PLoS ONE: Sonic the Hedgehog Tarpininkauja proliferaciją ir įdarbinimas transformuota mezenchiminių kamieninių ląstelių į skrandį

Anotacija

Tyrimai, naudojant Helicobacter
-infected peles rodo, kad kaulų čiulpų gautas mezenchiminių kamieninės ląstelės (MSC) gali repopulate skrandžio epitelį ir skatinti skrandžio vėžio progresavimą. Per naviko mikroaplinkos skrandžio pro-uždegiminių citokinų interferono gama (IFNγ) ir Sonic ežys (Ša) yra padidėjęs. IFNγ yra auglio platinimu per aktyvavimo Ša signalizacijos keliu įvairiuose audiniuose, bet ar panašus mechanizmas egzistuoja skrandyje yra nežinoma. Mes išbandėme hipotezę, kad IFNγ diskai MSC platinimu ir verbavimu, atsakymą procesų, kuriuose Ša signalizacijos. Dabartinė studija naudoja transplantacija yra in vitro pervežimas transformuota mezenchiminių kamieninių ląstelių linija (stMSC ^{vect), kad per išreiškia ežys signalizacijos, palyginti su netransformuotos laukinio tipo MSC (wtMSCs), wtMSCs perkeltų į per-Express Ša (wtMSC Ša) ir stMSCs transdukuotus lentiviruso konstruktai, kurių sudėtyje yra shRNR orientacija Ša geną (stMSC ShhKO). Iš IFNγ poveikis MSC proliferacija buvo vertinama naudojant ląstelių ciklo analizę in vitro
naudojant ląsteles, gydytų rekombinantiniu IFNγ (rmIFNγ) atskirai, ar kartu su anti-Ša 5E1 antikūnų, ir vivo,
naudojant peles persodintų su MSC gydomiems PBS ar rmIFNγ. in vitro
, IFNγ gerokai padidėjo "MSC platinimu, atsakas tarpininkaujant Ša, kad buvo užblokuotas 5E1 antikūnų. Surinkta iš kaulų čiulpų PBS- ar IFNγ gydytų pelių MSC gyventojai parodė, kad IFNγ žymiai padidino visų MSC ląstelių linijų S fazėje procentinis santykis, su stMSCs ShhKO ląstelių išimtis. Nors Magistrantūros ląstelių linijas, kuriose yra nesugadinta Ša išraiška buvo įdarbinti į skrandžio gleivinę reaguojant į IFNγ, stMSCs ShhKO nebuvo. Ežiukas signalizacijos reikalingas MSC platinimu ir įdarbinimo į atsakant į IFNγ skrandžio}

nurodomoji dalis:. Donnelly JM Chawla A Houghton J Zavros Y (2013) Sonic ežys Tarpininkauja proliferaciją ir įdarbinimas transformuota mezenchiminių Stem ląstelės į skrandį. PLoS ONE 8 (9): e75225. Doi: 10,1371 /journal.pone.0075225

redaktorius: Jorge Sans Burns universiteto ligoninės Modenos ir Redžio Emilija, Italija

Įstojo: Sausis 24, 2013 m Priėmė: 14 rugpjūčio 2013 m Paskelbta rugsėjo 19 d 2013

Visos teisės saugomos: © 2013 Donnelly ir kt. Tai atviros prieigos straipsnis platinama pagal Creative Commons Attribution licencija, kuri leidžia nevaržomai naudotis, paskirstymo ir dauginimąsi bet kokioje laikmenoje sąlygomis, su sąlyga, kad pirmasis autorius ir šaltinis įskaitomos

Finansavimas:. Šis darbas parėmė American Cancer Society tyrimų Katalogas Award 119072-RSG-10-167-01-MPC (Y Zavros), Albert J. Ryan Foundation Fellowship (J. Donnelly) ir iš dalies virškinimo sveikatos centras Cincinačio vaikų medicinos sveikatos centras (DHC: Suoliukas prie lovos Research in Vaikų Virškinimo liga) CHTF /sub DK078392. Autoriai norėtų pripažinti Monika Delay vadybininkas tyrimų tėkmės citometrijos Core į Reumatologijos skyriaus pagalbą Cincinačio Vaikų ligoninės medicinos centras, iš dalies remiamą National Institutes of Health (NIH) AR-47363. Visi tėkmės citometrijos duomenys buvo įsigyta naudojant įrangą tvarko Mokslinių tyrimų tėkmės citometrijos Core į Reumatologijos skyriaus Cincinačio Vaikų ligoninės medicinos centras, iš dalies remiamą NIH AR-47363. Į finansuotojai neturėjo vaidmenį studijų dizainas, duomenų rinkimo ir analizės, sprendimų skelbti, ar ruošiant rankraštį

konkuruojančių interesų.. Autoriai pareiškė, kad nėra konkuruojantys interesai egzistuoja

