Ploche ONE: Tonic a fázovým kontrakcie hladkého svalstva nie je regulovaná podľa PKCα - CPI-17 Cesta na prasacej žalúdočné dutine a Fundus

abstraktné

Nariadenie myosin light chain fosfatázy (MLCP) prostredníctvom proteín kinázy C ( PKC) a 17 kDa PKC-potencuje inhibítor myosin ľahkého reťazca fosfatázy (CPI-17) bola označená ako Ca ^{2+ senzibilizácie signálne dráhy v hladkej svaloviny (SM), a tak môžu byť zapojené do tonikum vs. fázovým kontrakcie. Táto štúdia skúmala expresiu proteínu a časopriestorovej distribúcie PKCα a CPI-17 v neporušených SM tkanivách. KCl alebo karbacholom (CCH) stimulácia tonikum žalúdočné fundus SM vytvára trvalú kontrakciu, zatiaľ čo fázovým žalúdok Antrum vytvára prechodné kontrakciu. Okrem toho, tonikum fundus vytvára väčšiu relatívnu silu než fázovým antra s 1 uM forbol-12, 13-stimulácia dibutyrate (PDBu), ktorý je uvedený pre aktiváciu PKCα - CPI-17 dráhy. Western blot analýzy preukázali, že táto kontraktilné rozdiel nebol spôsobený rozdielom v expresii proteínu PKCα alebo CPI-17 medzi týmito dvoma tkanív. Imunohistochemické výsledky ukazujú, že distribúcia PKCα v pozdĺžnych a kruhových vrstiev fundusu a antra sa nelíšia, sú prevažne lokalizované v blízkosti bunkovej plazmatické membrány SM. Stimulácia buď tkaniva s 1 uM PDBu alebo 1 uM CCH nemení toto periférne distribúcie PKCα. Neexistujú žiadne rozdiely medzi týmito dvoma tkanív pre distribúciu CPI-17, ale na rozdiel od distribúcie PKCα, objavia CPI-17, ktoré majú byť difúzne distribuovaný v cytoplazme za podmienok uvoľnené tkaniva, ale posúva sa primárne obvodové rozdelenie na plazmatické membráne so stimuláciou tkaniva s 1 uM PDBu alebo 1 uM CCH. Výsledky z dvojitého značenia ukazujú, že ani PKCα ani CPI-17 čo-lokalizovať na adhézne spojenie (vinkulin /Talinu) v membráne, ale že čo-lokalizovať medzi sebou navzájom a s caveoli (Caveolin) na membráne. Tento nedostatok rozdielu naznačuje, že PKCα - CPI-17 dráha nie je zodpovedný za pleťového krému versus fázovým kontrakcií pozorovaných v žalúdku fundus a antra}

Citácia: Zhang Y, Hermanson mi, Eddinger TJ (2013) tonikum. a fázovým kontrakcie hladkého svalstva nie je regulovaná podľa PKCα - CPI-17 Cesta na prasacej žalúdočné dutine a fundus. PLoS ONE 8 (9): e74608. doi: 10,1371 /journal.pone.0074608

Editor: Wenhua Hu, Temple University School of Medicine, United States of America

prijatá: 13. marca 2013; Prijaté: 04.08.2013; Uverejnené: 18.září 2013

Copyright: © 2013 Zhang et al. Toto je článok o otvorený prístup distribuovaný pod podmienkami Creative Commons Attribution licencie, ktorá umožňuje neobmedzené použitie, distribúciu a reprodukciu v nejakom médiu, za predpokladu, že pôvodný autor a zdroj sú pripísané

Financovanie :. Toto dielo bol podporený National Science Foundation (NSF), ministerstvo biologických vied a Graduate School, Marquette University. Platcovia mal žiadnu úlohu v dizajne štúdie, zber a analýzu dát, rozhodnutie publikovať, alebo prípravu rukopisu

