PLoS ONE: Tonic en Fasische gladde spiercontractie is niet geregeld door de PKCa - CPI-17 Weg in Swine Maag Antrum en Fundus

Abstract

Regulering van myosine lichte keten fosfatase (meerlagenleidingsysteem) via proteïne kinase C (PKC) en de 17 kDa PKC-versterkt remmer van myosine lichte keten fosfatase (CPI-17) is gemeld als een Ca ^{2+ sensibilisatie signaleringsroute in glad spierweefsel (SM), en derhalve kunnen worden betrokken bij tonic vs. fasische contracties. Deze studie onderzocht de eiwitexpressie en de ruimtelijke en temporele verdeling van PKCa en CPI-17 in intacte SM weefsels. KCl of carbachol (CCH) stimulering van tonic maag fundus SM genereert een aanhoudende krimp, terwijl de driefase maag antrum genereert een tijdelijke krimp. Bovendien, de tonica fundus genereert relatief grotere kracht dan fasische antrum met 1 uM forbol 12, 13-dibutyraat (PDBu) stimulering die wordt gerapporteerd aan de PKCa activeren - CPI-17 route. Western blot-analyses toonden aan dat deze contractiele verschil werd veroorzaakt door een verschil in de eiwitexpressie van PKCa of CPI-17 tussen deze twee weefsels. Immunohistochemische resultaten tonen aan dat de verdeling van PKCa in de longitudinale en circulaire lagen van de fundus en het antrum niet verschillen, zijn voornamelijk gelokaliseerd nabij de SM celplasmamembraan. Stimulering van beide weefsel met 1 uM PDBu of 1 uM CCH doet niets af aan deze perifere PKCa distributie. Er zijn geen verschillen tussen deze twee weefsels van de CPI-17 verdeling, maar anders dan de PKCa distributie, CPI-17 lijkt diffuus zijn verdeeld over het cytoplasma onder ontspannen weefsel omstandigheden maar verschuift naar een eerste randapparaat verdeling in het plasmamembraan met stimulatie van de weefsels met 1 uM PDBu of 1 uM CCH. Resultaten uit dubbele binding vertoont dat noch PKCa noch CPI-17 co-lokaliseren de adherens knooppunt (vinculin /talin) en het membraan maar ze co-lokaliseren met elkaar en met caveoli (caveolin) aan het membraan. Dit gebrek aan verschil suggereert dat de PKCa - CPI-17 route is niet verantwoordelijk voor de tonic vs. fasische contracties waargenomen in de maag fundus en het antrum}

Visum: Zhang Y, Hermanson ME, Eddinger TJ (2013) Tonic. en Fasische gladde spiercontractie is niet geregeld door de PKCa - CPI-17 Weg in Swine Maag Antrum en Fundus. PLoS ONE 8 (9): e74608. doi: 10.1371 /journal.pone.0074608

Editor: Wenhui Hu, Temple University School of Medicine, de Verenigde Staten van Amerika

Ontvangen: 13 maart 2013; Aanvaard: 4 augustus 2013; Gepubliceerd: 18 september 2013

Copyright: © 2013 Zhang et al. Dit is een open-access artikel gedistribueerd onder de voorwaarden van de Creative Commons Attribution License, die onbeperkt gebruik, distributie en reproductie maakt in elk medium, op voorwaarde dat de oorspronkelijke auteur en de bron worden gecrediteerd

Financiering:. Dit werk werd gesteund door de National Science Foundation (NSF), Biologische Wetenschappen Departement en de Graduate School, Marquette University. De financiers hadden geen rol in de studie design, het verzamelen van gegevens en analyse, besluit te publiceren, of de voorbereiding van het manuscript

Competing belangen:.. De auteurs hebben verklaard dat er geen tegenstrijdige belangen bestaan ​​