Įvadas

yra aiškiai apibrėžtas vaidmuo Sonic Hedgehog (Shh) signaliniai vėžio vystymosi [1], [2], [3]. Ląstelių augimą virškinamojo trakto navikų, kurie apima stemplę, skrandžio, tulžies pūslės ir latakų ir kasos yra reguliuojamos endogeninio išraiška Hedgehog ligandų, pavyzdžiui, Šaa [1]. Privalomas Ežiukas ligando jo receptoriaus, Pataisa (Ptch), sukelia pašalinus Ptch slopinimo apie smoothened (BRO). Ši slopinimo dėl smo pašalinimas ribines vertes, ir Gli-šeimos Hedgehog transkripcijos faktorius, o vėliau naviko augimui, kad gali būti užblokuotas Hedgehog neutralizuojančių antikūnų aktyvavimo [1]. Nors tarp Ša ir skrandžio vėžio asociacija yra aišku, funkcinį vaidmenį Ša kuriant ir progresavimo skrandžio vėžys yra plačiai žinomas. Be to, mechanizmas, kuris reguliuoja Ša gamybą per naviko mikroaplinkos dar turi būti nustatyta.

Helicobacter pylori (H. pylori)
bakterijų kolonizacija sukelia lėtinį uždegimą, kuris yra nuolat susijęs su progresavimo skrandžio vėžio [4]. Dažniausiai ir žalinga imuninis atsakas apima Th1 PRO-uždegiminių citokinų Labiausiai žinomas IFNγ nuo T ląstelių, ir IL-1β ir TNF iš audinio ar užplūsta makrofagus [5], [6], [7], [8], [ ,,,0],9]. Iš tiesų, Pro-uždegiminių citokinų IFNγ buvo įrodyta, kad prisidėti prie patogenezės ir plėtros skrandžio metaplazijos [5], [9], [10] ir vėžys [10]. Uždegimas sukeltas vėžio, the Hedgehog signalizacijos kelias tarpininkauja IFNγ sukeltas auglių vystymuisi [11], [12], [13]. Visų pirma, Šaa yra IFNγ tikslinio geno ir Hedgehog signalizavimo apie IFNγ-sukeltos platinimo [12] tarpininkas.

Per Helicobacter
infekcija, lėtinis uždegimas sutampa su kaulų čiulpų įdarbinimo gautas mezenchiminių kamieninių ląstelių (BM-MSC) [14], [15]. Į chroniškai uždegimas, skrandžio BM-MSC yra įdarbinti iš kaulų čiulpų į skrandį ir diferencijuojasi į vėžį susijusios fibroblastų (CAFS), kurios padeda nukreipti vėžio vystymąsi [14]. Nors aiškiai susijęs su skrandžio vėžio išsivystymo, mechanizmas reguliuojant platinimu ir įdarbinimą Zjadliwie transformuota BM-MSC į per lėtinis uždegimas, skrandžio yra plačiai žinomas. Įdomu tai, Ša Pranešama, kad sukelti platinimu ir diferenciaciją BM-MSC [16]. Ša taip pat buvo pripažinta kaip potenciali chemoattractant kaulų čiulpų kilmės ląstelės, kai aktyvinama reaguojant į lėtinis uždegimas [17], [18].

Remiantis tarp IFNγ ir Ša asociacijos, mes iškėlė hipotezę, kad IFNγ skatina Ša signalizacijos per MSC palengvinančios ląstelių migraciją į skrandį. Norėdami patikrinti šią hipotezę, dabartinis tyrimas palygina vivo
BM-MSC Priėmimas į skrandžio gleivinę, reaguojant į IFNγ naudojant spontaniškai transformuotą mezenchiminių kamieninių ląstelių linija (stMSC), palyginti su untransformed BM-MSC. Kultūros, BM-MSC yra linkę mutacijai su senėjimu ir parodų kliniškai reikšmingoms mutacijų p53 geno [19]. Su ilgalaikio kultūros BM-MSC "spontaniškai transformuoti" (stMSCs), gali būti dauginami in vitro ilgą laiką ir eksponuoti vėžį skatinančius fenotipą [19]. Dabartinė studija naudoja abi stMSCs ir untransformed BM-MSC (wtMSCs), kad per išreiškia ežys signalizacijos. Naudojant wtMSC ir stMSC ląstelių linijas ir vivo, parsisiųsti ir in vitro
, mes įrodyti, kad IFNγ sukeltos neplatinimo ir įdarbinimas MSC ląstelių linijų į skrandį yra atsakas, kuris yra sąlygotas Ša sekrecija ir signalizacijos.

medžiagos ir metodai

Gyvūnai

C57BL /6 (padermė�.664) ir NRG (įtempimo705) Pelės naudojami šių tyrimų buvo įsigytas iš Jackson laboratorijose. Visi pelės tyrimai buvo patvirtintas Cincinnati institucinių gyvūnų priežiūrai ir naudojimui komiteto universiteto (IACUC), kad palaiko Amerikos asociacijos vertinimo ir akreditavimo laboratorinių gyvūnų priežiūra (AAALAC) galimybe.