Konkurenčné záujmy: .. Autori vyhlásili, že žiadne konkurenčné záujmy neexistujú

Úvod

mechanizmus (y) stanovenie tonikum (trvalé) vs. fázovým kontrakcií (prechodné) hladkého svalstva (SM), zostáva nevyriešená. Diverse inervácie a cirkulujúce signálnych molekúl okrem unikátny receptora a (izoformy) expresiu proteínu a intracelulárnych signálnych dráh skomplikovať problém. Nie neočakávane, existuje niekoľko hypotéz navrhovanej vysvetliť údržbu tonikum sila v SM vrátane: slowly- alebo non-cyklistika hladkého svalstva myozínových priečnych mostíkov zvaných západka mosty [1], [2], [3], [4]; nábor non-svalovej myozínových II [5], [6], [7]; tvorba caldesmon alebo calponin závislých aktínu-to-myozínových krížových väzieb [8], [9]; tvorba cytoskeletu síl nosných konštrukcií [10], [11], [12]; a regulácia myozínových LC _{20 fosforylácie prostredníctvom druhého posla dráh, ktoré ovplyvňujú myosin ľahký reťazec kinázu (MLCK) a myosin ľahkého reťazca fosfatázy (MLCP) činnosť [13], [14], [15], [16], [17] [18]. Táto posledná kategória je predmetom záujmu, pretože vykazovaného diferenciálnej expresie, lokalizáciu a regulácii týchto druhých poslov proteínov v rôznych tkanivách SM. Variabilná regulácia MLCK a MLCP činnosti by mohla poskytnúť nielen prostriedky pre Ca ^{2+ senzibilizácie, ale aj možný mechanizmus pre tonikum vs. fázovým kontrakcie. Inaktivácia MLCP cez PKCα -CPI-17 dráhy by umožnila udržiavané ľahký reťazec myozínových vysoká (MLC 20), fosforylácie, a tým aj trvalé sily kontrakcie. Zlyhanie na inaktiváciu MLCP zníži MLC 20 fosforylácii a silu, čo vedie k prechodnému kontrakcie. Žalúdočné fundus SM generuje tonikum (trvalé), kontrakcie, keď žalúdok Antrum SM generuje fázovým (prechodný) kontrakcie ako odpoveď na rôzne podnety.}}

Ca ^{2 + senzibilizácie, ktorý zahŕňa aktiváciu G- proteín-coupled druhého posla chodníky, ktoré vnímavosť kontraktilné proteíny [Ca 2+ _{i] tým, že inhibuje MLCP, môže dôjsť k niektorým z početných ciest. Jedna z uvedených ciest pre inhibíciu aktivity MLCP zahŕňa proteín kinázy C /C-kinázy aktivovanej PP1 inhibítor proteín o 17 kDa (PKC /CPI-17) dráhy [19], [20]. G je receptor spriahnutý s proteínom (GCPR) aktivácia vedie k aktivácii fosfolipázy C (PLC), hydrolyzuje fosfatidylinozitol-4,5-bisfosfát (PIP 2) na výrobu inositol 1,4,5-trisfosfatu (IP 3) a diacylglyceroly (DAG). DAG je známe, že aktivuje PKC, ktoré môžu spôsobiť fosforylácii CPI-17 selektívne inhibovať MLCP (preskúmaná viscerálny SM v [17]). PKC je veril byť regulovaná jeho aktiváciu a priestorového rozmiestnenia vnútri bunky, pričom tieto sú ovládané kotevné proteíny, ktoré sa viažu na a obmedzenia umiestnenie PKC k špecifickým oblastiam bunky [21], [22]. Napríklad správy o Ca 2+ kanálov konštitutívne aktívny L-typu a ich regulácia PKC [23], [24] naznačuje, že PKC je lokalizovaný v blízkosti membrány buniek hladkej svaloviny. Bunkové funkcie CPI-17 v bunke, sa môže líšiť v závislosti na jeho úrovni expresie proteínu, a to, či sa nachádza v blízkosti plazmatické membrány, kde PKCα sa nachádza /aktivovaný, alebo spojené s kontraktilné myozínových hrubých vlákien, ak by MLCP byť umiestnené na de -phosphorylate myosin ľahkého reťazca 20 (MLC 20).}}

expresie PKCα a CPI-17 a ich časopriestorovej prerozdeľovanie po aktivácii tkaniva boli navrhnuté v Ca ^{2+ senzibility hladké svalového tkaniva (ku kontrole [14], [15], [16], [17]). Je teda možné, že rozdiely v expresii a bunkovej lokalizácie /translokáciu by mohla byť rozhodujúca pre určenie tonikum vs. reakcií fázovým kontraktilných. Pre tieto dva proteíny, že časť dráhy zapojené do inhibíciu MLCP aktivity počas aktivácie tkaniva, a tak pôsobiť tonikum alebo fázovým odpoveď, musia byť vyjadrené na príslušných úrovniach a umiestnené na správnom mieste v bunke v správny čas. Vzhľadom k tomu, PKC je aktivovaný DAG (na membránu viazaný fosfolipidov), musí byť tiež v membráne aspoň dočasne aby k tomu došlo. A v prípade, CPI-17 bude inhibovať MLCP z dephosphorylating MLC _{20 na hrubých vlákien, CPI-17 v určitom okamihu musí byť v cytosolu spojené s hrubými vlákien prítomný. S týmito dvoma krokmi sa vyskytujúce v dvoch priestorovo oddelených oblastí bunky, jeden alebo oba z týchto proteínov sa premiestni na ďalšie oblasti k tomu, aby vzájomne a dokončenie cesty.}}