Introductie

Het mechanisme (s) het bepalen van tonic (aanhoudende) vs. driefase (transient) gladde spier (SM) contracties blijft onopgelost. Diverse innervatie en circulerende signaalmoleculen in aanvulling op unieke receptor en eiwitten (isovorm) expressie en intracellulaire signaalwegen de zaak ingewikkelder. Niet onverwacht, er meerdere voorgestelde hypothesen tonische werking onderhoud in SM waaronder verklaren: slowly- of niet-fietsen gladde spier myosine cross-bruggetjes vergrendeling bruggen [1], [2], [3], [4]; werving van niet-spier myosine II [5], [6], [7]; vorming van caldesmon of calponine afhankelijke actine-myosine tot verknopingen [8], [9]; vorming van het cytoskelet-force dragende structuren [10], [11], [12]; en regulering van myosine LC _{20 fosforylering via second messenger pathways invloed myosine lichte keten kinase (MLCK) en lichte keten van myosine fosfatase (meerlagenleidingsysteem) activiteit [13], [14], [15], [16], [17] , [18]. Deze laatste categorie is van belang vanwege de gerapporteerde differentiële expressie, lokalisatie en de regulering van deze tweede boodschapper eiwitten in diverse SM weefsels. Variabele regeling van MLCK en MLCP activiteit kan niet alleen een middel om Ca ^{2+ sensibilisatie, maar ook een mogelijk mechanisme voor tonische contractie vs. driefase. Inactivatie van MLCP via de PKCa -CPI-17 route zou het mogelijk maken onderhouden hoge myosine lichte keten (MLC 20) fosforylering en aldus een aanhoudende contractiekracht. Een niet MLCP inactiveren zou verminderen MLC 20 fosforylering en kracht, wat resulteert in een voorbijgaande samentrekking. Maag fundus SM genereert een tonicum (vertraagde) contractie terwijl maag antrum SM genereert een driefase (tijdelijke) krimp in reactie op verschillende stimuli.}}

Ca ^{2+ sensibilisatie, waarbij de activering van G- impliceert -eiwit gekoppelde second messenger pathways dat de contractiele eiwitten bewust te maken [Ca 2 + _{i] door het remmen meerlagenleidingsysteem, kan plaatsvinden door een van de vele paden. Een van de gerapporteerde wegen voor remming van MLCP verrichten welke proteïne kinase C /C-kinase geactiveerd PP1 remmer eiwit van 17 kDa (PKC /CPI-17) pathway [19], [20]. G-eiwit gekoppelde receptoren (GCPR) activering resulteert in de activering van fosfolipase C (PLC), hydrolyseert fosfatidylinositol 4,5-bisfosfaat (PIP 2) inositol 1,4,5-trifosfaat produceren (IP 3) en diacylglycerol (DAG). DAG is bekend dat PKC die fosforylering van CPI-17 voor de selectieve inhibitie veroorzaken MLCP activeren (besproken voor viscerale SM in [17]). PKC wordt verondersteld te worden geregeld door de activering en ruimtelijke verdeling binnen de cel, welke laatste gecontroleerd door het verankeren van eiwitten die binden aan en beperken de locatie van PKC tot specifieke gebieden van de cel [21], [22]. Bijvoorbeeld meldingen van constitutief actieve L-type Ca 2 + kanalen en hun regulatie van PKC [23], [24] suggereert dat PKC is gelokaliseerd nabij het membraan in gladde spiercellen. De cellulaire functie van de CPI-17 in de cel zou kunnen variëren, afhankelijk van het niveau van eiwit expressie, en of het ligt in de buurt van het plasmamembraan, waar PKCa is gevestigd /geactiveerd, of in verband met de contractiele myosine dikke filamenten, waar meerlagenleidingsysteem zou worden gevestigd op de -phosphorylate myosine lichte keten 20 (MLC 20).}}

De expressie van PKCa en CPI-17 en hun ruimtelijke en temporele herverdeling op weefsel activering zijn in Ca voorgesteld ^{2 + sensibilisatie van het gladde spierweefsel (ter beoordeling [14], [15], [16], [17]). Zo is het mogelijk dat de verschillen in hun expressie en cellulaire lokalisatie /translocatie betrokken kunnen worden bij het bepalen van tonic vs. driefase contractie reacties. Voor deze twee eiwitten een deel van een route die betrokken is bij het remmen van MLCP activiteit tijdens weefsel activering en waardoor voor een tonische of fasische respons, moeten ze worden uitgedrukt op passende niveaus en gepositioneerd op de juiste plaats in de cel op het juiste tijdstip. Omdat PKC wordt geactiveerd door DAG (a membraangebonden fosfolipide), moet het ook in het membraan tenminste tijdelijk om dit te laten gebeuren. Als CPI-17 zal de MLCP weerhouden defosforyleren MLC _{20 op de dikke filamenten, CPI-17 op een gegeven moment moet in het cytosol geassocieerd met de dikke filamenten aanwezig zijn. Met deze twee stappen plaatsvindt in twee ruimtelijk afzonderlijke gebieden van de cel, een of beide eiwitten te transloceren naar het andere gebied voor hen te communiceren en vul het pad.}}

