PLoS ONE: Sonic Hedgehog Bemiddelt de verspreiding en rekrutering van getransformeerde mesenchymale stamcellen naar het Stomach

Abstract

Studies met Helicobacter
geïnfecteerde muizen tonen aan dat het beenmerg-afgeleide mesenchymale stamcellen ( MSC's) kunnen de maag epitheel herbevolken en het bevorderen van maagkanker progressie. In de tumor micro-omgeving van de maag, pro-inflammatoir cytokine interferon-gamma (IFNy) en Sonic hedgehog (Shh) worden verhoogd. IFNy is betrokken bij tumorproliferatie via activatie van de Shh signaleringsroute in verschillende weefsels maar of een soortgelijk mechanisme in de maag aanwezig is onbekend. We testten de hypothese dat IFNy drijft MSC proliferatie en recruitment, een respons gemedieerd door Shh signalering. De huidige studie gebruikt transplantatie van een in vitro
getransformeerde mesenchymale stamcellijn (stMSC ^{vect), die overexpressie hedgehog-signalering, in vergelijking met niet-getransformeerde wild-type MSC (wtMSCs), wtMSCs getransfecteerd om over-express Shh (wtMSC Shh) en stMSCs getransduceerd met lentivirale constructen die shRNA gericht op de Shh gen (stMSC ShhKO). Het effect van IFNy MSC proliferatie werd bepaald door celcyclusanalyse in vitro
middels cellen die met recombinant IFNy (rmIFNγ) alleen, of in combinatie met anti-Shh antilichaam 5E1 en In vivo
bij muizen getransplanteerd met MSCs behandeld met PBS of rmIFNγ. In vitro
, IFNy aanzienlijk toegenomen MSC proliferatie, een respons gemedieerd door Shh dat is geblokkeerd door 5E1 antilichaam. De MSC populatie verzameld uit beenmerg van PBS of IFNy-behandelde muizen die IFNy sterk toegenomen percentage van alle MSC cellijnen in S-fase, met uitzondering van de stMSCs ShhKO cellen. Terwijl de MSC cellijnen met intacte Shh expressie werden aangeworven om het maagslijmvlies in reactie op IFNy, stMSCs ShhKO waren niet. Hedgehog signalering is vereist voor MSC proliferatie en rekrutering van de maag in reactie op IFNy}

Visum:. Donnelly JM, Chawla A, Houghton J, Zavros Y (2013) Sonic Hedgehog Bemiddelt de verspreiding en rekrutering van getransformeerde mesenchymale stamcellen cellen aan de maag. PLoS ONE 8 (9): e75225. doi: 10.1371 /journal.pone.0075225

Editor: Jorge Sans Burns, Universitair Ziekenhuis van Modena en Reggio Emilia, Italië |

Ontvangen: 24 januari 2013; Aanvaard: 14 augustus 2013; Gepubliceerd: 19 september 2013

Copyright: © 2013 Donnelly et al. Dit is een open-access artikel gedistribueerd onder de voorwaarden van de Creative Commons Attribution License, die onbeperkt gebruik, distributie en reproductie maakt in elk medium, op voorwaarde dat de oorspronkelijke auteur en de bron worden gecrediteerd

Financiering:. Dit werk werd gesteund door de American Cancer Society Research Scholar Award 119.072-RSG-10-167-01-MPC (Y. Zavros), Albert J. Ryan Foundation Fellowship (J. Donnelly) en voor een deel door de Digestive Health Center Cincinnati Children's Medical Health Center (DHC: bench to bedside Research in Pediatric Digestive Disease) CHTF /SUB DK078392. De auteurs willen graag de hulp van Monica DeLay manager van het Research Flow Cytometry Core in de afdeling Reumatologie in Cincinnati Children's Hospital Medical Center, deels gesteund door de National Institutes of Health (NIH) AR-47363 te erkennen. Alle flowcytometrische gegevens werden verkregen met behulp van machines onderhouden door het Research Flow Cytometry Core in de afdeling Reumatologie in Cincinnati Children's Hospital Medical Center, deels gesteund door NIH AR-47363. De financiers hadden geen rol in de studie design, het verzamelen van gegevens en analyse, besluit te publiceren, of de voorbereiding van het manuscript

Competing belangen:.. De auteurs hebben verklaard dat er geen tegenstrijdige belangen bestaan ​​