Účelom tejto štúdie bolo testovať hypotézu, že PKCα - CPI-17 Ca ^{2+ senzibilizácie dráha je rozhodujúca pre určenie tonikum (trvalé) a fázovým (prechodné) kontrakčné odozvy na hladké svalstvo. Ak chcete to sme stanovili expresiu proteínu a časopriestorovej distribúcie PKCα a CPI-17 v fázovým žalúdočnej dutine a tonikum žalúdočné fundus za uvoľnených a aktivovaných podmienok. Výsledky ukazujú významný rozdiel v expresii jedného z týchto dvoch proteínov, ani vo svojom obvodovom rozdelenie medzi týmito dvoma tkanív sú v súlade s hypotézou, že PKCα- CPI-17 Ca 2+ senzibilizácie cesta je určujúcim faktorom pre tonic vs. fázovým kontrakčné odozvy pozorované v týchto tkanivách.}

metódami

orgánov a tkanív Manipulácia

prasacej tkaniva (žalúdky) boli získané od Hansen mäso služby (Franksville, WI) a dať do studeného roztoku fyziologickom soľnom (PSS (v mM): 140,1 NaCl, 4,7 KCI, 1,2 na _{2HPO 4, 2,0 MOPS (pH 7,4), 0,02 na 2EDTA, 1,2 MgSO 4, 1,6 CaCl 2, a 5,6 glukózy). Žalúdky boli vyčistené z krvi, voľné spojivového tkaniva, a v niektorých prípadoch, sliznice, a okamžite zmrazený a uložené v PSS v chladničke 0-2 dni. Niektoré orgány boli naturálnej čo najskôr po usmrtení (60-90 minút). Niektoré orgány boli inkubované v PSS a /alebo stimulované 1,0 uM CCH alebo PDBu (Sigma) pri teplote 37 ° C počas rôznych časových bodoch pred zmrazením. boli testované tiež variabilné inkubačnej doby a agonistické koncentrácie. Pre imunohistochémia všetky tkanivá bol uložený zmrazený až do rozrezané a immunoreacted. Zmrazenie vo všetkých prípadoch išlo o umiestnení kúskov tkaniva alebo tkanivových pásov v izopentánu sa ochladí tekutým dusíkom s následným skladovaním pri -80 ° C. Päť až šesť um úseky zmrazených tkanív boli rozrezané na Leica CM1900 kryostatu, zdvihol na sklíčka a skladovať v zmrazenom stave (0-1 dni), kým immunoreacted.}

Immunoreactions a činidlá

protilátky boli získané z týchto zdrojov: PKCα (H-7 a C-20) a CPI-17 (H-60) od Santa Cruz Biotech, Santa Cruz CA; Vinkulin a Talin od Sigma, Saint Louis, Missouri; Caveolin 1 od BD Biosciences, San Jose, CA; Cy 2 a Cy3 oslie anti-myšou alebo králičie sekundárne je z Jackson Immuno, West Grove, PA; Alexa Fluór 594-phalloidin a DAPI od Molecular Probes, Eugene, OR. Všetky tieto protilátky boli predtým použité v našom laboratóriu pre imunohistochémia a western blotting, kde ukazujú špecifickosť pre prúžok o správnej molekulovej hmotnosti pre daný proteín uvedenú [25], [26], [27]. Negatívne kontroly, kde sa primárne protilátka nie je súčasťou nevykazujú žiadnu reaktivitu týchto pásmach a žiadny imunofluorescencie na tkanivových rezoch.

tkaniva zmrazené vyzdvihnúť na sklíčkach boli rozmrazené pri teplote miestnosti a potom fixované 2% paraformaldehydom za 10 minút, permeabilizované v 0,5% Triton X-100 po dobu 10 minút a blokované 5 mg /ml BSA po dobu 1 hodiny pred reakciou s primárnou protilátkou cez noc (4 ° C) a potom príslušné sekundárne protilátky po dobu jednej hodiny pri izbovej teplote. Potom, čo sa sekundárne protilátkou, boli tkanivá inkubované s DAPI (0,5 uM), phalloidinem (10-50 nM) alebo DAPI /phalloidinem podľa potreby pre farbenie jadier a /alebo vláknitých aktínu. Viac premytie boli použité nasledovné primárne a sekundárne inkubácie, a kontrastným. Sklá krycie boli zahájené za použitia pufrovaného 75% glycerolu s 0,2% n-propyl, aby sa minimalizovalo vyblednutiu. Všetky immunoreacting roztoky boli vyrobené v PBS-Tween [(v g /l: NaCl 8,0, KH _{2Po 4 0,2, Na 2HPO 4 1,15, chlorid draselný 0,2,), 1% Tween- 20, pH 7,4] a 0,1% BSA. Negatívne kontroly zahŕňali 0,1% BSA bez primárnej protilátky a nevykazoval žiadnu imunoreakci.}