Het doel van deze studie was het testen de hypothese dat de PKCa - CPI-17 Ca ^{2+ sensibilisatie route is betrokken bij het bepalen tonic (vertraagde) en fasische (transient) contractiele responsen in gladde spieren. Om dit te doen hebben we de proteïne-expressie en de ruimtelijke en temporele verdeling van PKCa en CPI-17 in de driefase maag antrum en tonic maag fundus onder ontspannen en geactiveerd omstandigheden. De resultaten tonen geen significant verschil in expressie van een van deze twee eiwitten, noch in de perifere verdeling tussen beide weefsels inconsistent met de hypothese dat de PKCα- CPI-17 Ca 2+ sensibilisatie route is bepalend voor de tonic vs. fasische contractiele responsen waargenomen in deze weefsels.}

Methods

organen en weefsel Handling

Swine weefsels (magen) werden verkregen van Hansen Meat service (Franksville, WI) en zet in koude fysiologische zoutoplossing (PSS, (in mm): 140,1 NaCl, 4,7 KCI, 1.2 Na _{2HPO 4, 2,0 MOPS (pH 7,4), 0,02 Na 2EDTA, 1,2 MgSO 4, 1,6 CaClz 2 en 5,6 glucose). Magen werden ontdaan van bloed, losse bindweefsel, en in sommige gevallen, de slijmvliezen en direct ingevroren of opgeslagen in PSS in de koelkast 0-2 dagen. Sommige organen waren vers bevroren zo spoedig mogelijk na post-mortem (60-90 minuten). Sommige organen werden in PSS en /of gestimuleerd met 1,0 uM CCH of PDBu (Sigma) bij 37 ° C gedurende verschillende tijdstippen voor het invriezen. Variabele incubatietijden agonistische concentraties werden ook getest. Voor immunohistochemie werd al weefsel ingevroren bewaard totdat coupes en een immuunreactie. Invriezen in alle gevallen omvatte het plaatsen van stukjes weefsel of stroken weefsel in isopentaan gekoeld in vloeibare stikstof gevolgd door opslag bij -80 ° C. Vijf tot zes micrometer secties van de bevroren weefsels werden gesneden op een Leica CM1900 cryostaat, pakte op glasplaatjes en bevroren opgeslagen (0-1 dagen) tot een immuunreactie.}

immuunreacties en reagentia

De antilichamen die werden verkregen uit de volgende bronnen: PKCa (H-7 en C-20) en CPI-17 (H-60) uit Santa Cruz Biotech, Santa Cruz CA; Vinculin en Talin van Sigma, St. Louis, Missouri; Caveolin 1 van BD Biosciences, San Jose, CA; Cy2 en Cy3 ezel anti-muis of konijn secundaire's van Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA; Alexa Fluor 594-phalloidin en DAPI van Molecular Probes, Eugene, OR. Al deze antilichamen zijn eerder in ons laboratorium voor immunohistochemie en Western blotting waar specificiteit vertonen voor een band van het juiste molecuulgewicht voor het betreffende eiwit vermelde [25], [26], [27]. Negatieve controles waarin het primaire antilichaam niet is inbegrepen vertonen geen reactiviteit van deze banden en geen immunofluorescentie op weefselcoupes.

bevroren weefselcoupes opgehaald op glasplaatjes werden ontdooid bij kamertemperatuur en vervolgens gefixeerd met 2% paraformaldehyde gedurende 10 minuten gepermeabiliseerd in 0,5% Triton X-100 gedurende 10 minuten geblokkeerd met 5 mg /ml BSA gedurende 1 uur voorafgaand aan reactie met het primaire antilichaam overnacht (4 ° C) en daarna het geschikt secundair antilichaam gedurende één uur bij kamertemperatuur. Na het tweede antilichaam, werden de weefsels geïncubeerd met DAPI (0,5 uM), phalloidin (10-50 nM) of DAPI /falloïdine als geschikt voor het kleuren van kernen en /of filamenteus actine. Meerdere wasbeurten werden gebruikt na de primaire en secundaire incubatie, en de tegenkleuring. Cover glazen werden gemonteerd met behulp van gebufferde 75% glycerol met 0,2% n-propylgallaat te minimaliseren vervagen. Alle immuunreactie oplossingen werden gemaakt in PBS-Tween [(in g /l: NaCl 8,0, KH _{2PO 4 0.2, Na 2HPO 4 1.15, KCl 0,2,), 1% tween- 20, pH 7,4] met 0,1% BSA. Negatieve controles inclusief 0,1% BSA, zonder het primaire antilichaam, en toonde geen immuunreactie.}