Introductie

Er is een duidelijk vastgesteld rol Sonic Hedgehog (Shh) signalering in de ontwikkeling van kanker [1], [2], [3]. celgroei in spijsverteringskanaal tumoren die slokdarm, maag, galwegen en pancreas inclusief gereguleerd door endogene expressie van Hedgehog liganden zoals Shh [1]. Binding van Hedgehog ligand aan zijn receptor, Patched (Ptch), resulteert in verwijdering van de remming van Ptch op Smoothened (Smo). Deze verwijdering van de remming op Smo resulteert in de activering van Gli-familie van transcriptiefactoren Hedgehog vervolgens tumorgroei die kan worden geblokkeerd door Hedgehog neutraliserende antilichamen [1]. Terwijl het verband tussen Shh en maagkanker blijkt, de functionele rol van Shh in de ontwikkeling en progressie van maagkanker is grotendeels onbekend. Bovendien wordt het de productie van Shh in de tumor micro-omgeving regelt moet nog worden vastgesteld.

Helicobacter pylori (H. pylori)
bacteriële kolonisatie veroorzaakt chronische ontsteking die consistent is gekoppeld aan de progressie maagkanker [4]. De meest voorkomende en schadelijke immuunrespons omvat de Th1 cytokines, het meest opvallend IFNy van T-cellen en IL-1β en TNFa uit weefsel of binnendringende macrofagen [5], [6], [7], [8], [ ,,,0],9]. Inderdaad, pro-inflammatoir cytokine IFNy is aangetoond bij te dragen aan het ontstaan ​​en de ontwikkeling van gastrische metaplasie [5], [9], [10] en kanker [10]. In inflammatie-geïnduceerde vormen van kanker, the Hedgehog signaleringsroute bemiddelt IFNy-geïnduceerde tumor ontwikkeling [11], [12], [13]. In het bijzonder is Shh een IFNy doelgen en hedgehog-signalering een mediator van IFNy-geïnduceerde proliferatie [12].

In
Helicobacter infecties, chronische ontstekingen samenvalt met de rekrutering van beenmerg-afgeleide mesenchymale stamcellen (BM-MSC's) [14], [15]. In de chronisch ontstoken maag BM-MSC's worden gerekruteerd uit het beenmerg naar de maag en differentiëren naar kanker-geassocieerde fibroblasten (cafe's), die instrumenteel in het leiden van de ontwikkeling van kanker [14] zijn. Hoewel het duidelijk betrokken bij de ontwikkeling van maagkanker, het mechanisme regulering van de proliferatie en rekrutering van kwaadaardig getransformeerde BM-MSC naar de maag tijdens chronische ontsteking is grotendeels onbekend. Interessant Shh wordt gerapporteerd om de proliferatie en differentiatie van BM-MSC's [16] induceren. Shh is ook erkend als potentiële chemoattractant beenmerg afgeleide cellen bij opgereguleerd in reactie op chronische ontsteking [17], [18].

Op basis van het verband tussen IFNy en shh, veronderstellen we dat IFNy induceert Shh signalering binnen MSC's vergemakkelijken cel migratie naar de maag. Om deze hypothese te testen, de huidige studie vergelijkt In vivo
BM-MSC rekrutering van het maagslijmvlies als reactie op IFNy met behulp van een spontaan getransformeerde mesenchymale stamcellijn (stMSC) vergeleken met ongetransformeerde BM-MSC's. In kweek, BM-MSC's zijn gevoelig voor mutatie met veroudering en vertonen klinisch relevante mutaties in het p53-gen [19]. Met de lange termijn cultuur BM-MSC's "spontaan te transformeren" (stMSCs), kan in vitro worden vermeerderd voor langere tijd en vertonen een kanker-fenotype bevorderen [19]. De huidige studie maakt gebruik van zowel stMSCs en getransformeerde BM-MSC's (wtMSCs) die over-uitdrukt Hedgehog signalering. Met behulp van de wtMSC en stMSC cellijnen zowel In vivo Kopen en In vitro
, tonen we aan dat IFNy-geïnduceerde proliferatie en de werving van MSC cellijnen aan de maag is een reactie die wordt gemedieerd door Shh secretie en signalering.

