Финансирование:. Эта работа Работа выполнена при поддержке американского онкологического общества Research Scholar Award 119072-RSG-10-167-01-MPC (Y. Zavros), Альберт Дж Райан стипендии Фонда (J. Donnelly) и частично через пищеварительный центр здоровья Цинциннати Детский медицинский здравоохранения Центр (DHC: Скамья для Прикроватная исследований в педиатрии заболеваний пищеварительной системы) CHTF /SUB DK078392. Авторы хотели бы поблагодарить за помощь Моника DELAY менеджер Исследования проточной цитометрии ядра в Отделе ревматологии в Детской больницы Цинциннати медицинский центр, поддержанный частично Национальным институтом здоровья (NIH) AR-47363. Весь поток цитометрии данные были получены с использованием оборудования, обслуживаемого Исследовательском проточной цитометрии Ядра в Отделе ревматологии в Детской больницы Цинциннати медицинский центр, поддержанный частично NIH AR-47363. Доноры не играет никакой роли в дизайн исследования, сбора и анализа данных, решение о публикации или подготовки рукописи
<р> Конкурирующие интересы:.. Авторы заявили, что не существует никаких конкурирующих интересов
Введение
<р> Существует четко установлено роль Еж Соник (Тсс) сигнализации в развитии рака [1], [2], [3]. Рост клеток в опухолях желудочно-кишечного тракта, которые включают пищевода, желудка, желчных путей и поджелудочной железы регулируются эндогенной экспрессии Hedgehog лигандов, таких как Shh [1]. Связывание Hedgehog лиганда с его рецептором, исправленными (Ptch), приводит к удалению ингибирования Ptch на сглажена (SMO). Это удаление Ингибирование Smo приводит к активации Гли-семейства Hedgehog факторов транскрипции и впоследствии рост опухоли, которые могут быть заблокированы Hedgehog нейтрализующих антител [1]. В то время как ассоциация между Shh и раком желудка ясно, функциональная роль Shh в развитии и прогрессии рака желудка в значительной степени неизвестно. Кроме того, механизм, который регулирует выработку Shh в пределах микросреды опухоли еще предстоит определить.
Helicobacter Pylori (H.) материалы и методы Животные RFP-меченого stMSCs были трансдуцированная с пятью различными клонами МИССИЯ лентивирусов трансдукции частиц, содержащих различные последовательности shRNA для Shh и pLKO.1-Puro компонент, придающий устойчивость к пуромицин (Sigma Aldrich). ЗП-меченый stMSCs инкубировали с лентивирусов частиц с ExpressMag магнитными гранулами (Sigma Aldrich) на магните (OZ Biosciences Супер магнитная пластина, MF10000) в течение 15 минут, клетки удаляли из магнита, инкубировали еще в течение 16 ч, а затем помещают в выбор пуромицин (DMEM, Культура среде, содержащей 10% фетальной сыворотки теленка, 1% пенициллина /стрептомицина, 10 мкг /мл пуромицин) в течение от 7 до 10 дней. Эффективная доза пуромицин необходимы для устранения не-трансдуцированных клеток определяли ранее через пуромицин глушения кривой, испытанной концентрации от 0 до 50 мкг /мл (данные не показаны). Трансдуцированные клетки обозначается уникальным клон идентификационного номера с клеточными линиями трансдуцированных с shRNA для Shh (stMSC ShhKO) насчитывала 59-63. PLKO.1-Puro вектор трансдуцированная клеточная линия RFP-MSC (stMSC Vect) служил в качестве контроля для эндогенного уровня экспрессии гена Shh. Вестерн-блот-анализ был использован для подтверждения Shh нокдаун и экспрессию RFP. Иммуногистохимия Результаты анализировали с помощью или непарного критерия Стьюдента или ANOVA с использованием коммерчески доступного программного обеспечения (GraphPad Prism, GraphPad Software, San Diego, CA). A значение P Результаты IFN &gamma-индуцированной stMSC пролиферации опосредуется Тсс секрецией и Сигнализации Для того, чтобы определить влияние на IFN γ wtMSC и stMSC пролиферации в естественных условиях Мы решили исследовать SDF-1α /сигнализации CXCR4 ось, как было установлено, что этот сигнальный путь способствует MSC набора [23], [24].