Microscopie

Secties werden waargenomen met behulp van een Olympus IX70 microscoop met epifluorescentie verlichting. Digitale foto's zijn gemaakt met een 16 bit Princeton Instruments (Princeton, NJ) CCD-camera, bestuurd door middel van een PCI-kaart via IPlab voor Windows op een PC (Ver 3.6, Scanalytics;. Fairfax, VA). Beelden werden genomen met behulp van een 100 x (1.3 NA) of 60 × (1,25 NA) olie lens of een 40 × (0.9 NA) lucht lens en opgeslagen op de PC. Emissie filters gebruikt waren 405, 490 en 570 nm. Secties werden bekeken ook met een Nikon confocale microscoop (Nikon A1 confocale Eclipse Ti). De gebruikte doelstellingen waren 100 × (1.4 NA) olie lens op 425, 488 en 561 nm. Vergelijkbare resultaten werden waargenomen in immunofluorescentie distributies het gebruik van deze twee verschillende systemen.

Image Analysis van Verdeling van PKC /CPI-17 van individuele cellen in weefsels

Profielen van fluorescentie-intensiteit werden genomen voor individuele cellen in dwarse weefselcoupes. Secties werden waargenomen bij lage vergroting (10-20x) gebieden van het zichtbare artefacten te vermijden (weefsel vouwen, vorstschade, etc). In een artefact vrij gebied is de vergroting verhoogd tot 40-100x en foto's werden genomen bij deze hogere vergrotingen. Drie verschillende gebieden binnen een weefsel sectie werden gekozen om foto's te nemen. Z-stack series werden afzonderlijk voor elk van de drie kleurkanalen gebruik genomen. 1 pm dikke Z-profielen werden genomen, en 15-25 Z-profielen werden genomen voor elk weefsel sectie (cijfers S1 & S2 tonen Z-stack voorbeelden van CPI-17 immunoreactiviteit in antrum met en zonder weefsel activering). Elke Z-stack-serie werd onderzocht voor elke sectie om het beeld z in het midden te identificeren, en dit beeld werd omgezet tot het dossier, die op een pc om de gegevens te analyseren om NIS-Elements AR 3,0 (Nikon) werd geïmporteerd a.bmp.

Profielen van PKCa en Phalloidin fluorescentie-intensiteit werden verkregen voor individuele cellen in transversale weefselsecties. Een lijn werd getrokken over het midden van het beeldveld. Ten cellen doorkruist door de lijn werden geselecteerd voor de metingen. Gebaseerd op eigen protocollen [25], de eerste vijf pixels (~0.7 um) ter weerszijden van de cel waar de phalloidin intensiteit sterk toe vanaf de uitgangswaarde werden gedefinieerd als de omtrek van de cel. Voor cytosolische metingen, werd een lijn ten minste 2 micrometer afstand geplaatst van de cel periferie. Intensiteitsmetingen werden gemaakt met behulp van een interessegebied (ROI) ongeveer in het midden van de cel (bij cytosolische metingen), of langs het membraan van de cel (perifere metingen). Consistentie, wordt de grootte van de ROI constante voor de perifere en cytosolische metingen gehouden. Cellen in het gedeelte met kleine diameter (niet kunnen cytosolische ROI tenminste 2 urn meten van de omtrek) of kernen aanwezig (toegankelijk DAPI kleuring waarbij ruimtelijke beperkingen en perinucleaire organellen kan de verdeling verwarren) uit de analyse uitgesloten. Voor PKCa, de verhouding van de gemiddelde intensiteit van PKCa aan de omtrek via totale PKCa intensiteit (som van PKCa intensiteit van ROI aan de omtrek en ROI cytosol) werd gebruikt. Ten cellen per veld en drie verschillende gebieden werden onderworpen aan de meting voor gegevensanalyse per weefselgebied, d.w.z. dertig cellen werden geteld en gemiddeld voor elk monster (n = 1). De uiteindelijke steekproefomvang is n = 5. Dezelfde procedures werden toegepast om de intensiteit van CPI-17 te meten, behalve dat slechts een gebied van 10 cellen gebruikt voor elk monster (n = 1), met een uiteindelijke steekproefomvang van n = 3.