Microscopy

Rezy boli pozorované s použitím Olympus IX70 mikroskopom vhodným pre epifluorescenčné osvetlením. Digitálne snímky boli nadobudnuté s CCD kamerou 16 bitov Princeton Instruments (Princeton, NJ), riadený cez dosku PCI prostredníctvom IPLab pre Windows na PC (verzia 3,6, Scanalytics ,. Fairfax, VA). Snímky boli nadobudnuté s použitím buď 100 × (1.3 NA) alebo 60 x (1,25 NA) olejovou šošovku alebo 40 × (0,9 NA) objektívu vzduchu a uložené na PC. Emisné filtre používané boli 405, 490 a 570 nm. Rezy boli videné aj pomocou Nikon konfokálního mikroskopu (Nikon A1 konfokálna Eclipse TI). Ciele boli použité 100 × (1,4 NA) oleja šošovka na 425, 488 a 561 nm. Podobné výsledky boli pozorované v distribúciách imunofluorescenčný použitie týchto dvoch rôznych systémov.

Analýza obrazu Rozdelenie PKC /CPI-17 jednotlivých buniek v tkanivách

profily intenzity fluorescencie boli odobraté pre jednotlivé bunky v priečne rezy tkaniva. Rezy sa pozorovali pri malom zväčšení (10-20x), aby sa zabránilo oblasti viditeľné artefakty (tkaniva skladanie, zmraziť poškodenie, atď). V artefaktu voľnom priestore bola zvýšená na zväčšenie 40-100x, a zábery boli nadobudnuté pri týchto vyšších zväčšení. Tri rôzne oblasti v rámci jedného reze tkanivá boli vybrané fotiť. Z-stack rady boli samostatne pre každú z troch farebných kanálov používaných. boli odobraté 1 um hrubé Z úseky, a 15-25 Z úseky boli nadobudnuté pre každú sekciu tkaniva (údaje S1 & príklady ukazujú S2 Z-Stack CPI-17 imunoreaktivity v dutine s a bez aktivácie tkaniva). Každý Z zásobník séria bola skúmaná pre každý úsek na účely identifikácie centrum Z obrazu a tento obraz bol prevedený na a.bmp súbor, ktorý bol importovaný do NIS-Elements AR 3.0 (Nikon) na PC analyzovať dáta.

profily PKCα a phalloidinem intenzity fluorescencie boli získané pre jednotlivé bunky v priečnych rezoch tkanív. Linka bola spracovaná cez stred zorného poľa. Desať bunky krížené línií bolo vybraných pre meranie. na našich predchádzajúcich protokolov [25], v prvých piatich obrazových bodov (~ 0.7 um) na oboch stranách bunky, kde je intenzita phalloidin prudko zvýšil z východiskovej hodnoty na základe boli definované ako periférie bunky. Pre meranie cytosolické, linka bola umiestnená najmenej 2 um od bunky obvodu. Meranie intenzity boli vykonané pomocou záujmové oblasti (ROI), zhruba v strede bunky (pre meranie v cytosolu), alebo pozdĺž membrány bunky (pre obvodové merania). Konzistencia, veľkosť ROI sa udržiava konštantný na periférnych a cytosolu merania. Bunky v časti s veľmi malým priemerom (nie je schopný zmerať cytosolu návratnosť investícií najmenej 2 um od obvodu), alebo s jadrami prítomnosti (viditeľný farbením DAPI, kde priestorové obmedzenia a perinukleárním organely by mohli zmiasť distribúciu) boli vylúčené z analýzy. Pre PKCα, bol použitý pomer priemernej intenzity PKCα na obvode na celkový intenzity PKCα (suma PKCα intenzity z ROI na obvode a návratnosť investícií v cytosolu). Desať buniek na oblasti a tri rôzne oblasti boli podrobené merania pre analýzu dát pre každú oblasť tkaniva, tj. Tridsať bunky sa počítali a spriemerované pre každú vzorku (n = 1). Konečná veľkosť vzorky bola n = bola použitá 5.The rovnaké postupy na meranie intenzity CPI-17, okrem toho, že iba jedno pole z 10 buniek boli použité pre každú vzorku (n = 1), s finálnou veľkosť vzorky n = 3.