бактериальная колонизация вызывает хроническое воспаление, которое последовательно, связанный с приводит к раку желудка [4]. Наиболее распространенным и вреден иммунный ответ включает Th1 провоспалительных цитокинов, и прежде всего IFN γ от Т-клеток, а также IL-1 и TNF-alpha из ткани или вторгшиеся макрофаги [5], [6], [7], [8], [ ,,,0],9]. Действительно, провоспалительного цитокина IFN γ было показано, что вносит вклад в патогенез и развитие желудочной метаплазии [5], [9], [10] и рак [10]. При воспалении-индуцированных раков, сигнальный путь Hedgehog посредничает IFN, индуцированный опухолью развития [11], [12], [13]. В частности, Тсс является ген-мишень и IFN γ Hedgehog сигнализации медиатор-IFN, индуцированной пролиферации [12].
<Р> Во HELICOBACTER
инфекция, хроническое воспаление совпадает с наймом из костного мозга мезенхимальные стволовые клетки (БМ-MSCs) [14], [15]. В хронически воспаленные желудок БМ-MSCs набираются из костного мозга в желудок и дифференцируются в рак связаны фибробластов (CAFS), которые играют важную роль в управлении развития рака [14]. Несмотря на то, очевидно, участвуют в развитии рака желудка, механизм регуляции пролиферации и набор злокачественно трансформированные BM-ПКЦ к желудку при хроническом воспалении в значительной степени неизвестен. Интересно, что Тсс, как сообщается, индуцируют пролиферацию и дифференцировку БМ-MSCs [16]. Тсс также была признана в качестве потенциального хемоаттрактанту для мозга полученных клеток костного при повышающей регуляции в ответ на хроническое воспаление [17], [18].
<Р> На основании ассоциации между IFN γ и Shh, мы предполагаем, что IFN γ индуцирует Shh сигнализации в рамках ПКЦ, способствующих миграции клеток в желудке. Чтобы проверить эту гипотезу, данное исследование сравнивает в естественных условиях
BM-MSC вербовку в слизистой оболочке желудка в ответ на IFN, с использованием спонтанно трансформированной линии мезенхимальных стволовых клеток (stMSC) по сравнению с нетрансформированных BM-ПКЦ. В культуре, БМ-MSCs склонны к мутации со старением и демонстрируют клинически значимых мутаций в гене р53 [19]. При длительном культуры БМ-ПКЦ "спонтанно преобразование" (stMSCs), могут быть размножены в пробирке в течение длительных периодов времени и демонстрируют рак продвижения фенотип [19]. В настоящем исследовании используются оба stMSCs и непреобразованной BM-(МСК) wtMSCs, что чрезмерная экспрессирует сигнализации Hedgehog. Использование клеточных линий wtMSC и stMSC и В естественных условиях
и в пробирке
, мы показали, что IFN &gamma-индуцированной пролиферации и набора клеточных линий MSC в желудке является ответом, который опосредуется Shh секреции и сигнализации.
<р> C57BL /6 (штамм�664) и IRG (008705 штамм #) мышей, используемых для этих исследований были приобретены у Джексона лаборатории. Все исследования мыши были одобрены Университета Цинциннати Институциональные уходу и использованию животных комитета (IACUC), которая поддерживает Американской ассоциации по оценке и аккредитации лабораторных животных (AAALAC) объекта.