Kaulų čiulpų gautas Spontaniškai Transformed mezenchiminių kamieninės ląstelės (stMSC) ir ne pertvarkyta BM-MSC (wtMSC) kultūra ir gydymas

wtMSC ląstelių linijos buvo nustatytos iš viso kaulų čiulpų IRG pelių ir išauginti plaukimo 5 prieš transfekciją su vėlesne priežiūra žemoje praėjimas numeris (< P10) prieš eksperimentinio naudojimo. Visa kaulų čiulpų buvo praplauti nuo šlaunikaulio ir blauzdikaulio pelių, skirtų tolesniam kultūros ir ištrauka iš plastiko prigludusių MSC gyventojų [20]. Spontaniškai transformuotos kaulų čiulpų gautas mezenchiminių kamieninės ląstelės (stMSCs) Transfekuoti su pDsRed-HYG-C1 plazmidžių išreiškiant raudoną fluorescencinis baltymas buvo naudojamos [21]. Visos ląstelės buvo auginamos naudojant HyClone DMEM terpės papildyta 10-15% serumas iš veršiuko embriono ir 1% penicilinui streptomicino normaliomis sąlygomis. MSC išauginti gydymui buvo padengtas 6 duobučių lėkštelėse ir leido augti 70-80% santakoje įprastomis žiniasklaidos tada serumas bado naktį. Po kultūros plėtrą, pelės multipotent mezenchiminių STROMA žymeklis antikūnų skydas buvo naudojamas ženklinti MSC ląstelių linijas SCA-1, CD106, CD105, CD73, CD29, CD44 ir kraujodaros žymekliai CD45 ir CD11b (R & D SYSTEMS, SC018). Ląstelės buvo sustabdytas dėl 1 × 10 ^{6 ląstelių /ml koncentracijos ir nudažomi pagal gamintojo protokolą. tada ląstelės buvo inkubuojamos su AlexaFluor 488 esant 1:100 skiedimo 30 minučių, esant 4 ° C temperatūroje. Fiksacija buvo atliktas 15 minučių kambario temperatūroje, naudojant komerciškai prieinamą reagento (Invitrogen GAS001S5). Fluorescencijos intensyvumas buvo matuojamas tėkmės citometrijos naudojant BD FACSCalibur ir CellQuestPro programinę įrangą. wtMSCs ir stMSCs buvo gydomi kartu su transporto priemone, rekombinantinis pelės interferono gama (rmIFNγ, 100 nM, R & D sistemos) ar anti-Šaa antikūnas 5E1 (iš anksto apdorotas 6 valandas), taip pat rmIFNγ už 24 val. tada Apdoroti ląstelės buvo analizuojami pokyčiai ląstelės ciklo tėkmės citometrijos.}

Sonic the Hedgehog (Ša) triuškinantis iki lentivirus sąlygojamą Trumpas segtukas RNR (shRNR) naudojant stMSCs

RFP-Tagged stMSCs buvo transdukuotus penkių skirtingų MISIJA lentiviruso perdavime dalelių klonų, turinčių įvairių sekas shRNR už Ša ir pLKO.1-Puro komponentas, suteikiantis puromicino pasipriešinimo (Sigma-Aldrich). RFP-tagged stMSCs buvo inkubuojami su lentiviruso dalelių ExpressMag magnetinių rutuliukų (Sigma-Aldrich) ant magnetu (Ozo biomokslai super Magnetinė plokštė, MF10000) 15 minučių, ląstelės buvo pašalintas iš magneto, inkubuojama dar 16 valandas ir tada įforminta puromicino pasirinkimas (DMEM kultūra Žiniasklaida, kurių sudėtyje yra 10% serumas iš veršiuko embriono, 1% penicilino /streptomicino, 10 mikrogramų /ml puromicino) nuo 7 iki 10 dienų. Veiksmingas puromicino dozė, reikalinga pašalinti su-transdukuojamos ląsteles buvo nustatomas anksčiau per puromicino nužudyti kreivę ir kad bandytos koncentracijos nuo 0 iki 50 g /ml (duomenys neparodyta). Transdukuotus ląstelės buvo žymimas unikaliu klonas ID numeris su ląstelių linijų transdukuoti shRNR už Ša (stMSC ^{ShhKO) sunumeruoti 59-63. PLKO.1-Puro vektorius transdukuojamos RFP-MSC ląstelių linija (stMSC vect) tarnavo kaip endogeninio lygio Ša genų ekspresijos kontrolės. Vakarų dėmė analizė buvo naudojamas patvirtinti Ša triuškinantis ir RFP išraiška.}

transfekciją wtMSCs į "Over-Express Ša

plazmidės (Origene CW101340) buvo derinamas su Origene Turbofectin reagento ne santyki 0 :1, 01:01, 02:01, 03:01 ir 04:01 ir inkubuojama 15 minučių kambario temperatūroje. Tada transfekcija reagentas buvo įtraukta sulašinama į wtMSCs 70% santakoje ir leido inkubuojama 24 valandas prieš ląstelės buvo daromas atrankos normaliai žiniasklaida su puromicino. Veiksmingas puromicino dozė, reikalinga pašalinti su transfekuotos ląstelės buvo nustatomas anksčiau per a puromicino nužudyti kreivė bandymų koncentracijos nuo 0 iki 10 g /ml (duomenys neparodyta). Mažiausia koncentracija, kad žuvo visi untransfected ląsteles 3-4 dienas po gydymo buvo įsteigta kaip 2 mikrogramai /ml.

