PLOS ONE: Sonic Hedgehog medierar spridning och rekrytering av transformerade mesenkymala stamceller till Stomach

Abstrakt

Studier med Helicobacter
infekterade möss visar att härledd från benmärg mesenkymala stamceller ( MSCs) kan återbefolka mag epitel och främja magcancer progression. Inom tumören mikro i magen, är pro-inflammatorisk cytokin interferon-gamma (IFNy) och Sonic hedgehog (Shh) förhöjd. IFNy är inblandad i tumör spridning via aktivering av Shh signalväg i olika vävnader, men om en liknande mekanism finns i magen är okänd. Vi testade hypotesen att IFNy driver MSC spridning och rekrytering, ett svar som förmedlas av Shh signalering. Den aktuella studien använder transplantation av en In vitro
transformerad mesenkymala stamcellslinje (stMSC ^{vect), som över uttrycker Hedgehog-signalering, i jämförelse med icke-transformerade vild typ MSCs (wtMSCs), wtMSCs transfekterades till överuttrycker Shh (wtMSC Shh), och stMSCs transducerade med lentivirala konstruktioner innehållande shRNA inriktning på Shh-genen (stMSC ShhKO). Effekten av IFNy på MSC proliferation bedömdes genom cellcykelanalys In vitro
användning av celler som behandlats med rekombinant IFNy (rmIFNγ) ensam eller i kombination med anti-Shh 5E1 antikropp, och In vivo
med möss som transplanterats med MSC som behandlats med PBS eller rmIFNγ. In vitro
, IFNy signifikant ökad MSC spridning, ett svar som förmedlas av Shh som blockerades av 5E1 antikropp. MSC befolkningen som samlats in från benmärg hos PBS eller IFNy-behandlade möss visade att IFNy ökade signifikant den procentuella andelen av alla MSC cellinjer i S-fas, med undantag för den stMSCs ShhKO celler. Medan MSC cellinjer med intakt Shh uttryck rekryterades till magslemhinnan som svar på IFNy, stMSCs ShhKO inte. Hedgehog-signalering krävs för MSC spridning och rekrytering till magen som svar på IFNy}

Citation. Donnelly JM, Chawla A, Houghton J, Zavros Y (2013) Sonic Hedgehog förmedlar spridning och rekrytering av transformerad mesenkymala stam celler till magen. PLoS ONE 8 (9): e75225. doi: 10.1371 /journal.pone.0075225

Redaktör: Jorge Sans Burns, Universitetssjukhuset i Modena och Reggio Emilia, Italien

Mottagna: 24 januari 2013, Accepteras: 14 augusti 2013; Publicerad: 19 september 2013

Copyright: © 2013 Donnelly et al. Detta är en öppen tillgång artikel distribueras enligt villkoren i Creative Commons Attribution License, som tillåter obegränsad användning, distribution och reproduktion i alla medier, förutsatt den ursprungliga författaren och källan kredit

Finansiering:. Detta arbete stöddes av American Cancer Society Research Scholar Award 119072-RSG-10-167-01-MPC (Y. Zavros), Albert J. Ryan Foundation Fellowship (J. Donnelly) och delvis av den Digestive Health Center Cincinnati barns medicinska Center (DHC: bänk till Bedside Research in Pediatric Digestive Disease) CHTF /SUB DK078392. Författarna vill tacka för den hjälp av Monica fördröjning chef för forsknings Flow Cytometry Kärna vid avdelningen för reumatologi vid Cincinnati Childrens Hospital Medical Center, med stöd delvis av National Institutes of Health (NIH) AR-47363. Alla Flödescytometrisk uppgifter förvärvades med hjälp av utrustning som upprätthålls av forsknings flödescytometri Kärna vid avdelningen för reumatologi vid Cincinnati Childrens Hospital Medical Center, med stöd delvis av NIH AR-47363. Finansiärerna hade ingen roll i studiedesign, datainsamling och analys, beslut att publicera, eller beredning av manuskriptet

Konkurrerande intressen:.. Författarna har förklarat att inga konkurrerande intressen finns