из костного мозга Спонтанно Преобразованный Mesenchymal Стволовые клетки (stMSC) и Non-трансформированных BM-MSCs (wtMSC) культура и Лечение
<р> клеточные линии wtMSC были созданы из цельного костного мозга мышей IRG и культивированный к прохождению 5 до трансфекции с последующим техническим обслуживанием при низких номер прохода (&л; P10) до экспериментального использования. Весь костный мозг вымывается из бедренной и большеберцовой костей мышей для последующей культуры и прохождения пластической клейкого MSC населения [20]. использовались Спонтанно преобразованные из костного мозга мезенхимальных стволовых клеток (stMSCs), трансфицированные плазмидой pDsRed-Hyg-C1, выражающей красный флуоресцентный белок [21]. Все клетки культивировали с использованием HyClone DMEM культуральной среды, дополненной 10-15% фетальной сыворотки теленка и 1% пенициллина-стрептомицина при нормальных условиях. MSCs культивированный для лечения высевали в 6-луночные планшеты и позволяли расти до 70-80% слияния в нормальных средах затем голодали в течение ночи в сыворотке. После расширения культуры, мышь мезенхимальных стромальных клеток Маркер Антитело Панель была использована для обозначения линии MSC клеток для Sca-1, CD106, CD105, CD73, CD29, CD44 и гемопоэтических маркеров CD45 и CD11b (R &Amp; D Systems, SC018). Клетки суспендировали при концентрации 1 × 10 6 клеток /мл и окрашивали в соответствии с протоколом производителя. Затем клетки инкубировали с AlexaFluor 488 при 1:100 разведении в течение 30 минут при температуре 4 ° С. Фиксацию проводили в течение 15 минут при комнатной температуре с использованием коммерчески доступного реагента (Invitrogen GAS001S5). измеряли интенсивность флуоресценции с помощью проточной цитометрии с использованием программного обеспечения BD FACSCalibur и CellQuestPro. wtMSCs и stMSCs обрабатывали носителем, рекомбинантный мышиного гамма-интерферона (rmIFNγ, 100 нМ, R &Amp; D Systems) или анти-Тсс антитело 5E1 (предварительно обработанных в течение 6 часов) плюс rmIFNγ в течение 24 часов. Обработанные клетки затем анализировали на изменения в клеточного цикла методом проточной цитометрии.
Еж Соник (Тсс) Нокдаун от Лентивирус-опосредованной Шпилька РНК короткий (shRNA) с помощью stMSCs
Трансфекция wtMSCs к сверхэкспрессии Тсс
<р> плазмида (Origene CW101340) объединяли с реагентом Origene Turbofectin при соотношении 0 :1, 1:01, 2:01, 3:01 и 4:01 и инкубировали в течение 15 минут при комнатной температуре. Реагент трансфекции затем добавляли по каплям к wtMSCs на 70% слияния и оставляли выдерживаться в течение 24 часов, прежде чем клетки были помещены под селекции в нормальных средах с пуромицин. Эффективная доза пуромицин необходимы для устранения не-трансфецированных клеток определяли ранее проводят через концентрации тестирования кривая пуромицин Уничтожить от 0 до 10 мкг /мл (данные не показаны). Самая низкая концентрация, которая убила все нетрансфецированные клетки на 3-4 дня после обработки была установлена как 2 мкг /мл.
В естественных условиях stMSC Набор и пролиферации
<р> C57BL /6 мышей были пересажены с 1 × 10 6 wtMSCs, wtMSCs Тсс, stMSCs Vect или stMSCs ShhKO с помощью инъекции в хвостовую вену. Через три дня после трансплантации, мышам вводили носитель (стерильный PBS, внутрибрюшинно) или rmIFNγ (1 мкг /день, внутрибрюшинно) в течение 7 или 21 дней. Мышам вводили 200 мкл BrdU мечение запас реагентов (5-бром-2'-дезокси-уридин маркировки и обнаружения Kit II, Roche Diagnostics, внутрибрюшинно) за 24 часа до анализа, а также участки желудка фиксировали в 4% параформальдегида, парафин и 3 мкМ разделов, подготовленных для иммуногистохимического и иммунофлуоресцентного анализов. Весь костный мозг был выделен из бедренных костей одной и той же мышей с помощью PBS смыва. Эритроциты лизируют с использованием красных кровяных клеток лизис буфера (4,14 г NH <суб> 4Cl, 0,5 г КНСО <югу> 3, 0,5 М ЭДТА в 500 мл, рН 7.2-7,4). Приблизительно 11 × 10 6 клетки фиксировали и проницаемыми использованием Caltag Laboratories проточной цитометрии Kit, в соответствии с протоколом производителя (Invitrogen, ГАЗ-004) и окрашивали с использованием анти-RFP FITC-конъюгированные антитела (1:100, Abcam, ab34764 ), а затем окрашивали с использованием Vybrant DyeCycle Ruby, пятно (Invitrogen) в соответствии с протоколом производителя. Флуоресцентный анализировали с использованием системы BD LSRII проточном цитометре. Для того, чтобы проанализировать специфически RFP-MSCs, стробирования был использован для анализа клеточного цикла только положительных клеток FITC. Пик флуоресценции анализировали с помощью программного обеспечения ModFitLT, чтобы определить процент населения в каждой фазе клеточного цикла.