in vivo stMSC Įdarbinimas ir neplatinimo

C57BL /6 pelėms buvo persodinami su 1 × 10 ^{6 wtMSCs, wtMSCs Ša, stMSCs vect arba stMSCs ShhKO per uodega venų injekcijos. Tris dienas po transplantacijos, buvo suleidžiama su transporto priemonės (steriliu PBS,, i.p.) arba rmIFNγ (1 mikrogramai /parą, i.p.) 7 arba 21 dienų. Pelės buvo sušvirkšta 200 mikrol BrdU ženklinimas akcijų reagentas (5-brom-2'-deoksi-uridino ženklinimo ir atpažinimo Kit II, Roche Diagnostics, IP) prieš 24 valandas iki analizės ir skrandžio skyriai nustatyta 4% paraformaldehido, parafino-embedded ir 3 mkm skyriai pasirengę imunohistocheminis ir imunofluorescencinio analizes. Visas kaulų čiulpų taip pat buvo išskirtas iš tos pačios pelių su PBS paraudimo šlaunikaulių. Raudonieji kraujo kūneliai buvo lizuoti naudojant raudonųjų kraujo ląstelių lizės buferiniame tirpale (4.14 g NH _{4Cl, 0,5 g KHCO 3, 0,5 M EDTA 500 ml, pH 7.2-7,4). Maždaug 11 × 10 6 ląstelės buvo fiksuotas ir laidžiomis naudojant Caltag Laboratorijos tėkmės citometrijos Kit, pagal gamintojo protokolu (Invitrogen, DUJŲ-004) ir dažomi kovos su RFP FITC konjuguoto antikūnas (1:100, Abcam, ab34764 ), o tada dažomi Vybrant DyeCycle Ruby dėmė (Invitrogen) pagal gamintojo protokolą. Fluorescencija buvo analizuojami naudojant BD LSRII tėkmės citometre sistemą. Analizuoti konkrečiai RFP-MSC, strobavimo buvo naudojamas analizuoti ląstelių ciklą tik FITC teigiamų ląstelių. Piko fluorescencija buvo analizuojami ModFitLT programinę įrangą, siekiant nustatyti populiacijos dalį kiekvienoje ląstelės ciklą etapo.}}

tėkmės citometrijos ir ląstelės ciklo analizė

Ląstelės buvo serumo pristigusiems 16 valandas iki analizės , Ląstelės buvo nustatyti su ypatingai šaltas 70% etanolio /PBS 15 minučių, esant -20 ° C, plaunamos ir vėliau yra nudažomi su propidiumo jodido 45 minučių. Išmatuotos reikšmės piko fluorescencijos už viso ląstelių buvo gauti naudojant programa CellQuest Pro (Becton Dickson). Ląstelių procentas nuo kiekvienos ląstelės ciklo etape gyventojų buvo apskaičiuojamas nuo piko fluorescencijos matavimų analizuojant su ModFit LT programine įranga. Tėkmės citometrijos naudojant FACSCalibur ™ sistemą (Becton Dickson) buvo atliktas visų transdukuotų ląstelių naudodami pelę multipotent mezenchiminių Kamieninių ląstelių Marker antikūno skydas pagal gamintojo protokolu (R & D Systems, SC018).

Imunoprecipitacijos ir Vakarų dėmė analizė

Mobilaus ryšio fragmentai buvo parengtos naudojant "M-PER žinduolių baltymais gavybos reagentą (Thermo Scientific, IL) papildyta proteazių inhibitorių (Roche) pagal gamintojo protokolą. Media mėginiai iš ląstelių buvo sutelkta naudojant 15 ml Amikon Ultra centrifūginį filtrą prietaisai (MILLIPORE). Ląstelių fragmentai (100 mikrogramų viso baltymo) ir žiniasklaida buvo immunoprecipitated naudojant anti-Ša 5E1 antikūnas (2 mikrogramai), esant 4 ° C temperatūroje 16 valandų. Baltymas A /G agarozės granulės buvo pridėta (20 mikrol, Santa Cruz biotechnologijos, CA), ir mėginiai inkubuojami esant 4 ° C temperatūroje 16 valandų. Po 16 valandos inkubacijos immunoprecipitates buvo plaunami 3 kartus per PBS ir sumaišymo 40 įxL Laemmli buferinio tirpalo, kuriame yra ß-merkaptoetanolio (Bio-Rad Laboratories, CA) prieš pakraunant į 4-20% tri-glicinas Gradient gelius. Geliai buvo paleisti 80 V, 3,5 valandų, baltymų perduotą nitroceliuliozės membranos esant 105 V, 1-2 valandas, ir tada blokuojamas 1 valandą kambario temperatūroje naudojant kpl detektorius blokas (Kirkegaard & Perry Laboratories, Inc.). Membranos buvo inkubuojami per naktį 4 ° C temperatūroje, turintis 1:200 praskiedus Šaa antikūno (N-19, Santa Cruz), po to dar per 1 valandą inkubacijos a Su 1:100 praskiedus AlexaFluor anti-ožkos 680 (Invitrogen). Dėmės buvo nufotografuotas skenuojančiu tankio kartu su analizės programinė įranga (odisėja Infraraudonųjų spindulių vaizdo programinė sistema).