Mechanische Metingen

Vlak voor het gebruik, werden weefsel reepjes gesneden en vastgeklemd aan elk uiteinde, met de klemmen bevestigd tussen haken op een stationaire metalen staaf en een isometrische krachtopnemer (Harvard Apparatus, Holliston, MA), in PSS borrelen met 95% O _{2/5% CO 2 in watermantel spier kamers (Radnoti Glass Technology, Monrovia, CA) bij 37 ° C. De lengte van elke strook werd gevarieerd door het herpositioneren van de stationaire metalen staaf.}

glad spierweefsel strips (maag antrum en fundus) werden geëquilibreerd gedurende 1 uur en uitgerekt tot een passieve spanning benadert Lo middels een verkorte lengte-spanning curve . Om weefsels te contracteren, werd PSS vervangen door K ^{+ - PSS (109 mM KCl wordt vervangen door iso-osmotisch voor NaCl) [28]. De spierstrips werden geactiveerd herhaaldelijk met strekken van het weefsel tussen de activering, totdat piekkracht niet langer een aanzienlijke stijging ten opzichte van het vorige krimp liet zien. Chambers werden driemaal gespoeld met PSS na elk weefsel activering. Ten minste twee opeenvolgende herhaalbare K + - PSS contracties werden gebruikt om een ​​standaardkracht spoor met een 10 minuten rust tussen elke contractie voordat de proef begon. De weefsels werden vervolgens geactiveerd met 1 uM carbachol en ontspannen weer, zoals werd uitgevoerd bij K + - PSS contracties. Latere contracties alles inclusief 1 uM fentolamine en propranolol blokkeren α- en β - adrenerge receptoren respectievelijk. Naar aanleiding van de laatste 1 uM CCH contractie en wassen, werden de weefsels geactiveerd met 1 uM PDBu hun mechanische respons op te nemen.}

Analyse van Force gegevens

Spanning signalen van krachtopnemers werden gedigitaliseerd door PowerLab 400 of 4 SP hardware (ADInstruments, Castle Hill, Australië) gevisualiseerd op een computerscherm (grafiek v3.6 of 4,0, ADInstruments) als kracht (g) bij 10 Hz en opgeslagen door de programmatuur een harde schijf voor latere analyse. De cijfers werden gemaakt met het spreadsheetprogramma Excel 2000 (Microsoft, Redmond, WA).

Gel Elektroforese en Western Blotting

Eiwit expressie werd geanalyseerd zoals eerder [29] beschreven. Weefsels werden gehomogeniseerd bij 50 mg /ml in 0,125 M Tris, 2% natriumdodecylsulfaat (gew /vol), 20% glycerol, 0,1% broomfenolblauw (gew /vol) en 20 mM dithiothreitol. Eiwitten werden gescheiden op lage verknoping natriumdodecylsulfaat gels [30] en immunoblotting werd uitgevoerd zoals eerder beschreven [31]. De PKCa antilichaam herkend ofwel een enkele band of vaker een doublet bij ~76 kD, terwijl de CPI-17 antilichaam herkende een enkele band bij ~17 kD. Deze afmetingen komen overeen met de verwachte grootte voor deze eiwitten op basis van gelmobiliteit. Om de nauwkeurigheid van de westelijke vlekken te garanderen, werden geladen curves gedaan voor zowel de maag fundus en het antrum monsters over een 5-voudige aanbod van ladingen (4-20 pi) voor actine (Coomassie-blauw-kleuring) en PKCa en CPI-17 (western blotting) . De resultaten toonden een lineair verband in dit bereik voor alle drie eiwitten Beide weefsels (R ^{2 > 0,98 voor alle resultaten, n = 3). Kwantificering van PKCa en CPI-17 eiwitexpressie werd gedaan op western blots met behulp van 5-10 ul belastingen dat was binnen deze lineaire bereik (n = 6).}

Statistieken

Statistische vergelijkingen werden uitgevoerd met behulp van MINITAB (Minitab Inc. State College, PA). Een one sample t-test werd gebruikt om de verdeling van PKCa /CPI-17 testen (een perifeer totale rendement van 0,5 geeft een "uniform" verdeling van gladde spiercellen (SMC)) in het antrum en fundus onder rusttoestand. One way ANOVA werd uitgevoerd om te testen op PKC /CPI-17 verdeling verschillen de twee weefsels met verschillende stimulerende parameters. Two sample t-tests werden gebruikt om de betekenis van verschil expressieniveau van PKCa of CPI-17 in antrum en fundus te testen. Een tweezijdige F-test voor gelijkheid van twee standaarddeviaties (SD's) bepaald significant lager SD in verhouding tot caveolin PKCa vergelijking met de SD van de verhouding van vinculin aan PKCa. Een waarde van P < 0,05 werd beschouwd als significant voor alle statistische tests. Geen statistische tests werden uitgevoerd op de krachtgegevens en figuur 1 representeert soortgelijke gegevens van 6 verschillende dieren. Western blot gegevens van zes dieren. PKCa distributie data is gemiddeld dertig cellen gemeten per dier en vijf dieren getest. CPI-17 verdelingsgegevens is gemiddeld 10 cellen gemeten per dier en drie dieren getest. Eiwit co-localisatie geeft de een 'n' van ten minste 20 cellen uit ten minste 3 dieren.