Introduktion

det finns en klart etablerad roll för Sonic Hedgehog (Shh) signalering i utvecklingen av cancer [1], [2], [3]. Celltillväxt i tarmtumörer som inkluderar matstrupe, magsäck, gallvägarna och bukspottkörtel regleras av endogent uttryck av Hedgehog-ligander, såsom Shh [1]. Bindning av Hedgehog-ligand till dess receptor, Patched (Ptch), resulterar i avlägsnandet av inhiberingen av Ptch på Smoothened (Smo). Detta avlägsnande av inhiberingen på Smo resulterar i aktiveringen av Gli-familjen av Hedgehog transkriptionsfaktorer och därefter tumörtillväxt som kan blockeras av Hedgehog neutraliserande antikropp [1]. Medan sambandet mellan Shh och magcancer är klar, är den funktionella rollen av Shh i utvecklingen och utvecklingen av magcancer i stort sett okända. Vidare mekanism som reglerar produktionen av Shh inuti tumörmikromiljön har ännu inte fastställts.

Helicobacter pylori (H. pylori) Review bakteriell kolonisering orsakar kronisk inflammation som konsekvent är associerad med progression till magcancer [4]. Den vanligaste och skadliga immunsvar involverar Th1 proinflammatoriska cytokiner, framförallt IFNy från T-celler, och IL-1β och TNF från vävnad eller invaderande makrofager [5], [6], [7], [8], [ ,,,0],9]. Faktum är att pro-inflammatoriska cytokinen IFNy har visats bidra till patogenes och utvecklingen av gastric metaplasi [5], [9], [10] och cancer [10]. I inflammations inducerad cancer, förmedlar Hedgehog signalväg IFNy-inducerad tumörutveckling [11], [12], [13]. I synnerhet är Shh en IFNy målgen och Hedgehog-signalering en förmedlare av IFNy-inducerad proliferation [12].

Under Helicobacter
infektion sammanfaller kronisk inflammation med rekrytering av benmärg-derived mesenkymala stamceller (BM-MSC: er) [14], [15]. I kroniskt inflammerad mage BM-MSC rekryteras från benmärg till magen och differentiera till cancerassocierade fibroblaster (CAFS) som är avgörande för att styra utvecklingen av cancer [14]. Även klart inblandad i utvecklingen av magcancer, är den mekanism som reglerar spridningen och rekrytering av malignt transformerade BM-MSC till magen under kronisk inflammation i stort sett okända. Intressant är Shh rapporterats inducera proliferation och differentiering av BM-MSC: er [16]. Shh har också erkänts som en potentiell chemoattractant för benmärgshärledda celler när uppregleras som svar på kronisk inflammation [17], [18].

Baserat på sambandet mellan IFNy och Shh, hypotes vi att IFNy inducerar Shh signalering inom MSC underlättar cellmigration till magen. För att testa denna hypotes, jämför den aktuella studien In vivo
BM-MSC rekrytering till magslemhinnan som svar på IFNy med hjälp av en spontant transformerad mesenkymala stamcellslinje (stMSC) i jämförelse med otransformerade BM-MSC. I kultur, BM-MSC är benägna att mutation med åldrande och uppvisar kliniskt relevanta mutationer i p53-genen [19]. Med långtidsodling BM-MSC "spontant omvandla" (stMSCs), kan förökas in vitro under längre perioder och uppvisar en cancer befrämjande fenotyp [19]. Den aktuella studien använder både stMSCs och otransformerade BM-MSC (wtMSCs) som över uttrycker Hedgehog-signalering. Använda wtMSC och stMSC cellinjer både In vivo Mössor och In vitro
, vi visar att IFNy-inducerad proliferation och rekrytering av MSC-cellinjer till magen är ett svar som förmedlas av Shh sekretion och signalering.

Material och metoder

Djur

C57BL /6 (stam�664) och IRG (stam705) möss som användes för dessa studier köptes från Jackson laboratorier. Alla studier mus godkändes av University of Cincinnati Institutional Animal Care och användning kommittén (IACUC) som upprätthåller en American Association of bedömning och ackreditering av försöksdjurs Care (AAALAC) anläggning.