RNR išskyrimas ir AT-PGR

Viso RNR buvo išskirta iš skrandžio audinio naudojant Trizol reagento pagal gamintojai protokolas (TriReagent, Molekulinė tyrimų centras, Inc). Aukšto Talpa kDNR atvirkštinės transkripcijos rinkinys (Taikomoji Biosystems) buvo naudojamas sintezei nuo RNR po rekomenduojamą protokolą. Kiekvienam mėginiui, 60 ng RNR atvirkštiniu transkripcija, siekiant gauti maždaug 2 mikrogramai bendrą cDNR, kad tada buvo naudojamas už RT-PGR. RFP gruntas sekas, buvo taip: PIRMYN -5 "BMK CGT AAT GCA GAA GAA G. 3" REVERSE -5 "CTT GGC CAT GTA GGT aktyvumo GGT aktyvumo CT 3". PGR amplifikacijos buvo atliktas bendras tūris 20 ml, kurių sudėtyje yra buferis, 20 mm į priekį ir atgal pradmenis, Taq polimerazė, RNazės be vandens ir kDNR šabloną. Kiekvieną PGR amplifikacija buvo atlikta pasikartojančių šulinėlius GeneAmp PGR sistema 9700 temperatūros pasikeitimo prietaisą (Applied Biosystems), naudojant šias sąlygas: 94 ° C 3 min, 94 ° C 30 sekundžių, 60 ° C 1 minutės ir 72 ° C 1 minutės už 35 ciklai. PGR produktai buvo vizualizuota 1,5% agarozės TAE gelio.

imunohistocheminis

Pelės buvo suleistas su 200 pL bromdeoksiuridino ženklinimas akcijų reagento (5-brom-2'-deoksi-uridino ženklinimo etiketėmis ir aptikimo komplektas II Roche Diagnostics) prieš 24 valandas iki analizės. Skrandžio audiniai buvo nustatytos su Carnoy fiksatoriumi (60 ml etanolio, 30 ml chloroformo, 10 ml acto rūgšties) 16 valandų, parafine ir buvo parengtos 4 mkm skyriai. Po to, kai deparaffinization, antigenas paieška buvo atlikta kaitinant 10 minučių skaidres esant 100 ° C 0,01 M natrio citrato buferio (antigenų atsikratyti oficialumo Solution, Vector Laboratories, Burlingame, CA). tada endogeninė peroksidazės aktyvumas buvo užblokuotas inkubacijai skaidres 3% vandenilio peroksido /etanolio už papildomą 20 minučių. tada dalys buvo užblokuoti, naudojant 5% BSA /tri buferiniame valgomosios druskos tirpale /0,1% Tween 80 (TBS-T) ir inkubuojamos su 1:20 skiedimo anti-bromdeoksiuridino antikūnų (5-brom-2'-deoksi-uridino ženklinimo etiketėmis ir aptikimo Kit II, Roche Diagnostics) 37 ° C temperatūroje 30 minučių. BrdU spalva plėtra buvo atlikta pagal gamintojo protokolą. tada skyriai buvo blokuotos 20% normalaus ožkų serume 20 minučių ir inkubuojamos su 1:400 praskiedus biotino-konjuguoto anti-RFP antikūno (Abcam, ab34771) 16 valandų, esant 4 ° C temperatūroje, vėliau 1:500 praskiedus anti- triušis IgG 30 minučių ir tada buvo atvaizduojami avidino-biotino kompleksų, naudojant Vectastain Elite ABC rinkinio naudojant diaminobenzidinas (DAB), kaip substrato (Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA). Skaidrės buvo sumontuoti naudojant Permount.

adipocitams indukcijos, stMSCs buvo gydomi HyClone DMEM containing10 ^{-8 M deksametazonas ( "Sigma, D4902) ir 5 mikrogramai /ml insulino (" Sigma, I6634). Visos ląstelės buvo nustatyti naudojant 4% paraformaldehidas 20 minučių kambario temperatūroje. Aptikti diferenciaciją, naftos Raudona P dažymo atliko pridedant 3,75% Nafta Raudona O sprendimas, inkubacijai 5 minutes kambario temperatūroje, tada plauti vandeniu, prieš montuojant ant skaidrių naudojant Vectashield HardSet montavimo Medium. Vaizdai buvo peržiūrėti ir perimta pagal šviesos mikroskopijos, naudojant Olympus BX60 su diagnostikos prietaisai "Spot" fotoaparatą.}

Imunofluorescentinis

stMSC ^{vect ir stMSC ShhKO ląstelės buvo auginamos coverslips iki 70-80% susiliejimo, kuri nustatoma pagal 4% paraformaldehido 30 minučių kambario temperatūroje, membranos pralaidumu PBS, kurių sudėtyje yra 0,5% TritonX-100 ir užblokuotas su 2% asilas serumo 1 valandą kambario temperatūroje. tada ląstelės buvo inkubuojamos su abiejų 1:50 praskiedus anti-CD44 (Abcam ab65829) arba 1:100 praskiedus anti-CD45 (Abcam ab10558) antikūnų per naktį 4 ° C temperatūroje. Alexa "Fluor asilas anti-triušio 488 buvo naudojamas kaip antrinio antikūno 1:1000 skiedimo 1 valandą kambario temperatūroje. Ląstelės buvo counterstained su 1:2000 praskiesti branduolinės dėmių PRO 3 jodido (Invitrogen, T3605) 20 minučių kambario temperatūroje, prieš montuojant, naudojant Vectashield HardSet montavimas Medium. Triušis IgG buvo naudojamas ne 1:25 praskiedus kaip neigiamos kontrolės tomis pačiomis sąlygomis.}