Materialen en methoden

Dieren

C57BL /6 (stam�664) en IRG (stam705) muizen gebruikt voor deze studies werden gekocht van Jackson Laboratories. Alle muizen studies werden goedgekeurd door de Universiteit van Cincinnati Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC), die een Amerikaanse Vereniging van evaluatie en accreditatie van Laboratory Animal Care (AAALAC) faciliteit onderhoudt.

Bone Marrow-afgeleide Spontaan Transformed Mesenchymale stamcellen (stMSC) en niet-getransformeerde BM-MSC's (wtMSC) cultuur en behandelingen

De wtMSC cellijnen werden gevestigd uit totaal beenmerg van muizen IRG en gekweekt tot passage 5 voor transfectie latere onderhoud bij lage passageaantal (< P10) voorafgaand aan experimenteel gebruik. Geheel beenmerg werd gespoeld uit de femur en de tibia van muizen voor verdere kweek en passage van de plastic hechtende MSC populatie [20]. Spontaan getransformeerde beenmerg afgeleide mesenchymale stamcellen (stMSCs) getransfecteerd met een pDsRed-Hyg-C1 plasmide dat rood fluorescerend eiwit werden gebruikt [21]. Alle cellen werden gekweekt met behulp HyClone DMEM kweekmedium aangevuld met 10-15% foetaal kalfsserum en 1% penicilline-streptomycine onder normale omstandigheden. MSC's gekweekt voor de behandeling werden uitgeplaat in 6 well platen en mag groeien tot 70-80% samenvloeiing in normale media dan serum overnacht uitgehongerd. Na cultuur uitbreiding, werd de muis Multipotent Mesenchymale Stromal Cell Marker Antibody Panel gebruikt om MSC cellijnen label voor Sca-1, CD106, CD105, CD73, CD29, CD44 en de hematopoietische markers CD45 en CD11b (R & D Systems, SC018). De cellen werden gesuspendeerd bij een concentratie van 1 x 10 ^{6 cellen /ml en gekleurd volgens het protocol van de fabrikant. Cellen werden vervolgens geïncubeerd met 488 AlexaFluor een 1:100 verdunning gedurende 30 minuten bij 4 ° C. Fixatie werd gedurende 15 minuten bij KT met een commercieel verkrijgbaar reagens (Invitrogen GAS001S5). Fluorescentie-intensiteit werd gemeten door middel van flowcytometrie met behulp van de BD FACSCalibur en CellQuestPro software. wtMSCs en stMSCs werden behandeld met vehiculum, muis recombinant interferon gamma (rmIFNγ, 100 nM, R &D Systems) of anti-Shh antilichaam 5E1 (voorbehandeld gedurende 6 uur) plus rmIFNγ gedurende 24 uur. Behandelde cellen werden vervolgens geanalyseerd op veranderingen in de celcyclus door flow cytometrie.}

Sonic Hedgehog (Shh) Knockdown van Lentivirus-gemedieerde korte haarspeld RNA (shRNA) middels stMSCs

RFP-gemerkte waren stMSCs getransduceerd met vijf verschillende MISSION lentivirale transductie deeltje klonen die verschillende sequenties van shRNA voor Shh en een pLKO.1-puro component verleent puromycineresistentie (Sigma Aldrich). RFP-gemerkte stMSCs werden geïncubeerd met lentivirale deeltjes met ExpressMag magnetische korrels (Sigma Aldrich) met een magneet (Oz Biosciences Super magneetplaat, MF10000) gedurende 15 minuten werden cellen uit de magneet verwijderd, gedurende een verdere 16 uur en vervolgens onder geplaatst puromycineselectie (DMEM kweekmedia bevattende 10% foetaal kalfserum, 1% penicilline /streptomycine, 10 ug /ml puromycine) gedurende 7 tot 10 dagen. De effectieve dosis die nodig puromycine aan niet-getransduceerde cellen elimineren is eerder bepaald door een puromycine kill curve die concentraties van 0 tot 50 ug /ml getest (gegevens niet getoond). Getransduceerde cellen werden aangeduid door een unieke kloon ID-nummer met cellijnen getransduceerd met shRNA voor Shh (stMSC ^{ShhKO) genummerd 59-63. Een pLKO.1-puro vector getransduceerde RFP-MSC-cellijn (stMSC vect) diende als de controle voor de endogene niveau van Shh genexpressie. Western blot analyse werd gebruikt om Shh knockdown en RFP expressie te bevestigen.}

