. Распределение данных CPI-17 составляет в среднем 10 клеток, измеренных на одно животное и трех животных были испытаны. Данные белка совместная локализация основана на 'N', по меньшей мере, 20 клеток из, по меньшей мере 3 животных.
<р> Свиной желудок фундус является главным образом тонизирующее гладкой мышечной ткани, которая реагирует на стимуляцию с устойчивым сокращением в то время как Антрум является прежде всего фазовое гладкой мышечной ткани, которая реагирует на стимуляцию с транзиторной сжатия (рис. 1). В тканях эти ответы, скорее всего, является результатом прямой стимуляции гладкой мускулатуры как добавление 1 мкМ пропранолола (β агониста блокаторов) и фентоламин (α агониста блокатор) был использован для предотвращения активации адренергических рецепторов из-за возможного выброса симпатических медиаторов. Стимуляция гладких мышц с PDBu используется обычно вызывает сокращение гладких мышц с помощью PKC активации [32], [33], [34]. Один мкМ PDBU не вызывает небольшое медленное сокращение в желудке фундус полоски (~40% К + ответ стимуляции) в то время как Антрум показывает, по существу, никакой реакции (&л; 5% K + стимуляция) (рис.1.). Разница между устойчивым и переходных характеристик этих двух тканей по отношению к KPSS и ЦХ, а также наличие или отсутствие сократительной реакции на PDBu стимуляции может быть связано с экспрессией и /или пространственно-временного распределения вниз по течению вторичных мессенджеров (PKCα и CPI-17), которые якобы несет ответственность за МЛКП торможения с PDBu стимуляции. Чтобы проверить это, мы измерили уровни экспрессии и определяется пространственно-временного распределения PKCα и CPI-17 в этих тканях.
<Р> На рисунке 2 показаны результаты вестерн-блоттинга для выражения CPI-17 и PKCα в антральном желудка и глазного дна. Ткани обрабатывали контроль за концентрацией белка, и результаты были рассчитаны на основе интенсивности соответствующего сигнала белка, и нормализованная к экспрессии актина белка (рис. 2). Оба метода (только нормализованные данные показаны) показали, что ни экспрессия ИВК-17 белка или что белка PKCα существенно отличается (р > 0,23 &Amp; р &GТ; 0,28 соответственно, п = 6) при сравнении этих двух тканей SM. Органы управления были сделаны с использованием диапазона нагрузок, чтобы подтвердить диапазон линейности нагрузки, и что образцы, используемые для количественной оценки были в пределах этого диапазона (данные не показаны, см методы). Потому что нет никаких различий в экспрессии этих двух белков между этими двумя тканями, мы затем продолжили определить, есть ли различия в их пространственно-временного распределения может объяснить разницу в их ответах на PDBu стимуляции.
<Р> Рисунок 3 показать immuohistochemical результаты для распределения PKCα в продольных и кольцевых слоев глазного дна и антрального. При покоящихся условиях в спокойном решение, когда нет генерацией сил в ткани, то PKCα, как представляется, однозначно распределены преимущественно вблизи периферии SMCs (рис. 3-зеленого цвета, PSS). Стимуляция тканей с 1 мкМ ЦХ (3 ') или 1 мкМ PDBu (10 и 30') не меняет этого периферическое распределение PKCα. Отношение распределения PKCα вблизи плазматической мембраны относительно общего клеточного PKCα использовали для количественной оценки возможных изменений в распределении этого белка в этих различных условиях. На рисунке 4 показаны результаты, как отношение к PKCα на периферии клетки по отношению к общему PKCα, присутствующих в клетке (периферийная /(периферический + цитозоле), приведены в разделе Методы). Отношение 0,5 указывало бы на "равномерное распределение" белка по всей клетке. Отношение PKCα (периферическая /всего) колебался от 0.64-0.68 в исследовали все условия. Эти величины значительно больше, чем 0,5 (р &ЛТ; 0,05), что указывает на PKCα расположена главным образом на периферии клетки (не "равномерно" распределен в клетке), и что это распределение не изменяется между расслабленными или стимулированных условиях <. BR>
<р> в основном периферийное распределение PKCα (при обоих расслабленных и стимулированных условиях) и ИВК-17 (после 30 'стимуляции с помощью ЦХ или PDBu) не однородна по периферии клетки, но точечное в распределении (рис. 6). Существует также распределение пунктате анатомически и функционально различных слипчивых соединений и caveoli на плазматической мембране SMC [26]. Для того, чтобы определить, является ли распределение PKCα и CPI-17 на мембране соответствует образцу пунктате слипчивых соединений, мы сделали двойную маркировку с двумя адгезионные контакты ассоциированных белков, винкулина и Талин. Альтернативный картина распределения красного и зеленого флуорофоров на мембранах показывают, что PKCα и CPI-17 не совместно локализовать либо винкулина или Талин (рис. 6), предполагая, что PKCα и CPI-17 не связывают с адгезионные контакты комплекс в условиях, которые мы исследовали. Поскольку caveoli чередуются с слипчивых соединений в периферийной мембране [26], PKCα и CPI-17 могут совместно локализовать с caveoli. Для того, чтобы определить, является ли распределение пунктированные из PKCα и CPI-17 на мембране соответствует образцу точечными из caveoli, мы также сделали двойную маркировку PKCα с кавеолином. Распределение PKCα и кавеолина ко-локализуются на мембране в обоих расслабленных и активированных условиях, как может наблюдалось появления желтого /оранжевого флуоресценции, а не отдельной красной и зеленой флуоресценции (рис. 6). Два хвостами F-тест для равенства двух стандартных отклонений (ДСН) определяется значительно более низкую SD в соотношении кавеолином к PKCα по сравнению с SD соотношения винкулина к PKCα (п = 20 клеток; р &л; 0,05) , Кроме того, двойная маркировка PKCα с ИВК-17 после активации ткани также показывает значительное совместной локализации (п = 20 клеток, p ≪ 0,05) этих двух белков вблизи плазматической мембраны (рис.7.). Эти данные показывают, что PKCα в основном локализованы вблизи caveloi на плазматической мембране SMC во все времена, и что после активации тканей, значительную часть цитозольной CPI-17 транслоцируется в caveoli в плазме, где он со-локализуется с PKCα.