Skrandžio skyriai surinkti iš PBS ar IFNγ pelių buvo užblokuoti 20% normalaus ožkų kraujo serume ir inkubuojami su 1:400 kovos RFP antikūnas (Abcam, ab34771) 16 valandų, esant 4 ° C temperatūroje, vėliau 1:100 anti-triušio Alexa "Fluor 488 (Invitrogen) antriniu antikūnu dar 1 valandą. tada Skaidrės buvo counterstained naudojant anti-E-cad (BD perdavime Labs, 610181) antikūnų ne 1:200 praskiedus 1 valandą kambario temperatūroje, po to 1:100 anti-pelės Alexa Fluor 633 (Invitrogen) antrinio antikūno. Visi mėginiai buvo sumontuoti naudojant Vectashield Hardset montavimas Medium (VectaLabs). Vaizdai buvo gauti naudojant Carl Zeiss LSM510 META mikroskopas.

chemotaksi Analizės

chemotaksi tyrimas buvo atliktas remiantis nustatytais protokolus [22]. Transdukuotus stMSCs buvo padengtą 24 ir transwell lėkštelėse, turinčiose PET membranas su 8 mkm poras (BD Falcon). 2,5 × 10 ^{4 ląstelės buvo pasėjamos į viršūninio (viršutinio) kameroje DMEM žiniasklaidos sudėtyje yra 0,1% BSA. SDF-1α (rmSDF-1α R & D sistemos) buvo pridėta prie basolateral (mažesnio) kameroje koncentracija nuo 0 iki 150 ng /ml. Ląstelės buvo inkubuojami 6 valandas 37 ° C temperatūroje. Po to, kai migracijos, ląstelės buvo nustatyta 4% paraformaldehido 30 minučių, po to dažytų 10 minučių, naudojant Wright-Giemsa dėmę. liekantys membranos viršuje ląstelės buvo pašalinta su medvilnės galiuku aplikatoriaus ir likusios ląstelės buvo skaičiuojamas 5 laukai 40 × priartinimas. Migruojančių ląstelių skaičius buvo apskaičiuojamas dalijant vidutinį skaičių migruojančių ląstelių kiekvieną duobutę vidutinis skaičius migruojančių ląstelių kontrolės gerai.}

Statistinė analizė

Rezultatai buvo analizuojami tiek A studento neporiniai t testas arba ANOVA naudojant įsigyti Programinė įranga (GraphPad prizmę GraphPad Programinė įranga, San Diegas, CA). P
vertė < 0,05 buvo laikomas reikšminga

Rezultatai

IFNγ sukeltos stMSC platinimas tarpininkaujant Ša sekrecijos ir signalizacijos

vaidmuo. Ežiukas signalizacijos kaip IFNγ sukeltos stMSC ir wtMSC platinimo tarpininko nustatė, tėkmės citometrijos ir ląstelės ciklo progresavimo. Po gydymo, ląstelės buvo tamsintas su propidiumo jodido ir ląstelės ciklo analizuojamu tėkmės citometrijos ant pasirinkto vieno ląstelių populiacijos (S1A pav.) 1 pav atstovauja vidutines vertes, mobiliojo paskirstymo dalis procentais, įvairių ląstelių ciklo fazių gydymo grupių parodyta Fig S1B-E. Skaičiai S1B-E atstovauti sklypai parodantis ląstelės ciklo etapus pakeitimus. Vidurkiai ir statistinis reikšmingumas reaguojant į visų gydymo apibendrinta S1F pav ir G. analizė žaliavų fluorescencijos duomenų parodė padidėjusį procentą stMSCs S fazėje ir G _{2 /M etape ir sumažintą procentą ląstelių G 0 /G 1 fazė reaguojant į rmIFNγ, palyginti su transporto priemonės-paveiktų ląstelių (1A pav). Norėdami nustatyti, kaip IFNγ sukeltos stMSC platinimo tarpininko mes naudojamas anti-Ežiukas neutralizuoti 5E1 monokloninis antikūnas, kuris rišasi su Ša ligando ir sutrikdo privalomas receptoriaus Ptch baltymų į kurį sekretuoja Ša vaidmenį [1]. Proliferacijos atsakas stMSCs į rmIFNγ buvo žymiai slopinamas su 5E1 antikūnų gydymo (1a pav.) Kai, palyginti su stMSCs, netransformuotos wtMSCs atsakė panašiai kaip atsakas į IFNγ tai rodo, padidėjusį platinimo nebuvo rezultatus paversti vien. IFNγ gerokai sukeltos į wtMSCs S fazėje procentą, atsakymą, kuris buvo užblokuotas anti-Ša antikūnų (1b pav.) Apibendrinant, 1 pav rodo, kad IFNγ skatina platinimu abiejų untransformed ir spontaniškai transformuotų MSC, atsakymą, kad yra sąlygotas sekretuojamą Ša.}