Проточная цитометрия и клеточного цикла Анализ
<р> Клетки были сывороточные голодали 16 часов до анализа , Клетки фиксировали охлажденным льдом 70% -ного этилового спирта /PBS в течение 15 минут при -20 ° С, промывают и затем окрашивают пропидийиодидом в течение 45 минут. Измеренные значения пика флуоресценции на общее число клеток были получены с помощью программы CellQuest Pro (Becton Dickson). Процент клеток из популяции в каждой фазе клеточного цикла рассчитывали из измерений пика флуоресценции с помощью анализа с программным обеспечением ModFit LT. Проточной цитометрии с использованием системы FACSCalibur ™ (Becton Dickson) проводили на всех трансдуцированных клеток с помощью мыши мезенхимальных стволовых клеток Маркер антител панели в соответствии с протоколом производителей (R &Amp; D Systems, SC018).
иммунопреципитация и Западной блот-анализ
<р> Клеточные лизаты получали с использованием M-PER млекопитающим экстракции белка реагента (Thermo Scientific, IL), дополненную с ингибиторами протеазы (Roche) в соответствии с протоколом производителя. Образцы СМИ из клеток концентрировали с использованием 15 мл Amicon Ультра центробежный фильтр устройства (Millipore). Клеточные лизаты (100 мкг белка) и средства массовой информации подвергали иммунопреципитации с использованием анти-Тсс 5E1 антитела (2 мкг) при 4 ° С в течение 16 часов. Белок A /G агарозные гранулы были добавлены (20 мкл, Santa Cruz Biotechnology, CA), и образцы инкубировали при 4 ° С в течение 16 часов. После 16 ч инкубации, иммунопреципитаты промывали 3 раза с использованием PBS и ресуспендировали в 40 мкл буфера для Laemmli, содержащего бета-меркаптоэтанола (Bio-Rad Laboratories, CA) перед загрузкой на 4-20% Трис-глицина градиентном геле. Гели работать на 80 В, 3,5 ч, белок переносили на нитроцеллюлозные мембраны при 105 В, через 1-2 часа, а затем блокировали в течение 1 часа при комнатной температуре с использованием KPL Detector Block (Kirkegaard &Amp; Perry Laboratories, Inc.). Мембраны инкубировали в течение ночи при 4 ° С с 1:200 разбавлении Shh антитела (N-19, Santa Cruz), за которым следует 1-часовой инкубации при 1:100 разведении AlexaFluor анти-коза 680 (Invitrogen). Пятна визуализируют с помощью сканирующего денситометра вместе с программным обеспечением для анализа (Odyssey Инфракрасная Imaging System Software).
Выделение РНК и RT-PCR
<р> Общую РНК выделяли из ткани желудка с использованием реагента тризола в соответствии с протокол производителей (TriReagent, Научно-исследовательский центр молекулярной, Inc.). Высокой емкости кДНК с обратной транскрипцией Kit (Applied Biosystems) использовали для синтеза кДНК из РНК ниже рекомендованного протокола. Для каждого образца, 60 нг РНК подвергали обратной транскрипции с получением примерно 2 мкг полной кДНК, которая затем использовали для ОТ-ПЦР. RFP последовательности праймеров были использованы следующим образом: FORWARD -5 'CCC ВКТ AAT GCA GAA GAA GA 3', REVERSE -5 'СТТ GGC CAT GTA GGT GGT CT 3'. ПЦР-амплификацию проводили в общем объеме 20 мкл, содержащий буфер, 20 мМ прямого и обратного праймеров, Taq-полимеразу, РНКазы без воды и матрицы кДНК. Каждый ПЦР-амплификацию проводили в двух лунках в GeneAmp PCR System 9700 амплификатор (Applied Biosystems), с использованием следующих условий: 94 ° C 3 минуты, 94 ° C 30 секунд, при 60 ° C 1 минута и 72 ° C 1 минута в течение 35 циклы. ПЦР-продукты визуализировали на 1,5% геле агарозы ТАЕ.