Resultaten

Swine maag fundus is vooral tonic glad spierweefsel dat reageert op stimulatie met een aanhoudende krimp tijdens het antrum een ​​driefase hoofdzakelijk glad spierweefsel dat reageert op stimulatie met een voorbijgaande contractie (fig. 1). In weefsels die reacties waarschijnlijk het resultaat van directe stimulatie van de gladde spier toevoeging van 1 uM propranolol (β agonist blokker) en fentolamine (α blokker agonist) gebruikt voor activering van adrenerge receptoren voorkomen vanwege mogelijke afgifte van sympathische neurotransmitters. Stimulatie van gladde spieren met PDBu wordt routinematig gebruikt om de gladde spieren samentrekken via PKC activering [32], [33], [34] veroorzaken. Een uM PDBU veroorzaakt een kleine langzame krimp in de maag fundus strips (~ 40% van de K ^{+ stimulatie respons), terwijl de antrum toont in wezen geen respons (< 5% K + stimulatie) (afb. 1). Het verschil tussen de vertraagde en tijdelijke responsen van deze twee weefsels KPSS en CCH, en de aanwezigheid of afwezigheid van een contractiele respons op PDBu stimulatie kan worden veroorzaakt door de expressie en /of ruimtelijk-temporele spreiding van de stroomafwaartse second messengers (PKCa en CPI-17) die beweerde belast MLCP remming met PDBu stimulatie te zijn. Om deze studie maten we de expressieniveaus en bepaalden de ruimtelijk-temporele spreiding van PKCa en CPI-17 in deze weefsels.}

Figuur 2 toont Western blot resultaten voor de expressie van CPI-17 en PKCa in de maag antrum en fundus. Weefsels werden verwerkt controle voor eiwitconcentratie, en de resultaten werden berekend op basis van de intensiteit van het respectievelijke eiwit-signaal en genormaliseerd op actine eiwitexpressie (Fig. 2). Beide methoden (alleen genormaliseerde data getoond) bleek dat noch de expressie van CPI-17 eiwit noch die van PKCa eiwit significant verschillend (p > 0,23 & p > respectievelijk 0,28, n = 6) bij het vergelijken van deze twee SM weefsels. Controles werden uitgevoerd met behulp van een reeks van belastingen om het bereik van lineariteit van het laden te bevestigen, en dat monsters gebruikt voor de kwantificatie waren binnen dit bereik (gegevens niet getoond, zie methoden). Omdat er geen verschillen in de expressie van deze twee eiwitten tussen deze twee weefsels, we vervolgens overgegaan om te bepalen of verschillen in hun ruimtelijke-temporele het verschil in hun reactie op stimulatie PDBu kon verklaren.

Figuur 3 toon immuohistochemical resultaten voor de distributie van PKCa in de longitudinale en circulaire lagen van de fundus en het antrum. Onder rusttoestand in ontspannen oplossing wanneer er geen kracht genereren door het weefsel, de PKCa blijkt uniek voorkeur worden verdeeld nabij de omtrek van de SMC (fig. 3 groene kleur, PSS). Stimulatie van het weefsel met 1 uM CCH (3) of 1 uM PDBu (10 en 30) niet de perifere verdeling van PKCa veranderen. De verhouding van de verdeling van de PKCa dichtbij de plasmamembraan opzichte van totaal cellulair PKCa werd gebruikt om mogelijke veranderingen in de verdeling van het eiwit onder deze verschillende omstandigheden te kwantificeren. Figuur 4 toont de resultaten als de verhouding van de PKCa de celperiferie opzichte van het totale PKCa in de cel (perifere /(perifere + cytosol), zie methoden). Een verhouding van 0,5 zou een "uniform" verdeling van het eiwit in de gehele cel geven. De verhouding PKCa (perifere /totaal) varieerde 0,64-0,68 in alle onderzochte omstandigheden. Deze waarden zijn aanzienlijk groter dan 0,5 (p < 0,05), wat aangeeft dat PKCa zich vooral op de cel periferie (het is niet "uniform" verdeeld in de cel) en dat deze verdeling niet verandert tussen de ontspannen of gestimuleerde omstandigheden <. br>