nutildymo Ša Gene per kaulų čiulpų gautas stMSCs

Jei visapusiškai studijuoti Ežiukas signalizacijos vaidmenį BM-MSC platinimu ir įdarbinimo vivo
, wtMSCs buvo transfekuota per daug Express Ša o stMSCs buvo transdukuotus lentiviruso shRNAs prieš Ša. Panaudotas pLKO.1-Puro bazė lentiviruso vektorius išreikšti trumpą segtukas seka skundą dėl Ša geno stenograma. Valdymo MSC ląstelių linijos buvo nustatytos naudojant wtMSC su endogeninio išraiška Ša ir transfekciją stMSCs su pLKO.1-puro bazė lentiviruso vektoriaus (stMSC ^{vect). Penki lentiviruso klonai, kiekvienas klonas išreikšti kitą trumpą segtukas seką, buvo analizuojami (stMSC ShhKO59-stMSC ShhKO63). Nokdaunas apie Ša buvo patvirtinta Vakarų blot analize, kuri parodė 100% triuškinantis apie Ša baltymų raiškos visų klonų palyginti su untransduced ląstelių (wtMSCs) ir Ša per išreikšti ląstelių linijas (wtMSC Ša ir stMSC vect) ( S2A pav.) Klonas stMSC ShhKO59 buvo naudojama vėlesniuose eksperimentų ir bus vadinamas stMSC ShhKO. Išraiška pDsRed-HYG-C1 plazmidžių išreiškiant raudoną fluorescencinės baltymo (RFP) buvo patvirtinta immunoblot naudojant mobilųjį lizatas surinktas iš transdukuotų stMSCs (S2A pav). Svarbu tai, kad wtMSCs stabiliai perkeltų į per-Express Ša baltymų, išreiškė Ša lygiu, panašiu į stMSCs (S2A pav.)}

Jei norite patikrinti triuškinantis apie Ša į MSC nekeičiant ląstelių diferenciaciją, išraiška modelis už klasikinių CD žymekliai (CD29, CD106, CD105, CD44 ir CD73) ir SCA-1, naudojant tėkmės citometrijos buvo atliekama naudojant kultūringas stMSC ^{vect (S2B paveikslas) ir stMSC ShhKO (S2C pav) ląstelės. Tiek stMSC vect ir stMSC ShhKO ląstelės buvo neigiamas CD45 (S3 pav.) Be to, abu stMSC ląstelių linijos buvo galima atskirti į adipocitams fenotipo remiantis teigiamu Nafta Raudona O dažymo lipidų lašelių pagamintų (S3 pav). Bendrai, šie duomenys rodo, kad triuškinantis apie Ša baltymų stMSCs nepakeitė šių ląstelių diferenciaciją.}

IFNγ Skatina proliferaciją wtMSCs ir stMSCs kaulų čiulpuose

Norėdami nustatyti IFNγ poveikį wtMSC ir stMSC plitimas vivo
, pelėms buvo persodinami su RFP-tagged wtMSC, wtMCS ^{Ša, stMSC vect arba stMSC ShhKO ląsteles ir gydomi rmIFNγ 21 dienų. Po IFNγ gydymo, kaulų čiulpų buvo paruošta ir analizuojami pokyčiai ląstelės ciklo ir skaičiaus pasiūlymų užklausas teigiamas ląsteles tėkmės citometrijos. IFNγ sukėlė didelį padidėjimą pasiūlymų užklausas teigiamų ląstelių skaičius per kaulų čiulpų visų eksperimentinių grupių, išskyrus šių gyvūnų transplantuotų su stMSC ShhKO ląstelės (2a pav B). Imunofluorescentinis kaulų čiulpų atskleidė, kad ten buvo labai padidėjo būtent dėl ​​plinta RFP teigiamų ląstelių atsakas į IFNγ kaip bendrai lokalizuoja BrdU imunodažymu (pav 2C, D), skaičius. Tai buvo labiau remia S4A figūra, B ir C, kuris rodo reprezentatyvi šviesos sklaida analizė atskleidžia apie stMSCs kad buvo teigiami RFP ir sudarė maždaug 0,1% visos kaulų čiulpų ląstelių populiacijos gyventojų. RFP teigiami ląstelės buvo uždara už vieno ląstelių populiacijos (S4C paveikslas) ir ląstelės ciklo analizė. surinkti iš kaulų čiulpų pelių transplantuotų su stMSC ląstelės vect ląstelės gydomi rmIFNγ turėjo žymiai didesnį procentą ląstelių S fazę (55,5 ± 2,82%), palyginti su pelėmis gydomiems PBS (32,9 ± 5,14%, P
< 0,05, palyginti su stMSC vect transplantuotų pelių, vartojusių PBS) (S4F pav). Ląstelių procentas S fazę surinkti iš kaulų čiulpų pelių transplantuotų su stMSC ShhKO gydomi rmIFNγ reikšmingai nesiskyrė (32,9 ± 2,64%), palyginti su tų pelių, vartojusių PBS (38,4 ± 1,47%,
>p; 0,05, palyginti su stMSC ShhKO transplantuotų pelių, vartojusių PBS) (S4I pav). Skaičiai S4D, E, G ir H atstovauti sklypai parodantis ląstelės ciklo etapus pakeitimus. Taigi, IFNγ skatina platinimu abiejų wtMSCs ir stMSCs in vivo
per kaulų čiulpuose, atsakas, kuris atsiranda būti tarpininkaujant Ša signalizacijos.}