Mechanické Meranie

Bezprostredne pred použitím sa tkanivá prúžky boli rozrezané a upnutá na každom konci, sa svorkami zaistených medzi háčiky na pevnú kovovou tyčou a snímačom izometrickej sily (Harvard Apparatus, Holliston, MA), v PSS prebublávania 95% O _{2/5% CO 2 vo vodnom plášťom svalových komory (Radnóti Glass Technology, Monrovia, CA) pri teplote 37 ° C. Dĺžka každého pásu bola menená zmenou polohy stacionárneho kovovú tyč.}

hladká svalové tkanivo pásy (žalúdočné dutine a fundusu) sa do rovnovážneho stavu po dobu 1 hodiny a pretiahol na pasívne napätie blížiace Lo za pomoci skrátenej dĺžky napätie krivky , Uzavrieť zmluvu tkaniva, PSS bola nahradená K ^{+ - PSS (109 mM KCI je nahradený iso-osmotický pre NaCl) [28]. Svalové prúžky boli aktivované opakovane napínanie tkaniva medzi každej aktivácii, až do maximálnej sila už vykazovali výrazný nárast oproti predchádzajúcemu kontrakcie. Chambers sa prepláchne trikrát PSS po každej aktivácii tkaniva. Aspoň dva po sebe idúce opakovateľné K + - PSS kontrakcie boli použité na získanie štandardnej sily trasovanie sa 10 minút odpočinku medzi každej kontrakcie pred začatím experimentu. Tkanivá potom boli aktivované 1 uM karbacholom a uvoľnená opäť, ako bolo vykonané počas K + - PSS kontrakcie. Následné kontrakcie všetko zahrnuté v cene 1 uM fentolamín propranolol blokovať α- a beta - adrenergné receptory, resp. V nadväznosti na konečnej 1 uM CCH kontrakcie a umyť, tkanivá boli aktivované s 1 uM PDBu zaznamenať ich mechanické odozvy.}

Analýza dát Force

Napäťové signály zo snímačov sily boli digitalizovaný PowerLab 400 alebo 4 SP hardvér (ADInstruments, Castle Hill, Austrália) zobrazuje na obrazovke počítača (Chart V3.6 alebo 4.0, ADInstruments), ktorá bola použitá ako sila (g) pri 10 Hz a uložené príkazom softvéru na pevný disk pre neskoršie analýzy. Údaje boli vykonané s tabuľkovom procesore Excel 2000 (Microsoft, Redmond, WA).

Gélová elektroforéza a westernový prenos

Expresia proteínu bola analyzovaná, ako bolo opísané skôr [29]. Tkanivá boli homogenizované v 50 mg /ml v 0,125 M Tris, 2% dodecylsulfát sodný (hmotnosť /objem), 20% glycerolu, 0,1% brómfenolovej modrej (hmotnosť /objem) a 20 mM dithiothreitolu. Proteíny boli rozdelené na nízky obsah sodíka dodecylsulfát gélov zesíťovacích [30] a imunoblotting bola vykonaná, ako bolo opísané skôr [31]. Protilátka PKCα uznaný buď jediný pruh alebo častejšie dublet pri ~ 76 kD, zatiaľ čo CPI-17 protilátka rozpoznala jediný pás pri ~ 17 kD. Tieto rozmery sú v súlade s očakávanou veľkosťou týchto proteínov na základe mobility gélu. Aby bola zaistená presnosť západných škvrny, loading krivky boli vykonané u oboch žalúdočné fundus a antra vzoriek niečo málo cez 5-násobného rozsahu zaťaženia (4-20 ul) pre aktínu (Coomassie modrí) a PKCα a CPI-17 (western blotting) , Výsledky ukázali, lineárny vzťah pri tomto rozsahu pre všetky tri proteíny z oboch tkanív (R ^{R2 0,98 pre všetky výsledky, n = 3). Kvantifikácia PKCα a CPI-17 expresia proteínu bola vykonaná na Western Blot za použitia 5-10 ul zaťaženia, ktorá bola v tomto lineárnom rozsahu (n = 6).}

Štatistika

Štatistická porovnanie boli vykonané s použitím Minitab (Minitab Inc. State College, PA). Jedna vzorka t-test bol použitý na testovanie distribúcie PKCα /CPI-17 (periférne k celkovému obsahu ROI 0,5 označuje "jednotný" distribúciu v bunkách hladkého svalstva (SMC)) v dutine a fundusu pod podmienkou odpočinku. Jedným zo spôsobov, ANOVA bola vykonávaná pre testovanie PKC /CPI-17 distribučných rozdielov u oboch tkanív s rôznymi parametrami stimulačných. Dva ukážkové t-testy boli použité na testovanie významnosti rozdielu pre úrovne expresie PKCα alebo CPI-17 v dutine a fundu. Dva-sledoval F-test pre rovnosť dve štandardné odchýlky (SDS) určí významne nižšie SD v pomere k Caveolin PKCα v porovnaní s SD pomere vinkulin k PKCα. Hodnota P menšia ako 0,05 bola považovaná za významnú pre všetky štatistické testy. Žiadne štatistické testy boli vykonané na dátach sily a obrázok 1 je reprezentatívny podobnými údajmi z 6 rôznych zvierat. Western blot údaje zo šiestich zvierat. PKCα distribúcie dát je v priemere tridsať buniek meraných na jedno zviera a piatich zvieratách boli testované. CPI-17 distribúcie dát je v priemere o 10 buniek meranej na jedno zviera a tri zvieratá boli testované. Proteín ko-lokalizačné údaje sú založené na 'n' najmenej 20 buniek z najmenej 3 zvierat.