härledd från benmärg Spontant Förvandlad Mesenchymala stamceller (stMSC) och icke-transformerade BM-MSC (wtMSC) Kultur och behandlingar

wtMSC cellinjer etablerade från hela benmärgen hos IRG möss och odlade till passage 5 före transfektion med efterföljande underhåll vid låg passagenummer (< P10) före experimentell användning. Hela benmärg spolades från lårben och skenben hos möss för efterföljande kultur och passage av plast vidhäftande MSC befolkningen [20]. Spontant transformerade benmärgshärledda mesenkymala stamceller (stMSCs) transfekterade med en pDsRed-Hyg-C1 plasmid som uttrycker rött fluorescerande protein användes [21]. Alla celler odlades med användning av HyClone DMEM odlingsmedium kompletterat med 10-15% fetalt kalvserum och 1% penicillin-streptomycin under normala förhållanden. MSC: er odlade under behandlingen ströks ut i plattor med 6 brunnar och fick växa till 70-80% sammanflytning i normala medier sedan serum utsvultna över natten. Efter odling expansion var musen multi Mesenkymala Stromacells- Marker antikropp panel som används för att märka MSC cellinjer för Sca-1, CD106, CD105, CD73, CD29, CD44 och hematopoietiska markörerna CD45 och CD11b (R &D Systems, SC018). Celler suspenderades vid en koncentration av 1 x 10 ^{6 celler /ml och färgades i enlighet med tillverkarens protokoll. Cellerna inkuberades sedan med Alexafluor 488 vid en 1:100 utspädning under 30 minuter vid 4 ° C. Fixering utfördes under 15 minuter vid rumstemperatur med hjälp av ett kommersiellt tillgängligt reagens (Invitrogen GAS001S5). Fluorescensintensitet mättes genom flödescytometri med användning av BD FACSCalibur och CellQuestPro programvara. wtMSCs och stMSCs behandlades med fordon, rekombinant mus interferon-gamma (rmIFNγ, 100 nM, R &D Systems) eller anti-Shh-antikropp 5E1 (förbehandlade under 6 timmar) plus rmIFNγ under 24 timmar. Behandlade celler analyserades sedan för förändringar i cellcykeln genom flödescytometri.}

Sonic Hedgehog (Shh) knockdown av Lentivirus-medierad Short hårnål RNA (shRNA) med användning stMSCs

RFP-märkta stMSCs var omvandlade med fem olika MISSION Lentiviral transduktion partikel kloner som innehåller olika sekvenser av shRNA för Shh och en pLKO.1-puro komponent ger puromycin motstånd (Sigma-Aldrich). RFP-etikette stMSCs inkuberades med lentivirala partiklar med ExpressMag magnetiska pärlor (Sigma Aldrich) på en magnet (Oz Biosciences Super magnetisk platta, MF10000) under 15 minuter, avlägsnades cellerna från magneten, inkuberades under ytterligare 16 timmar och placerades sedan under puromycinselektion (DMEM Odlingsmedia innehållande 10% fetalt kalvserum, 1% penicillin /streptomycin, 10 | ig /ml puromycin) i 7 till 10 dagar. Den effektiva puromycin dos som behövs för att eliminera icke-transducerade celler har tidigare bestämts genom en puromycin kill kurva som testade koncentrationer från 0 till 50 | ig /ml (data ej visade). Omvandlade celler betecknades av ett unikt klon ID-nummer med cellinjer omvandlade med shRNA för Shh (stMSC ^{ShhKO) numrerade 59-63. En pLKO.1-puro vektor transducerad RFP-MSC-cellinje (stMSC vect) tjänade som kontroll för den endogena nivån av Shh genuttryck. Western blot-analys användes för att bekräfta Shh knockdown och RFP-expression.}

Transfektion av wtMSCs till överuttrycka Shh

Plasmiden (Origene CW101340) kombinerades med den Origene Turbofectin reagens vid förhållanden av 0 :1, 1:01, 2:01, 3:01 och 4:01 och inkuberades under 15 minuter vid rumstemperatur. Transfektionen reagenset tillsattes sedan droppvis till wtMSCs vid 70% sammanflytning och fick inkubera under 24 timmar innan cellerna sattes under selektion i normala media med puromycin. Den effektiva puromycin dos som behövs för att eliminera icke-transfekterade celler har tidigare bestämts genom en puromycin kill kurva som testar koncentrationer från 0 till 10 | ig /ml (data ej visade). Den lägsta koncentration som dödade alla otransfekterade celler vid 3-4 dagar efter behandling var etablerad som 2 | j, g /ml.