, in vivo
įdarbinimas wtMSCs ir stMSCs į skrandžio gleivinę atliekamos atsižvelgiant į IFNγ

Jei norite identifikuoti kaip IFNγ sukeltos stMSC įdarbinimo tarpininkas skrandžio epitelį į Ežiukas signalizacijos vaidmenį, pelės persodinami su stMSC ^{vect ir stMSC ShhKO ląstelės buvo gydomi PBS ar IFNγ 21 dienų. tada skrandžiai buvo surinkti ir įdarbinimas RFP-tagged stMSC vect ir stMSC ShhKO ląstelės analizuojamos imunohistocheminiu (3 paveikslas). stMSC vect ląstelės buvo įdarbinti į skrandžio gleivinę pelių sušvirkšta IFNγ (pav 3C, D), palyginti su RFP-tagged stMSC nesant vect ląsteles PBS-švirkščiamas pelių skrandžiai (3A, B pav ). stMSC ShhKO ląstelės persodinami į pelių sušvirkšta IFNγ nebuvo įdarbinti skrandžio gleivinės (pav 3E, M). Išraiška RFP-tagged stMSC vect ląstelių IFNγ gydymo buvo patvirtinta RT-PCR (3G pav.) Norėdami nustatyti, ar įdarbinimas MSC į skrandžio gleivinę, reaguojant į IFNγ buvo unikalus prie stMSCs, eksperimentas buvo pakartotas naudojant arba wtMSCs ar wtMSCs per išreikšti Ša (wtMSC Ša). Nors abu wtMSC ir wtMSC Ša ląstelės buvo aptikta apie IFNγ gydytų pelių skrandžiai, ten buvo žymiai didesnis skaičius wtMSC Ša ir stMSC vect ląstelėmis per skrandžio gleivinę, palyginti su wtMSC ląstelių transplantacija grupė (3H pav.) Bendrai, šie duomenys rodo, kad Ša signalizacijos greičiausiai tarpininkauti MSC į skrandžio gleivinę, reaguojant į IFNγ įdarbinimo.}

buvo reikšmingas padidėjimas proliferuojančias ląstelėmis per skrandžio gleivinę skaičius reaguojant į IFNγ gydomiems wtMSC ^{Ša ir stMSC vect persodinti pelėms, palyginti su PBS-švirkščiamas pelėmis (pav 4A-D, pav S5A-F). Tačiau MSC buvo BrdU neigiamas (4b paveikslas, C ir S5A D pav.) Nors stMSC ShhKO ląstelės persodinami į pelių sušvirkšta IFNγ nebuvo įdarbinti skrandžio gleivinę, nebuvo epitelį platinimu tarp PBS ir IFNγ gydymo skirtumas šiame eksperimentinės grupės, o tai rodo didesnį MSC gautas Ša gali būti reikalaujama, kad tai paremti padidėjo proliferacija (4D pav.) Be to, nors wtMSCs buvo įdarbinti į skrandžio gleivinę, reaguojant į IFNγ, nebuvo jokio skirtumo epitelį platinimu tarp LPS ir IFNγ gydymo (4d pav). Šie duomenys rodo, kad Ša signalizacijos per wtMSCs Ša ir stMSCs reaguojant į IFNγ skatina platinimu per skrandžio epitelį. IFNγ vienas, į stMSCs nėra, neskatina platinimu per skrandžio gleivinę, patvirtinantis šį poveikį nėra susijęs vien uždegimas.}

Norėdami nustatyti, ar sumažėjo stMSC platinimu, po įdarbinimo, buvo susijęs su ląstelių sukibimą per skrandžio epitelio, skrandžiai buvo tada bendrai tamsintas E-cad ir mokslinių tyrimų programa (pav 4G-I). PBS-pelių, kurios buvo persodinti su RFP-tagged stMSC ^{vect ląstelės neparodė ląstelių verbavimu skrandžio gleivinės (4G pav.) Atitiktų 3 paveiksle, IFNγ įpurškimo pelių, kurios buvo persodinti su RFP-tagged stMSC vect ląstelės parodė žymų įdarbinimą narvelių į skrandžio gleivinę (4H pav.) RFP-tagged stMSC Vect ląsteles bendrai lokalizuota su E-cad (pav 4G, I), įrodančius, kad įdarbinti ląsteles buvo persodintos per skrandžio epitelyje.}

Ežiukas Signalizacijos tarpininkauja židinio Sukibimas baltymo ekspresija Reaguodama į SDF-1α chemokino

Mes pasirinkome SDF-1α /CXCR4 signalizacijos ašį ištirti, buvo nustatyta, kad šis signalizacijos kelias skatina MSC įdarbinimą [23] [24].

• PLoS ONE: Netikėta Headless ir beuodegis Žuvis skrandžio turinys trumpačiuopiklis mako Isurus oxyrinchus
• PLoS ONE: Owadożerny Šikšnosparniai Digest chitino skrandyje naudojimas rūgštus žinduolių Chitinase