Výsledky

Prasacia žalúdočné fundus je primárne tonikum hladká svalové tkanivo, ktorá reaguje na stimuláciu s trvalou kontrakciu, zatiaľ čo Antrum je v prvom rade fázovým hladkej svalového tkaniva, ktorý reaguje na stimuláciu s prechodným kontrakcie (obr. 1). V tkanivách sú tieto reakcie pravdepodobne výsledkom priamej stimulácie hladkého svalstva, ako pridanie 1 pM propranololu (beta agonisty blokátorov) a fentolamín (alfa agonisty blokátor) bola použitá, aby sa zabránilo aktivácii adrenoceptorov v dôsledku možného uvoľnenia sympatických neurotransmiterov. Stimulácia hladkej svaloviny s PDBu sa používa bežne spôsobuje kontrakcie hladkého svalstva prostredníctvom PKC aktivácia [32], [33], [34]. Jeden uM PDBU spôsobuje malý pomalý pokles žalúdočné fundus pásy (~ 40% z K ^{+ reakciu stimulácia), zatiaľ čo Antrum ukazuje v podstate žiadna reakcia (menej ako 5% K + stimulácia) (obr. 1). Rozdiel medzi trvalé a prechodné odozvy týchto dvoch tkanív na KPSS a CCH, a prítomnosť alebo neprítomnosť kontrakčnej odozvy na PDBu stimulácii môže byť vzhľadom k expresii a /alebo priestorové, časové rozloženie nadväzujúcich druhých poslov (PKCα a CPI-17), ktoré sú údajne zodpovedný za inhibíciu MLCP s PDBu stimuláciu. Skúmať toho sme merali hladiny expresie a určuje priestorové-časové rozloženie PKCα a CPI-17 v týchto tkanivách.}

Obrázok 2 ukazuje výsledky western blot pre expresiu CPI-17 a PKCα v žalúdku dutine a fundus. Tkanivá boli spracované kontrole koncentráciu proteínu, a výsledky boli vypočítané na základe intenzity signálu príslušného proteínu, a normalizované na aktínu expresie proteínu (obr. 2). Obe metódy (iba normalizovanej Uvedené údaje), je uvedené, že ani expresie CPI-17 proteínu, ani to, že z PKCα bielkovín je významne odlišné (p > 0,23 & p > 0,28 v tomto poradí, n = 6), pri porovnaní týchto dvoch SM tkaniva. Kontroly boli vykonávané s použitím rozsahu zaťaženia potvrdiť rozsah linearity zaťaženia, a že vzorky použité pre kvantifikáciu boli v tomto rozmedzí (údaje nie sú uvedené, pozri metódy). Vzhľadom k tomu nie sú žiadne rozdiely v expresiu týchto dvoch proteínov medzi týmito dvoma tkanivami, sme vedľa pristúpili na určenie, či rozdiely v ich časopriestorovej distribúcie by mohli vysvetliť rozdiel v odpovediach na PDBu stimuláciu.

Obrázok 3 ukázať immuohistochemical výsledky za distribúciu PKCα v pozdĺžnych a kruhových vrstiev fundusu a dutine. Za kľudových podmienok v relaxačnej riešenie, kedy nie je vytváranie síl do tkaniva sa PKCα sa zdá byť jednoznačne distribuovaný prednostne v blízkosti obvode SMC (obr. 3- zelenej farby, PSS). Stimulácia tkaniva s 1 uM CCH (3 ') alebo 1 uM PDBu (10 a 30'), nemá vplyv na tento obvodový rozdelenie PKCα. Pomer rozloženie PKCα blízkosti plazmatické membrány, vztiahnuté na celkové bunkové PKCα bola použitá pre kvantifikáciu prípadné zmeny v distribúcii tohto proteínu za týchto rôznych podmienok. Obrázok 4 ukazuje výsledky ako pomer PKCα na periférie buniek, vztiahnuté na celkovú PKCα prítomných v bunke (periférnej /(periférne + cytosolu), pozri metódy). Pomer 0,5 naznačujú "jednotnej" distribúcia proteínu v celej bunke. Pomer PKCα (periférna /spolu) sa pohybovala od 0.64-0.68 vo preskúmané všetky podmienky. Tieto hodnoty sú významne vyššie ako 0,5 (p menšie ako 0,05), čo ukazuje, že PKCα sa nachádza v prvom rade na periférie buniek (nie je "rovnomerne" distribuované v bunke), a že toto rozdelenie nemení medzi uvoľnená alebo stimulovaných podmienok <. br>