In vivo stMSC rekrytering och proliferation

C57BL /6-möss transplanterades med en × 10 ^{6 wtMSCs, wtMSCs Shh stMSCs vect eller stMSCs ShhKO via injektion i svansvenen. Tre dagar efter transplantation, injicerades möss med vehikel (sterila PBS, i.p.) eller rmIFNγ (1 | j, g /dag, i.p.) under 7 eller 21 dagar. Möss injicerades med 200 ^ BrdU-märknings lager reagens (5-brom-2'-deoxi-uridin märkning och Detection Kit II, Roche Diagnostics, ip) 24 timmar före analys, och magen sektioner fixerades i 4% paraformaldehyd, paraffininbäddade och 3 iM sektioner förberedd för immunohistokemisk och immunofluorescens analyser. Hela benmärg isolerades också från lårbenet av samma möss med PBS spolning. Röda blodkroppar lyserades med hjälp av röda blodkroppar lysbuffert blod (4,14 g NH _{4Cl, 0,5 g KHCO 3, 0,5 M EDTA i 500 ml, pH 7.2-7,4). Cirka 11 × 10 6 celler fixerades och permeabiliserades med hjälp Caltag Laboratories flödescytometri Kit, enligt tillverkarens protokoll (Invitrogen, GAS-004) och färgas med anti-RFP FITC-konjugerad antikropp (1:100, Abcam, ab34764 ) och färgades därefter med användning Vybrant DyeCycle Ruby fläck (Invitrogen) i enlighet med tillverkarens protokoll. Fluorescens analyserades med användning av BD LSRII flödescytometer systemet. För att specifikt analysera RFP-MSC: er, var grind användes för att analysera cellcykeln av endast de FITC-positiva celler. Peak fluorescens analyserades med ModFitLT programvara för att avgöra hur stor andel av befolkningen i varje fas av cellcykeln.}}

Flödescytometri och cellcykelanalys

Celler serumsvultna 16 timmar före analys . Celler fixerades med iskall 70% etanol /PBS under 15 minuter vid -20 ° C, tvättades och färgades sedan med propidiumjodid i 45 minuter. De uppmätta värdena för topp fluorescens per totala antalet celler erhölls med användning av programmet Cellquest Pro (Becton Dickson). Den procentuella andelen celler från befolkningen i varje fas av cellcykeln beräknades från toppfluorescensmätningar genom analys med ModFit LT programvara. Flödescytometri använda FACSCalibur ™ -systemet (Becton Dickson) utfördes på alla transducerade celler genom att använda musen multipotenta mesenkymala stamcellen Marker Antikropp Panel enligt tillverkarens protokoll (R &D Systems, SC018).

Immunoprecipitation och Western blot analys

cellysat framställdes med hjälp av M-PER däggdjurs proteinextraktion reagens (Thermo Scientific, IL) med tillsats av proteashämmare (Roche) enligt tillverkarens protokoll. Mediumprover från celler koncentrerades med användning av 15 ml Amicon Ultra centrifugalfilter Devices (Millipore). Cellysat (100 | j, g totalt protein) och medier immunutfälldes med användning av anti-Shh 5E1 antikropp (2 ^ g) vid 4 ° C under 16 timmar. Protein A /G-agaroskulor (20 jil, Santa Cruz Biotechnology, CA) tillsattes och prover inkuberades vid 4 ° C under 16 timmar. Efter 16 timmar av inkubering immunoprecipitat tvättades 3 gånger med PBS och återsuspenderades i 40 | il Laemmli-laddningsbuffert innehållande β-merkaptoetanol (Bio-Rad Laboratories, CA) före laddning på 4-20% Tris-glycin-gradientgeler. Gelerna kördes vid 80 V, 3,5 timmar, protein överfördes till nitrocellulosamembran vid 105 V, 1-2 timmar, och blockerades därefter under 1 timme vid rumstemperatur med användning av KPL Detector Block (Kirkegaard & Perry Laboratories, Inc.). Membranen inkuberades över natten vid 4 ° C med en 1:200 utspädning av Shh-antikropp (N-19, Santa Cruz) följt av en 1 timmes inkubation med 1:100 utspädning av Alexafluor anti-get 680 (Invitrogen). Blöts avbildades med användning av ett svep densitometer tillsammans med analysmjukvara (Odyssey Infrared Imaging Software System).