<р> Мышам вводили 200 мкл BrdU мечение наличии реагента (5-Бром-2'-дезокси-уридин Этикетировочное и обнаружение Kit II, Roche Diagnostics) за 24 часа до анализа. Желудочный ткани фиксировали с фиксирующим средством Карнуа (60 мл этанола, 30 мл хлороформа, 10 мл уксусной кислоты) в течение 16 часов, залитых в парафин, и получали 4 мкм секций. После депарафинизации, извлечение антигена проводили путем нагрева слайдов в течение 10 минут при температуре 100 ° С в 0,01 М натрий-цитратном буфере (Антиген Разоблачение Solution, Vector Laboratories, Burlingame, CA). Активность эндогенной пероксидазы блокировали путем инкубации слайды в 3% перекиси водорода /этанол в течение еще 20 минут. Срезы затем блокировали с использованием 5% БСА /Трис-солевой буферный раствор /0,1% твин-80 (TBS-T), и инкубировали с 1:20 разбавлением анти-BrdU антителами (5-бром-2'-дезокси-уридин обозначая и Detection Kit II, Roche Diagnostics) при 37 ° С в течение 30 минут. Развитие цвета BrdU проводили в соответствии с протоколом производителя. Срезы затем блокировали 20% нормальной козьей сывороткой в течение 20 минут и инкубировали с разведением 1:400 биотин-конъюгированные анти-RFP антителом (Abcam, ab34771) в течение 16 часов при 4 ° С с последующим разбавлением 1:500 анти- кролика IgG в течение 30 мин, а затем визуализировали с авидинбиотиновом комплексов с использованием набора для Vectastain Elite ABC с использованием диаминобензидина (DAB) в качестве субстрата (Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA). Слайды были установлены с помощью предметный столик Permount.
<Р> Для индукции адипоцитов, stMSCs обрабатывали Hyclone DMEM containing10 -8 М дексаметазона (Sigma, D4902) и 5 мкг /мл инсулина (Sigma, I6634). Все клетки фиксировали с использованием 4% параформальдегида в течение 20 минут при комнатной температуре. Для выявления дифференциации, окрашивание масляным красным O осуществляли путем добавления 3,75% раствор масла Red О, инкубирование 5 минут при комнатной температуре, а затем промывку в воде перед установкой на предметном стекле с использованием Vectashield HardSet гистологическая среда. Изображения были просмотрены и захватили под световым микроскопом с использованием Olympus BX60 с камерой диагностических инструментов "спот".
Иммунофлуоресценции
<р> stMSC Вект и stMSC ShhKO клетки выращивали на покровных до 70-80% сплошности, фиксировали 4% параформальдегидом в течение 30 минут при комнатной температуре, пермеабилизовали PBS, содержащим 0,5% Тритон Х-100 и блокировали 2% осла сыворотки в течение 1 часа при комнатной температуре. Затем клетки инкубировали либо с 1:50 разбавлением анти-CD44 (Abcam ab65829) или 1:100 разбавлением анти-CD45 (Abcam ab10558) антитела в течение ночи при температуре 4 ° С. Alexa Fluor осла против кроличьего 488 использовали в качестве вторичного антитела в разбавлении 1:1000 в течение 1 часа при комнатной температуре. Клетки затем контрастно с 1:2000 разбавлении окрашивающим ядра К-PRO 3-йодид (Invitrogen, T3605) в течение 20 минут при комнатной температуре до начала монтажа с использованием Vectashield HardSet гистологическая среда. Кролик IgG использовали в разведении 1:25 в качестве отрицательного контроля при тех же самых условиях.
<Р> Желудочные секции, собранные из PBS или мышей, обработанных IFN γ блокировали 20% нормальной козьей сыворотки и инкубировали с анти-1:400 ЗП антитела (Abcam, ab34771) в течение 16 часов при 4 ° с с последующим 1:100 анти-кроличьего Alexa Fluor 488 (Invitrogen) вторичным антителом в течение еще 1 часа. Срезы затем контрастировали с использованием анти-Е-кадгерина (BD Transduction Labs, 610181) антитела при разведении 1:200 в течение 1 часа при комнатной температуре с последующим 1:100 анти-мыши Alexa Fluor 633 (Invitrogen) вторичным антителом. Все образцы были установлены с помощью Vectashield Hardset Монтаж среды (VectaLabs). Изображения были получены с помощью конфокальной микроскопии Zeiss LSM510 META.