Vzhľadom k tomu, PKCα sa navrhuje pre aktiváciu CPI-17, sme postupovali na určenie priestorové-časové rozloženie CPI-17 v týchto tkanivách, za podobných podmienok. Obrázok 5 ukazujú immuohistochemical výsledky distribúcie CPI-17 v pozdĺžnych a kruhových vrstiev fundusu a antra. Za kľudových podmienok v relaxačnej riešenie, kedy nie je vytváranie síl do tkanív, CPI-17 sa zdá, že difúzne rozdelené v SMC (obr. 5- PSS, obr. S1). Stimulácia tkanív s 1 uM CCH (30 '), (ale nie 1 uM CCH pre 3', dáta nie sú ukázaná) alebo 1 uM PDBu (30 ') vedie k významnej zmene v distribúcii tak, že CPI-17 sa teraz objavil aby sa v prvom rade na okraji bunky v distribúcii podobne ako u pre PKCα (obr. 5, obr. S2). Pomer rozdelenia CPI-17 v blízkosti plazmatické membrány vo vzťahu k celkovému CPI-17 (periférne + cytosolu) bol použitý pre kvantifikáciu prípadné zmeny v distribúcii tohto proteínu za týchto rôznych podmienok. Obrázok 4 ukazuje výsledky ako pomer periférne k celkovému CPI-17. CPI-17 pomer (periférna /spolu) v rozmedzí od 0.49-0.67 vo všetkých tkanivách a podmienok skúmaných. Pomer CPI-17 /periférne celkom v uvoľnených podmienok, nie je výrazne odlišná od 0,5 (0,49-0,5 znamená, P > 0,19), čo ukazuje, že CPI-17 je difúzne distribuovaný v bunkách hladkého svalu za týchto podmienok. To však nič nemení po 3 '1 um CCH stimuláciu ako stále neexistuje žiadny významný rozdiel od uvoľnených podmienok (to znamená = 0,53 až 0,55; p >0,05) s výnimkou fundu tkanív, kde periférne /celkový pomer CPI-17 je výrazne vyššia (p menšie ako 0,05) na 3 '(obr. 4). S 30 'buď 1 uM CCH alebo 1 uM PDBu stimulácia, CPI-17 distribúcia sa stáva podstatne väčšia ako 0,5 pre všetky tkanivá a vrstvy (prostriedky = 0.62-0.67, P &0,01), čo ukazuje, že CPI-17 sa teraz nachádza v prvom rade na okraji bunky (ktoré sa už "rovnomerne" rozložené po celej bunky), podobne ako pri rozdelení PKCα (obr. 4).

prevažne periférne distribúcie PKCα (ako za uvoľnených a stimulovaných podmienok) a CPI-17 (po 30 'stimulácii CCH alebo PDBu) nie je jednotná v periférie buniek, ale v distribúcii punctata (viď obr. 6). K dispozícii je tiež rozdelenie punctata z anatomicky a funkčne odlišných adhézne uzloch a caveoli na plazmatické membrány SMC [26]. Za účelom zistenia, či je rozloženie PKCα a CPI-17 v membráne zodpovedá pozoroval po biopsii vzorom adhézne križovatiek, sme dvojité značenie s dvoma adherens spojovacie spojené proteíny, vinkulin a Talin. Striedavá vzor distribúcie červenej a zelenej fluorofor na membránach ukazujú, že PKCα a CPI-17 nespolupracujú-lokalizovať buď vinkulin alebo Talin (obr. 6), čo naznačuje, že PKCα a CPI-17 nespája s adherens križovatka komplexu v podmienkach sme sa zaoberali. Vzhľadom k tomu, caveoli striedajú s adherens križovatiek na periférne membráne [26], PKCα a CPI-17 môžu spolupracovať lokalizovať s caveoli. Ak chcete zistiť, či je rozdelenie punctate z PKCα a CPI-17 na membráne zodpovedá pozoroval po biopsii vzoru caveoli, sme tiež urobili dvojaký označovanie PKCα s Caveolin. Distribúcia PKCα a Caveolin ko-lokalizáciu na membráne v oboch uvoľnených a aktivovaných podmienok, ako je už pozorovaný vzhľad žltá /oranžová fluorescencie skôr než zreteľné červenej a zelenej fluorescencie (obr. 6). Dva-sledoval F-test pre rovnosť dve štandardné odchýlky (SDS) určí významne nižšie SD v pomere Caveolin k PKCα v porovnaní s SD pomere vinkulin k PKCα (n = 20 buniek, p menšie ako 0,05) , Okrem toho, dvojité označovanie PKCα s CPI-17 po aktivácii tkaniva tiež ukazuje významné spoločnú lokalizáciu (n = 20 buniek, p menšie ako 0,05) z týchto dvoch proteínov v blízkosti plazmatické membrány (obr. 7). Tieto dáta ukazujú, že PKCα je primárne lokalizovaný v blízkosti caveloi na plazmatické membráne SMC za všetkých okolností, a že po aktivácii tkaniva, významnú časť cytozolové CPI-17 premiestni do caveoli v plazme, kde sa čo-lokalizuje sa PKCα.