Omdat PKCa wordt voorgesteld om CPI-17 te activeren, gingen we naar de ruimtelijke en temporele verdeling van de CPI-17 in deze weefsels onder soortgelijke omstandigheden vast te stellen. Figuur 5 tonen immuohistochemical resultaten voor de distributie van CPI-17 in de longitudinale en circulaire lagen van de fundus en het antrum. Onder rusttoestand in ontspannen oplossing wanneer er geen kracht genereren door het weefsel, de CPI-17 lijkt diffuus zijn verdeeld over de SMC (fig. 5- PSS, afb. S1). Stimulatie van het weefsel met 1 uM CCH (30) (niet 1 uM CCH voor 3 ', gegevens niet getoond) of 1 uM PDBu (30) resulteert in een significante verandering in deze verdeling zodanig dat de CPI-17 nu verschijnt worden voornamelijk aan de rand van de cel in een verdeling vergelijkbaar met die waargenomen voor PKCa (fig. 5, fig. S2). De verhouding van de verdeling van de CPI-17 vlakbij het plasmamembraan verhouding tot totaal CPI-17 (perifere cytosolische +) werd gebruikt om mogelijke veranderingen in de verdeling van het eiwit onder deze verschillende omstandigheden te kwantificeren. Figuur 4 toont de resultaten als de verhouding van perifere naar totale CPI-17. De CPI-17 ratio (perifere /totaal) varieerde 0,49-0,67 in alle weefsels en voorwaarden onderzocht. De verhouding van CPI-17 perifere /totaal in ontspannen omstandigheden is niet significant verschillend van 0,5 (0,49-0,5 betekent; P > 0,19) dat de CPI-17 diffuus verdeeld over de gladde spiercellen onder deze omstandigheden. Dit verandert niet na 3 'van 1 uM CCH stimulatie omdat er nog steeds geen significant verschil ten opzichte van de ontspannen omstandigheden (betekent = 0,53-0,55; p > 0,05), met uitzondering van de fundus weefsels waar de CPI-17 perifere /totaal verhouding significant groter (p < 0,05) en 3 '(fig. 4). Met 30 "van hetzij 1 uM CCH of 1 uM PDBu stimulatie, de CPI-17 vergoeding is aanzienlijk groter dan 0,5 voor alle weefsels en lagen (middelen = 0,62-0,67, P < 0,01), wat aangeeft dat CPI-17 nu vooral ligt de cellen periferie (het is niet langer "uniform" verdeeld over de cel), vergelijkbaar met de verspreiding van PKCa (fig. 4).

de eerste perifere verdeling van PKCa (onder zowel comfort en gestimuleerde omstandigheden) en CPI-17 (na 30 'stimulatie met CCH of PDBu) niet uniform in de cel periferie, maar gestippelde distributie (fig. 6). Er is ook een gestippelde distributie van de anatomisch functioneel verschillende contactplaatsen en caveoli de SMC plasmamembraan [26]. Om te bepalen of de verdeling van de PKCa en CPI-17 op het membraan overeen met de gestippelde patroon van contactplaatsen, hebben we dubbele labeling met twee adherens knooppunt geassocieerde eiwitten, vinculine en taline. De alternatieve verdelingspatroon van de rode en groene fluoroforen op de membranen blijkt dat de PKCa en CPI-17 geen co-lokaliseren met ofwel vinculin of Talin (fig. 6), wat suggereert dat de PKCa en CPI-17 niet associëren met de adherens knooppunt complex onder de voorwaarden die wij onderzocht. Omdat caveoli afgewisseld met de adherens kruispunten op de perifere membraan [26], PKCa en CPI-17 kunnen samen lokaliseren met de caveoli. Om te bepalen of de gestippelde verdeling van de PKCa en CPI-17 aan het membraan overeen met de gestippelde patroon van de caveoli, we hebben ook een dubbele etikettering van PKCa met caveolin. De verdeling van PKCa en caveolin co-lokaliseren de membraan zowel ontspannen en geactiveerde voorwaarden kan door de verschijning van de geel /oranje fluorescentie dan afzonderlijke rode en groene fluorescentie (Fig. 6) waargenomen. Een tweezijdige F-test voor gelijkheid van twee standaarddeviaties (SD's) bepaald significant lager SD in de verhouding caveolin aan PKCa vergelijking met de SD van de verhouding van vinculin aan PKCa (n = 20 cellen; p < 0,05) . Bovendien dubbele labeling van PKCa met CPI-17 na activering van het weefsel toont ook significante co-lokalisatie (n = 20 cellen; p <0,05) van deze twee eiwitten bij de plasmamembraan (fig. 7). Deze gegevens tonen dat PKCa primair gelokaliseerd bij de caveloi de SMC plasmamembraan te allen tijde en bij weefselschade activatie een belangrijk deel van het cytosolische CPI-17 zich naar de caveoli in het plasma waar het co-localiseert met PKCa.