хемотаксиса Анализ
<р> Анализ хемотаксиса осуществляли на основе установленных протоколов [22]. Трансдуцированные stMSCs высевали в 24-луночные планшеты, содержащие Transwell ПЭТ мембраны с 8 мкм порами (BD Falcon). 2,5 × 10 4 клетки были высеяны в апикальной (верхней) камеры в DMEM среде, содержащей 0,1% бычьего сывороточного альбумина. SDF-1α (rmSDF-1α, R &Amp; D Systems) добавляли к базолатеральной (нижней) камеры при концентрации от 0 до 150 нг /мл. Клетки инкубировали в течение 6 часов при температуре 37 ° С. После миграции, клетки фиксировали в 4% параформальдегида в течение 30 минут, а затем окрашивали в течение 10 минут с использованием пятно Райт-Giemsa. Клетки, оставшиеся на верхней стороне мембраны были удалены с ватным наконечником аппликатора и оставшиеся клетки подсчитывали в 5 полях при 40-кратном увеличении. Число мигрирующих клеток рассчитывали путем деления среднего числа мигрирующих клеток в каждую лунку по среднему количеству мигрирующих клеток в контрольной лунке.
Статистический анализ
&л; 0,05 считали значимым
<р> Роль. передача сигналов Hedgehog в качестве медиатора IFN &gamma-индуцированной пролиферации stMSC и wtMSC идентифицировали с помощью проточной цитометрии и клеточного цикла. После обработки клетки окрашивали пропидийиодидом и клеточного цикла анализировали с помощью проточной цитометрии на одной выбранной популяции клеток (рис S1A). На рисунке 1 представлены средние значения распределения клеток в процентах в различных фазах клеточного цикла в группах лечения, показанных на рисунках S1B-E. На рисунках S1B-E представляют собой графики, показывающие изменения в фазах клеточного цикла. Средние значения и статистической значимости в ответ на все виды лечения суммированы на рисунке S1F и G. Анализ исходных данных флуоресценции показал увеличение доли stMSCs в S фазе и G <югу> 2 /M фазы и пониженный процент клеток в G <югу> 0 /G <югу> 1 фаза в ответ на rmIFNγ по сравнению с обработанных носителем клеток (Рис. 1А) Для того, чтобы определить роль секретируемого Shh в качестве медиатора-IFN, индуцированной пролиферации stMSC мы использовали анти-еж нейтрализующее 5E1 моноклональное антитело, которое связывается с Shh лиганда и нарушает связывание с рецептором Ptch белка [1]. Пролиферативный ответ stMSCs до rmIFNγ была значительно ингибировали с обработкой 5E1 антителом (Рис. 1А) По сравнению с stMSCs, не трансформированные wtMSCs ответил так же в ответ на IFN &gamma свидетельствует наблюдаемое увеличение пролиферации не результат преобразования в одиночку. IFN γ существенно индуцированный процент wtMSCs в фазе S, ответ, который был блокирован анти-Shh антитела (рис 1B). Коллективно На рисунке 1 показано, что IFN γ индуцирует пролиферацию обоих нетрансформированных и спонтанно трансформированных MSCs, ответ, который опосредуется секретируемого Shh.
Отключение Shh гена в из костного мозга stMSCs
<р> Для комплексного изучение роли сигнального пути Hedgehog в пролиферации BM-MSC и набора в естественных условиях
, wtMSCs трансфицировали к чрезмерному экспресс Тсс в то время как stMSCs были трансдуцированных с лентивирусов shRNAs против Shh. Используют pLKO.1-Puro база лентивирусов вектор экспрессии короткую последовательность шпилька против транскрипта гена Shh. клеточные линии управления MSC были созданы с помощью wtMSC с эндогенной экспрессии Shh и трансфекции stMSCs с pLKO.1-Puro база лентивирусов вектора (stMSC Vect). Пять лентивирусов клонов, каждый клон, экспрессирующий другую короткую последовательность шпилька, были проанализированы (stMSC ShhKO59-stMSC ShhKO63). Нокдаун Shh была подтверждена с помощью Вестерн-блот-анализа, который показывает 100% -ное нокдаун экспрессии белка Shh во всех клонах по сравнению с untransduced клетками (wtMSCs) и Shh сверхэкспресирующим клеточных линий (wtMSC Тсс и stMSC Вект) ( Рисунок S2A). Клон stMSC ShhKO59 использовали для последующих экспериментов и будет называться stMSC ShhKO. Выражение pDsRed-Hyg-C1 плазмиды, экспрессирующей красный флуоресцентный белок (RFP) была подтверждена иммуноблота с использованием клеточного лизата, собранной из преобразованных stMSCs (рис S2A). Важно отметить, что wtMSCs стабильно трансфицировали сверхэкспрессии белка Shh, выраженная Shh на том же уровне с stMSCs (рис S2A).