RNA-isolering och RT-PCR

Totalt RNA isolerades från magvävnad med användning av Trizol reagens enligt tillverkarens protokoll (TriReagent, Molecular Research Center, Inc.). High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems) användes för cDNA-syntes från RNA efter den rekommenderade protokoll. För varje prov, var 60 ng RNA omvänt transkriberas för att ge ungefär 2 ^ g totalt cDNA som sedan användes för RT-PCR. RFP primersekvenser som användes var följande: FORWARD -5 'CCC CGT AAT GCA GAA GAA GA 3', REVERSE -5 'CTT GGC CAT GTA GGT GGT CT 3'. PCR-amplifieringar genomfördes i en total volym av 20 | j, l, innehållande buffert, 20 mM framåt och bakåt primrar, Taq-polymeras, RNase-fritt vatten och cDNA mall. Varje PCR-amplifiering utfördes i dubbla brunnar i en GeneAmp PCR System 9700 termocykler (Applied Biosystems), med användning av följande betingelser: 94 ° C 3 minuter, 94 ° C 30 sekunder, 60 ° C 1 minut och 72 ° C 1 minut för 35 cykler. PCR-produkter visualiserades på en 1,5% agaros TAE-gel.

Immunohistokemi

Möss injicerades med 200 | il av BrdU-märknings lager reagens (5-brom-2'-deoxi-uridin Labeling och detektion kit II, Roche Diagnostics) 24 timmar före analys. Gastriska vävnader fixerades med Carnoys fixativ (60 ml etanol, 30 ml kloroform, 10 ml ättiksyra) under 16 timmar, inbäddades i paraffin, och 4 | j, m sektioner framställdes. Efter avparaffinering, var antigenåtervinning utförs genom upphettning av objektglasen under 10 minuter vid 100 ° C i 0,01 M natriumcitratbuffert (Antigen demaskera Solution, Vector Laboratories, Burlingame, CA). Endogen peroxidasaktivitet blockerades sedan genom att inkubera objektglasen i 3% väteperoxid /etanol under ytterligare 20 minuter. Sektioner blockerades därefter med användning av 5% BSA /Tris-buffrad saltlösning /0,1% Tween 80 (TBS-T) och inkuberades med en 1:20 spädning av anti-BrdU-antikropp (5-brom-2'-deoxi-uridin Labeling och Detection Kit II, Roche Diagnostics) vid 37 ° C under 30 minuter. BrdU färgutveckling utfördes i enlighet med tillverkarens protokoll. Sektioner blockerades sedan med 20% normalt getserum under 20 min och inkuberades med en 1:400 utspädning av biotin-konjugerad anti-RFP-antikropp (Abcam, ab34771) under 16 timmar vid 4 ° C följt av 1:500 utspädning av anti- kanin-IgG i 30 minuter och sedan visualiseras med avidin-biotin-komplex med hjälp av Vectastain Elite ABC Kit med användning av diaminobensidin (DAB) som substrat (Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA). Objektglasen monteras med Permount.

För adipocyt induktion, var stMSCs behandlades med HyClone DMEM containing10 ^{-8 M dexametason (Sigma, D4902) och 5 | j, g /ml insulin (Sigma, I6634). Alla celler fixerades med användning av 4% paraformaldehyd under 20 minuter vid RT. För att detektera differentiering var Oil Red O färgning utförs genom att tillsätta en 3,75% Oil Red O lösning, inkubera 5 minuter vid RT, därefter tvättning i vatten innan montering på objektglas med hjälp av Vectashield HardSet Mounting Medium. Bilder visades och fångade under ljusmikroskop med hjälp av en Olympus BX60 med en diagnostikinstrument "Spot" Kamera.}

immunofluorescens

stMSC ^{vect och stMSC ShhKO celler odlades på täck tills 70-80% konfluens, fixerades med 4% paraformaldehyd under 30 minuter vid rumstemperatur, permeabiliserade med PBS innehållande 0,5% TritonX-100 och blockerades med 2% donkey serum under en timme vid rumstemperatur. Cellerna inkuberades sedan med antingen en 1:50 spädning av anti-CD44 (Abcam ab65829) eller en 1:100 utspädning av anti-CD45 (Abcam ab10558) antikropp över natten vid 4 ° C. Alexa Fluor åsne-anti-kanin-488 användes som den sekundära antikroppen vid 1:1000 utspädning för en timme vid rumstemperatur. Cellerna motfärgades med en 1:2000 utspädning av nukleär färgning TO-PRO 3-jodid (Invitrogen, T3605) under 20 minuter vid RT före montering med hjälp av Vectashield HardSet Mounting Medium. Kanin IgG användes vid en 1:25 utspädning som en negativ kontroll under samma betingelser.}