<р> Гладкие мышечные ткани обычно характеризуется либо как "тонизирующее" (генерируя медленно поддерживается изометрическое сокращение) или "фазовое" (генерации быстрых переходных процессов изометрическое сокращение). Формирование сил и /или укорочение ткани в СМ, как полагают, требуют повышенной легкой цепи миозина фосфорилирования, АТФ потребления и перекрестного велосипедного моста. Возможный механизм, ответственный за этих двух типов сокращений является дифференциальной Са 2 + сенсибилизация. Ca 2 + сенсибилизация в гладких мышцах, как полагают, в значительной степени быть связано с торможением МЛКП одновременно с или после активации MLCK во время активации ткани [15], [35]. Одним из основных путей предложили участвовать в Са 2 + сенсибилизация через G-белками рецепторов (GPCR) /фосфолипазы С (PLC) /диацилглицерина (DAG) /ПКС /ИВК-17 для ингибирования МЛКП. ХВГФ х, ПЛК, и ДАГ все расположены в /в плазматической мембране. Расположение МЛКП является менее определенным, но в какой-то момент времени после активации ткани МЛКП должен быть связан с MLC <суб> 20 на миозина молекулы толстых нитей, чтобы дефосфорилировать этот белок. Поскольку толстые нити, как сообщается, будут распределены по всему SMC цитоплазме [36], [37], [38], [39], МЛКП также должны быть распределены по всей цитоплазме в какой-то момент во время релаксации [40]. Если МЛКП находится в цитозоле и вблизи MLC <югу> 20 при сжатии, и PKCα и CPI-17 играют определенную роль в подавлении МЛКП при сжатии, то, по крайней мере, CPI-17, как ожидается, будет расположен в цитозоле на какое-то время во время сокращения. Результаты данного исследования показывают, что PKCα преимущественно локализована вблизи плазматической мембраны во время расслабленных и активированных условиях и что ИВК-17 также предпочтительно локализованы вблизи плазматической мембраны во время активированными условиях. Таким образом, эти данные свидетельствуют о том, что различия в PKCα- CPI-17 Ca 2+ сенсибилизация путь не может объяснить тонизирующий и фазовые сокращения SM в глазном дне желудка и антральном и дальнейшей работы требуется, чтобы определить, как пространственно-временное распределение CPI- 17 с активацией ткани может регулировать МЛКП вызывать Са 2 + сенсибилизация SM сжатия в неповрежденные ткани СМ.
<р> в то время как PDBu вызывает медленное сокращение в глазном дне, который ~40% от индуцированной пиковой силы KPSS , мало усадка генерируется в антральном с PDBu стимуляции. Так как фундус и антрума представляют собой два основных типа гладких мышц, тонизирующее и фазическими соответственно, вполне логично приписать разницу в генерации силы для различных свойств фазическими и тонической мышцы. Woodsome и др [41] сообщили, что уровень экспрессии CPI-17 в тонической сосудистой СМ выше, чем в стадийного сосудистой СМ. Это могло бы объяснить различную способность тонических мышц для поддержания силы (высокая концентрация CPI-17 ингибирует МЛКП позволяет MLC <суб> 20 фосфорилирования оставаться высокими и сила, которая будет поддерживаться в тонизирующей SM). Это исследование изучило экспрессию белка PKCα и CPI-17 и распространение в висцеральной свиного желудка. К нашему удивлению, нет существенной разницы в уровне экспрессии белка согласно PKCα или CPI-17 не было обнаружено между глазного дна и антрального отдела (рис. 2).
Инфекция SARS-CoV-2 продлевает выделение вируса и потерю лимфоцитов у онкологических больных
Микробы легких могут помочь предсказать исходы у тяжелобольных
Вперед, продолжать,
Тяжелые осложнения COVID-19, связанные с нарушением кишечного барьера
Новый инструмент для расшифровки микробиома кишечника
Ученые извлекли полный геном человека из «жевательной резинки» возрастом тысячи лет.
Страны с более старым населением имеют более высокий уровень инфицирования и смертности от SARS-CoV-2,
говорит исследование Прошло больше года после начала пандемии коронавирусного заболевания 2019 (COVID-19), вызванный тяжелым острым респираторным синдромом коронавирусом 2 (SARS-CoV-2), Стало очевидны
Новое исследование определяет связь между микробиомом кишечника и инсультами.
Недавнее исследование, проведенное в клинике Кливленда, демонстрирует влияние диеты с высоким содержанием холина, который часто содержится в большом количестве в красном мясе и яичных желтках, и триме
Отметка потенциальных молекулярных предикторов ответа на биологическую терапию при язвенном колите
Некоторые люди, страдающие заболеваниями кишечника, такими как язвенный колит, не реагируют на традиционно используемые биологические методы лечения. В таких случаях, персонализированный прогноз терап