<Р> Чтобы проверить нокдаун Shh в MSCs без изменения дифференцировки клеток, рентгенограмма выражение для классических маркеров CD (CD29, CD106, CD105, CD44 и CD73) и ЗОБ-1 с использованием проточной цитометрии проводили с использованием культивируемых stMSC Vect (рис s2b) и stMSC клетки ShhKO (рис S2C). Оба stMSC Вект и stMSC ShhKO клетки были отрицательными для CD45 (рис S3). Кроме того, обе клеточные линии stMSC были способны дифференцироваться в адипоцитов фенотип на основе положительного масляным красным O окрашивание липидных капель, производимых (рис S3). В совокупности эти данные свидетельствуют о том, что нокдаун белка Shh в stMSCs не изменило дифференцировку этих клеток.
IFN γ Стимулирует пролиферацию wtMSCs и stMSCs в костном мозге
мышей трансплантировали RFP-меченый wtMSC, wtMCS Shh, stMSC VECT или stMSC ShhKO клетки и обрабатывали rmIFNγ в течение 21 дней. После того, как лечение IFN γ, костный мозг собирали и анализировали на содержание изменений в клеточном цикле и количество RFP-положительных клеток с помощью проточной цитометрии. IFN γ вызвало значительное увеличение числа RFP позитивных клеток в костном мозге всех экспериментальных групп для тех животных, которым трансплантированы stMSC кроме ShhKO клеток (Фигура 2А, В). Иммунофлуоресценции костного мозга показал, что существует значительное увеличение конкретно числа пролиферирующих RFP-положительных клеток в ответ на IFN γ в качестве со-локализованы BrdU иммунным окрашиванием (фиг.2с, D). Это было также поддержано Рисунок S4A, B и C, который показывает представительный анализ светового рассеяния, раскрывающий население stMSCs, которые были положительными в отношении RFP и составила около 0,1% от всей популяции клеток костного мозга. RFP-позитивные клетки закрытого типа для одной популяции клеток (рис S4C) и клеточного цикла анализируемого. Клетки, собранные из костного мозга мышей с трансплантированной stMSC Вект клетки, обработанные rmIFNγ имели значительно больший процент клеток в S-фазе (55,5 ± 2,82%) по сравнению с теми мышей, которым вводили PBS (32,9 ± 5,14%, P
&л; 0,05 по сравнению с stMSC VECT трансплантированных мышей, которым вводили PBS) (Рисунок S4F). Процент клеток в S-фазе собирали из костного мозга мышей с трансплантированной stMSC ShhKO обработанных rmIFNγ существенно не различались (32,9 ± 2,64%) по сравнению с теми мышей, которым вводили PBS (38,4 ± 1,47%, <эм> P
> 0,05 по сравнению с stMSC ShhKO трансплантированных мышей, которым вводили PBS) (Рисунок S4i). Цифры S4D, E, G и H представляют собой участки, показывающие изменения в фазах клеточного цикла. Таким образом, IFN γ индуцирует пролиферацию обоих wtMSCs и stMSCs В естественных условиях
в костном мозге, в ответ, что, как представляется, быть опосредована сигнализации Тсс.
В естественных условиях
Набор wtMSCs и stMSCs к слизистой оболочке желудка в ответ на IFN γ
<р> Для того, чтобы определить роль передачи сигналов Hedgehog в качестве медиатора IFN &gamma-индуцированной вербовки stMSC в эпителии желудка мышей с трансплантированной stMSC Вект и stMSC клетки ShhKO обрабатывали PBS или IFN γ в течение 21 дней. Желудки были затем собраны и набор RFP-меченый stMSC Вект и клетки stMSC ShhKO анализировали с помощью иммуногистохимии (Рисунок 3). stMSC Вект клетки набирали в слизистой оболочке желудка у мышей, которым вводили IFN γ (рис 3C, D) по сравнению с отсутствием RFP-меченый stMSC Вект клеток в желудках ПБС-инъецированных мышей (рис 3A, B ). stMSC ShhKO клетки трансплантировали мышам, которым вводили IFN γ не были приняты на работу в слизистой оболочке желудка (рис 3E, F). Выражение RFP-меченый stMSC Вект клетки с обработкой IFN γ было подтверждено методом ОТ-ПЦР (рис 3G). Для того, чтобы определить, был ли набор MSCs к слизистой оболочке желудка в ответ на IFN γ уникальные для stMSCs, эксперимент был повторен с использованием либо wtMSCs или wtMSCs сверхэкспресирующим Shh (wtMSC Shh). Хотя оба wtMSC и wtMSC клетки Shh были обнаружены в желудках IFN &gamma-обработанных мышей, были значительно более высокие числа wtMSC Тсс и stMSC Vect клеток в слизистой оболочке желудка, по сравнению с клеткой wtMSC пересадили группа (рис 3H). Итак, эти данные указывают на то, что передача сигналов Shh может опосредовать набор ПКЦ к слизистой оболочке желудка в ответ на IFN γ.