Mage sektioner som samlats in från PBS eller IFNy behandlade möss blockerades med 20% normalt getserum och inkuberades med 1:400 anti- RFP-antikropp (Abcam, ab34771) under 16 timmar vid 4 ° C följt av 1:100 anti-kanin Alexa Fluor 488 (Invitrogen) sekundär antikropp under ytterligare en timme. Objektglasen därefter motfärgades med användning av anti-E-cadherin (BD Transduction Labs, 610181) -antikropp vid en 1:200 utspädning för en timme vid rumstemperatur, följt av 1:100 anti-mus-Alexa Fluor 633 (Invitrogen) sekundär antikropp. Alla prover monterades med användning av Vectashield Hardset Mounting Medium (VectaLabs). Bilder erhölls med användning av en Zeiss LSM510 Meta konfokalmikroskop.

Chemotaxis analys

kemotaxi utfördes baserat på etablerade protokoll [22]. Omvandlade stMSCs ströks ut i 24 väl Transwell plattor innehållande PET-membran med 8 um porer (BD Falcon). 2,5 × 10 ^{4-celler ympades i den apikala (övre) kammare i DMEM-medium innehållande 0,1% BSA. SDF-1α (rmSDF-1α, R &D Systems) sattes till den basolaterala (lägre) kammare vid koncentrationer av 0 till 150 ng /ml. Celler inkuberades under 6 timmar vid 37 ° C. Efter migrering fixerades cellerna i 4% paraformaldehyd under 30 minuter därefter färgades under 10 minuter med användning av en Wright-Giemsa-färg. Celler som återstår på toppen av membranet avlägsnades med en bomullspinne och återstående cellerna räknades i 5 fält vid 40 gångers förstoring. Antalet migrerande celler beräknades genom att dividera det genomsnittliga antalet migrerande celler i varje brunn med det genomsnittliga antalet migrerande celler i kontrollbrunnen.}

Statistisk analys

Resultat analyserades med antingen en students oparade t-test eller ANOVA med hjälp av kommersiellt tillgängliga program (GraphPad Prism, GraphPad Software, San Diego, CA). En P
värde < 0,05 ansågs signifikant

Resultat

IFNy-inducerad stMSC spridning förmedlas av Shh utsöndring och signal

roll. hedgehog-signalering som en mediator av IFNy-inducerad stMSC och wtMSC proliferation identifierades genom flödescytometri och cellcykelprogression. Efter behandling färgades cellerna med propidiumjodid och cellcykeln analyserades med flödescytometri på en vald enda cell populationen (Figur S1A). Figur 1 visar medelvärdena för procentuell fördelning cell vid olika cellcykelfaser i behandlingsgrupperna som visas i figurerna S1B-E. Figurerna S1B-E representerar diagram som visar förändringarna i cellcykelfaser. Medelvärden och statistisk signifikans som svar på alla behandlingar sammanfattas i figur S1F och G. Analys av rå fluorescens data visade en ökad andel stMSCs i S-fas och G _{2 /M-fas, och en minskad andel av celler i G 0 /G en fas som svar på rmIFNγ jämfört med de vehikelbehandlade celler (Figur 1A). Att identifiera den roll som utsöndrat Shh som en mediator av IFNy-inducerad stMSC proliferation använde vi anti-Hedgehog neutraliserande 5E1 monoklonal antikropp som binder till Shh-ligand och stör proteinbindning till receptorn Ptch [1]. Det proliferativa svaret av stMSCs till rmIFNγ var signifikant inhiberad med behandlings 5E1 antikropp (Figur 1A). Vid en jämförelse med de stMSCs, icke-transformerade wtMSCs svarade på samma sätt som svar på IFNy tyder den observerade ökningen i proliferation inte resultatet av omvandlingen ensam. IFNy betydligt inducerade andelen wtMSCs i S-fas, ett svar som blockerades av anti-Shh-antikropp (Figur 1B). Kollektivt Figur 1 visar att IFNy inducerar proliferation av både otransformerade och spontant transformerade MSC, ett svar som förmedlas av utsöndrat Shh.}