Diskusia

hladkého svalstva tkaniva sú bežne charakterizovaná buď ako "tonikum" (generovanie pomalé udržiavané izometrickej kontrakcii) alebo "fázovým" (generovanie rýchlu prechodovú izometrickej kontrakcii). generovanie sily a /alebo tkanivá skrátenie do SM sú veril vyžadovať zvýšené myozínových fosforylácie ľahkého reťazca ATP spotrebu a krížové most na bicykli. Možný mechanizmus zodpovedný za tieto dva typy kontrakcií je rozdiel Ca ^{2+ senzibilizácie. Ca 2+ scitlivenie v hladkých svaloch sa predpokladá, vo veľkej časti, aby sa v dôsledku inhibície MLCP súčasne s alebo následne po aktivácii MLCK počas aktivácie tkaniva [15], [35]. Jednou z hlavných dráh Navrhuje sa, aby zúčastňuje Ca 2+ senzibilizácie je prostredníctvom receptorov spriahnutých s G-proteínom (GPCR) /fosfolipázy C (PLC) /diacylglyceroly (DAG) /PKC /CPI-17 pre inhibíciu MLCP. GPCR je, PLC, a DAG sa nachádzajú v /v plazmatickej membráne. Umiestnenie MLCP je menej isté, ale v určitom okamihu po aktivácii tkaniva musí MLCP, ktoré majú byť spojené s MLC _{20 o myozínových molekuly silných vlákien, aby sa dephosphorylate tohto proteínu. Vzhľadom k tomu, hrubé vlákna boli popísané, ktoré sa majú rozdeliť v SMC cytoplazme [36], [37], [38], [39], bude MLCP musí byť tiež rozdelené v cytoplazme v určitom okamihu v priebehu uvoľnenia [40]. Ak MLCP sa nachádza v cytosolu a v blízkosti MLC 20 počas kontrakcie a PKCα a CPI-17 hrá úlohu v inhibíciu MLCP počas kontrakcie, tak aspoň CPI-17 by sa očakávať, že sa nachádza v cytosolu v určitú dobu počas kontrakcie. Výsledky tejto štúdie ukazujú, že PKCα je prednostne lokalizované v blízkosti plazmatické membrány pri uvoľnených a aktivovaných podmienok, a že CPI-17 je tiež prednostne lokalizovaný v blízkosti plazmatické membrány v aktivovaných podmienok. Tak, tieto údaje naznačujú, že rozdiely v PKCα- CPI-17 Ca 2+ senzibility cesta nemôže vysvetliť, tonikum a fázovým sťahy SM žalúdka fundus a antra a ďalšie práce je nutné zistiť, ako priestorové, časové rozloženie CPI- 17 s aktiváciou tkaniva môžu regulovať MLCP spôsobiť Ca 2+ senzibilizácie SM kontrakcie v neporušených SM tkanivách.}}

Kým PDBu spôsobuje pomalé kontrakciu v očnom pozadí, ktoré je ~ 40% z KPSS indukovanej najvyššia sila malá kontrakcie je generovaná v dutine s PDBu stimulácie. Vzhľadom k tomu, fundus a Antrum predstavujú dva základné typy hladkého svalstva, tonikum a fázovým respektíve, zdá sa logické pripisovať rozdiel vo vytváraní síl s odlišnými vlastnosťami fázovým a pleťový krém svalu. Woodsome et al [41] uvádzajú, že hladina expresie CPI-17 v tonikum cievnej SM je vyššia ako v fázovým cievnej SM. To by mohlo vysvetliť rôznu schopnosť napätých svalov k udržaniu sily (vo vysokej koncentrácii CPI-17 inhibuje MLCP umožňuje MLC _{20 fosforylácie zostať vysoká a sily, ktoré majú byť udržiavané v toniku SM). Táto štúdia skúmala PKCα a CPI-17 proteín expresiu a distribúciu v viscerálnej prasacej žalúdku. K nášmu prekvapeniu sa zistený významný rozdiel v expresii proteínov úrovni PKCα alebo CPI-17 medzi očnom pozadí a dutine (viď obr. 2).}

• Ploche ONE: Nikotín zoslabuje aktiváciu tkanivové makrofágy Resident v žalúdku myšou cez P2 nikotínový receptor acetylcholínu
• Ploche ONE: chirurgická liečba pre pacientov s Krukenberg nádor žalúdka pôvodu: Klinický výsledok a prognostických faktorov Analysis