<Р> Был значительное увеличение числа пролиферирующих клеток в слизистой оболочке желудка в ответ на IFN γ -обработанной wtMSC Тсс и stMSC Vect пересаженных мышей по сравнению с PBS-вводили мышам (Рисунок 4A-D, рис S5A-F). Тем не менее, были BrdU MSCs отрицательным (рис 4В, С и рис S5A-D). Хотя stMSC ShhKO клетки трансплантировали мышам, которым вводили IFN γ не были набраны на слизистую оболочку желудка, не было никакой разницы в эпителиальной пролиферации между PBS и IFN, лечения в этой экспериментальной группе, что предполагает увеличение MSC-производного Shh может потребоваться для поддержки этого повышенную пролиферацию (рис 4D). Кроме того, несмотря на то wtMSCs были набраны в слизистой оболочке желудка в ответ на IFN γ, не было никакой разницы в эпителиальной пролиферации между процедурами PBS и IFN, (рис 4D). Эти данные свидетельствуют о том, что передача сигналов Shh в wtMSCs Shh и stMSCs в ответ на IFN γ индуцирует пролиферацию в эпителии желудка. IFN γ в одиночку, при отсутствии stMSCs, не индуцирует пролиферацию в слизистой оболочке желудка, подтверждающее этот эффект не связан с одной только воспаления.
<Р> Чтобы определить, является ли уменьшилось пролиферации stMSC, после набора, был связан с клеточной адгезии в пределах желудочного эпителия, желудки были затем совместно окрашивали для Е-кадгерина и RFP (рис 4G-I). PBS, обработанных мышей, которые были пересажены с RFP-меченый stMSC Вект клетки не показали набора клеток в слизистой оболочке желудка (рис 4G). В соответствии с фиг.3, IFN-вводили мышам, которые пересаживались с RFP-тегами stMSC Вект клеток приводила к заметному набор клеток в слизистой оболочке желудка (рис 4H). RFP-меченый stMSC VECT клетки колокализуются с Е-кадгерина (рис 4G, I), поддерживающие, что набраны клетки были привиты в эпителии желудка.
Hedgehog Signaling опосредует экспрессию белка фокальные контакты в ответ к SDF-1alpha хемокинового
Ученые разрабатывают подход к вакцинации от воспаления кишечника
Панкреатит
DeNovix объявляет победителя конкурса на спектрофотометр / флуорометр Platinum DS11 FX +
Открытие 100 новых генов может помочь в исследованиях болезней пигментации
Апоптоз - важный медиатор патогенеза коронавирусной инфекции животных.
Кофе способствует развитию здоровых кишечных микробов и способствует опорожнению кишечника.
Генетика может влиять на состав микробиома больше, чем факторы окружающей среды.
Исследователи, изучающие мышей в Израильском технологическом институте Техниона, обнаружили, что на микробиом гораздо больше влияет генетика, чем среда материнского рождения. Катерина Кон |
Пластик, который сейчас обычно встречается в стуле человека
Ежегодно в океаны попадает около восьми миллиардов метрических тонн пластика. Это огромное количество пластика либо смывается на берег, либо распадается на крошечные кусочки диаметром менее 5 миллимет
Меры по предотвращению передачи SARS-CoV-2 со сточными водами в бедных регионах
Ученые всего мира стремятся понять, как распространяется коронавирусная болезнь 2019 (COVID-19) и новый патоген, который ее вызывает - коронавирус 2 (SARS-CoV-2), вызывающий тяжелый острый респираторн