Tysta Shh Gene inom benmärgshärledda stMSCs

För att övergripande studera betydelsen av Hedgehog-signalering i BM-MSC spridning och rekrytering in vivo
, wtMSCs transfekterades till överuttrycker Shh medan stMSCs var transduced med lentivirala shRNAs mot Shh. En pLKO.1-puro bas Lentiviral vektor som uttrycker en kort hårnål sekvens mot utskrift av Shh-genen användes. Kontroll MSC cellinjer etablerades med wtMSC med endogen expression av Shh och transfektion av stMSCs med pLKO.1-puro bas lentivirusvektor (stMSC ^{vect). Fem lentivirala kloner, varje klon som uttrycker en annan kort hårnål sekvens, analyserades (stMSC ShhKO59-stMSC ShhKO63). Knockdown av Shh bekräftades genom Western blot-analys som visade 100% knockdown av Shh proteinuttryck i alla kloner jämfört med otransducerade celler (wtMSCs) och Shh överuttryckande cellinjer (wtMSC Shh och stMSC vect) ( Figur S2A). Klon stMSC ShhKO59 användes för efterföljande experiment och kommer att hänvisas till som stMSC ShhKO. Expression av pDsRed-Hyg-C1 plasmid som uttrycker rött fluorescerande protein (RFP) bekräftades genom immunblotting med användning av cell-lysat som samlats in från transducerade stMSCs (Figur S2a). Viktigt är wtMSCs stabilt transfekterade till överuttrycker Shh-protein, uttryckt Shh på en nivå som liknar de stMSCs (Figur S2a).}

För att kontrollera knockdown av Shh i MSC utan att förändra differentieringen av cellerna, en uttrycksmönstret för de klassiska CD markörer (CD29, CD106, CD105, CD44 och CD73) och SCA-1 genom att använda flödescytometri utfördes med hjälp av odlade stMSC ^{vect (Figur S2B) och stMSC ShhKO (Figur S2C) celler. Både stMSC vect och stMSC ShhKO celler var negativa för CD45 (Figur S3). Dessutom, båda stMSC cellinjerna kunde skilja på en fettceller fenotyp baserad på positiv Oil Red O färgning av fettdroppar som produceras (Figur S3). Sammantaget antyder dessa data att knockdown av Shh-protein i stMSCs inte ändra differentieringen av dessa celler.}

IFNy inducerar proliferation av wtMSCs och stMSCs i benmärg

För att bestämma effekten av IFNy på wtMSC och stMSC spridning in vivo
möss transplanterades med RFP-märkta wtMSC, wtMCS ^{Shh stMSC vect eller stMSC ShhKO celler och behandlades med rmIFNγ under 21 dagar. Efter IFNy behandling togs benmärgen skördades och analyserades med avseende på förändringar i cellcykeln och antalet RFP-positiva celler genom flödescytometri. IFNy inducerade en signifikant ökning av antalet av RFP-positiva celler i benmärgen av alla experimentella grupper med undantag av de djur som transplanterats med stMSC ShhKO-celler (figur 2A, B). Immunofluorescens av benmärg visade att det fanns en betydande ökning särskilt i antalet prolifererande RFP positiva celler som svar på IFNy som samlokaliserade av BrdU immunfärgning (Figur 2C, D). Detta stöddes ytterligare av figur S4A, B och C som visar representativ ljusspridningsanalys avslöjar en population av stMSCs som var positiva för RFP och har utgjorts av ungefär 0,1% av hela benmärgscellpopulationen. RFP-positiva celler gated för den inre cellpopulationen (figur S4C) och cellcykeln analyserades. Celler som samlats in från benmärgen hos möss som transplanterats med stMSC vect celler behandlade med rmIFNγ hade en signifikant större procentandel av celler i S-fas (55,5 ± 2,82%) jämfört med de möss som behandlats med PBS (32,9 ± 5,14%, P Hotel < 0,05 jämfört med stMSC vect transplanterade möss behandlade med PBS) (Figur S4F). Procentandelen av celler i S-fasen uppsamlades från benmärgen av möss som transplanterats med stMSC ShhKO behandlades med rmIFNγ var inte signifikant olika (32,9 ± 2,64%) jämfört med de möss som behandlats med PBS (38,4 ± 1,47%, P Hotel > 0,05 jämfört med stMSC ShhKO transplanterade möss behandlade med PBS) (Figur S4i). Siffror S4D, E, G och H representerar diagram som visar förändringarna i cellcykelfaser. Således inducerar IFNy spridning av både wtMSCs och stMSCs In vivo
i benmärgen, ett svar som verkar vara förmedlas av Shh signalering.}