Discussie

Gladde spieren worden routinematig gekenmerkt als zijnde ofwel "tonic" (het genereren van een langzame onderhouden isometrische contractie) of "driefase" (het genereren van een snel voorbijgaande isometrische contractie). Troepenmacht en /of weefsel verkorting in SM worden verondersteld om verhoogde myosine lichte keten fosforylering, ATP consumptie en cross brug fietsen vereisen. Een mogelijke mechanisme dat verantwoordelijk is voor deze twee soorten van de contracties is differentiële Ca ^{2 + sensibilisatie. Ca 2+ sensibilisatie gladde spierweefsel wordt aangenomen grotendeels toe te schrijven aan de remming van MLCP gelijktijdig met of na de activatie van MLCK weefsel tijdens activering [15], [35]. Een van de belangrijkste wegen voorgesteld betrokken te zijn bij Ca 2+ sensibilisatie via G-eiwit gekoppelde receptoren (GPCR) /fosfolipase C (PLC) /diacylglycerol (DAG) /PKC /CPI-17 te remmen MLCP. GPCR's, PLC, en DAG bevinden zich op /in het plasmamembraan. De locatie van de MLCP minder zeker, maar op een gegeven tijd na activatie MLCP weefsel moet worden geassocieerd met MLC _{20 op de myosine molecule van de dikke filamenten om dit eiwit defosforyleren. Omdat dikke filamenten gemeld gedurende de SMC cytoplasma [36], [37], [38], [39] te verdelen, zal het ook nodig meerlagenleidingsysteem gehele cytoplasma te verdelen op enig moment tijdens relaxatie [40]. Als MLCP ligt in het cytosol en nabij MLC 20 tijdens contractie en PKCa en CPI-17 speelt een rol bij het remmen van MLCP tijdens contractie, dan toch CPI-17 zou worden verwacht dat zich in het cytosol op een bepaald moment tijdens contractie. De resultaten van deze studie tonen aan dat PKCa voorkeur dichtbij de plasmamembraan gelokaliseerd in ontspannen geactiveerd en opdat CPI-17 is ook bij voorkeur gelokaliseerd dichtbij de plasmamembraan tijdens geactiveerd omstandigheden. Zo, deze gegevens suggereren dat de verschillen in de PKCα- CPI-17 Ca 2 + sensibilisatie route kan tonic en fasische SM contracties in de maag fundus en het antrum en de verdere werkzaamheden niet uit te leggen is nodig om te bepalen hoe de ruimtelijke en temporele verdeling van de CPI- 17 met weefsel activering kan meerlagenleidingsysteem reguleren Ca veroorzaken 2 + sensibilisatie van SM krimp in intacte SM weefsels.}}

Hoewel PDBu veroorzaakt een langzame krimp in de fundus dat is -40% van de KPSS geïnduceerde piekkracht weinig krimp wordt gegenereerd in het antrum met PDBu stimulatie. Sinds fundus en antrum twee basistypen van gladde spieren, tonic en driefase respectievelijk vertegenwoordigen, lijkt het logisch om het verschil in kracht generatie op verschillende eigenschappen van driefase-tonic spier toeschrijven. Woodsome et al [41] gemeld dat het expressieniveau van CPI-17 in tonic vasculaire SM hoger dan in driefase vasculaire SM. Dit kan het verschillende vermogen van tonische spieren te handhaven leggen (een hoge concentratie van CPI-17 remt MLCP zodat MLC _{20 fosforylering hoog blijven en kracht tonic SM te handhaven). Deze studie onderzocht PKCa en CPI-17 eiwit expressie en distributie in de viscerale varkens maag. Tot onze verbazing, geen significant verschil in het niveau van eiwitexpressie van PKCa of CPI-17 werd gedetecteerd tussen de fundus en het antrum (fig. 2).}

• PLoS ONE: Nicotine Verzwakt Activering van Tissue Resident macrofagen in de muis maag door de β2 nicotine acetylcholine Receptor
• PLoS ONE: chirurgische behandeling voor patiënten met Krukenberg Tumor van Maag Oorsprong: Clinical Outcome en prognostische factoren Analysis