In vivo
Rekrytering av wtMSCs och stMSCs till magslemhinnan som svar på IFNy

för att identifiera rollen av Hedgehog-signalering som förmedlare av IFNy-inducerad stMSC rekrytering till gastric epitel, möss som transplanterats med stMSC ^{vect och stMSC ShhKO celler behandlades med PBS eller IFNy under 21 dagar. Magar samlades sedan och rekrytering av RFP-märkta stMSC vect och stMSC ShhKO celler som analyserats av immunohistokemi (Figur 3). stMSC vect celler rekryterades till den gastriska slemhinnan hos möss som injicerats med IFNy (figur 3C, D) jämfört med frånvaro av RFP-taggade stMSC vect celler i magarna hos PBS-injicerade möss (Figur 3A, B ). stMSC ShhKO celler transplanterade i möss injicerade med IFNy inte rekryterats till magslemhinnan (figur 3E, F). Expression av RFP-taggade stMSC vect celler med IFNy behandling bekräftades genom RT-PCR (figur 3G). Att identifiera om rekrytering av MSCs till magslemhinnan som svar på IFNy var unika för de stMSCs, upprepades experimentet med användning av antingen wtMSCs eller wtMSCs överuttrycker Shh (wtMSC Shh). Även om både wtMSC och wtMSC Shh celler detekterades i magen på IFNy-behandlade möss, fanns betydligt högre antal wtMSC Shh och stMSC vect celler i magslemhinnan jämfört med wtMSC cellen transplanteras gruppen (figur 3H). Kollektivt antyder dessa data att Shh-signalering är troligt att mediera rekryteringen av MSCs till magslemhinnan som svar på IFNy.}

Det var en signifikant ökning i antalet prolifererande celler i magslemhinnan som svar på IFNy -behandlat wtMSC ^{Shh och stMSC vect transplanterade möss jämfört med PBS-injicerade möss (figur 4A-D, Figur S5A-F). Emellertid MSC: er var BrdU negativa (figur 4B, C och Figur S5A-D). Även stMSC ShhKO celler transplanterade i möss injicerade med IFNy inte rekryterats till magslemhinnan, var det ingen skillnad i epitelial proliferation mellan PBS och IFNy behandlingar i denna försöksgrupp, vilket tyder på ökad MSC-härlett Shh kan krävas för att stödja denna ökad spridning (Figur 4D). Även om wtMSCs rekryterades till magslemhinnan som svar på IFNy, var det ingen skillnad i epitelial proliferation mellan PBS och IFNy behandlingar (Figur 4D). Dessa data tyder på att Shh signalering inom wtMSCs Shh och stMSCs som svar på IFNy inducerar proliferation inom mag epitel. IFNy ensam, i frånvaro av stMSCs, inducerar inte proliferation i magslemhinnan som bekräftar denna effekt är inte relaterad till enbart inflammation.}

För att avgöra om minskad stMSC spridning, efter rekrytering, var associerad med celladhesion inom gastric epitel, magar sedan co-färgades för E-cadherin och RFP (Figur 4G-i). PBS-behandlade möss som transplanterats med RFP-märkta stMSC ^{vect celler visade ingen rekrytering av celler till magsäckens slemhinna (Figur 4G). I överensstämmelse med figur 3, IFNy-injicerade möss som transplanterats med RFP-märkta stMSC vect celler visade markant rekrytering av celler till magslemhinnan (figur 4H). RFP-märkta stMSC Vect celler samlokaliserade med E-cadherin (Figur 4G, I) stöder att rekryterade cellerna hade inympats i gastric epitel.}

Hedgehog-signalering förmedlar uttryck av Focal Adhesion Protein som svar till SDF-1α kemokin

Vi valde att undersöka SDF-1α /CXCR4 signalering axel som det har fastställts att denna signalväg främjar MSC rekrytering [23], [24].

• PLOS ONE: Oväntad Headless och svanslösa fisk i magen innehåll makrillhaj Isurus oxyrinchus
• PLoS ONE: Insektsätande fladdermöss Digest Chitin i magen användning av sura Däggdjur Kitinas