Transfectie van wtMSCs tot overexpressie Shh

Het plasmide (Origene CW101340) werd met de Origene Turbofectin reagens bij verhoudingen van 0 :1, 01:01, 02:01, 03:01 en 04:01 en gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. Het transfectiereagens werd vervolgens druppelsgewijs aan wtMSCs bij 70% confluentie en men liet incuberen gedurende 24 uur voordat de cellen onder selectiedruk in normale media werden gebracht met puromycine. De effectieve dosis puromycine nodig ongetransfecteerde cellen te elimineren is eerder bepaald door een puromycine kill test curve concentraties van 0 tot 10 ug /ml (gegevens niet getoond). De laagste concentratie die alle getransfecteerde cellen bij 3-4 dagen na de behandeling gedood was dus 2 ug /ml.

In vivo stMSC werk en proliferatie

C57BL /6 muizen werden getransplanteerd met 1 x 10 ^{6 wtMSCs, wtMSCs Shh, stMSCs vect of stMSCs ShhKO via staartader injectie. Drie dagen na de transplantatie werden de muizen geïnjecteerd met drager (steriel PBS, i.p.) of rmIFNγ (1 ug /dag, i.p.) gedurende 7 of 21 dagen. Muizen werden geïnjecteerd met 200 gl BrdU labeling reagens voorraad (5-Broom-2'-deoxy-uridine Labeling en detectie II Kit, Roche Diagnostics, ip) 24 uur voorafgaand aan analyse, en maag secties gefixeerd in 4% paraformaldehyde, paraffine-ingebedde en 3 uM secties voorbereid voor immunohistochemische en immunofluorescentie analyses. Geheel beenmerg werd geïsoleerd uit de dijbenen van dezelfde muizen met PBS spoelen. Rode bloedcellen werden gelyseerd met behulp van rode bloedcellen lysis buffer (4,14 g NH _{4cl, 0,5 g KHCO 3, 0,5 M EDTA in 500 ml, pH 7.2-7,4). Ongeveer 11 x 10 6 cellen werden gefixeerd en gepermeabiliseerd met behulp Caltag Laboratories flowcytometrie Kit volgens het protocol van de fabrikant (Invitrogen, GAS-004) en gekleurd met anti-RFP FITC-geconjugeerd antilichaam (1:100, Abcam, ab34764 ) en vervolgens gekleurd met Vybrant DyeCycle Ruby vlek (Invitrogen) volgens het protocol van de fabrikant. Fluorescentie werd geanalyseerd met de BD LSRII flowcytometer systeem. Om specifiek wat de RFP-MSC's werd gating gebruikt om de celcyclus van alleen het FITC-positieve cellen geanalyseerd. Piek fluorescentie werd geanalyseerd door ModFitLT software om het percentage van de bevolking bepalen elke fase van de celcyclus.}}

flowcytometrie en celcyclus analyse

De cellen werden serum uitgehongerde 16 uur voorafgaand aan analyse . Cellen werden gefixeerd met ijskoude 70% ethanol /PBS gedurende 15 minuten bij -20 ° C, gewassen en daarna gekleurd met propidium jodide gedurende 45 minuten. De gemeten waarden van piekfluorescentie per totaal aantal cellen werd verkregen met het programma CellQuest Pro (Becton Dickson). Het percentage van cellen uit de populatie in elke fase van de celcyclus werd berekend uit de piek fluorescentiemetingen door analyse met ModFit LT-software. Flow cytometrie met de FACSCalibur ™ -systeem (Becton Dickson) werd uitgevoerd op alle getransduceerde cellen met de muis multipotente mesenchymale stamcel marker antilichaam Paneel volgens protocol van de fabrikant (R &D Systems, SC018).

Immunoprecipitatie en Western blotanalyse

Cel lysaten werden bereid met M-PER zoogdieren eiwitextractie reagens (Thermo Scientific, IL) aangevuld met proteaseremmers (Roche) volgens het protocol van de fabrikant. Media monsters van cellen werden geconcentreerd met behulp van 15 ml Amicon Ultra Centrifuge filters Devices (Millipore). Cellysaten (100 ug totaal eiwit) en media werden immunogeprecipiteerd onder toepassing van anti-Shh antilichaam 5E1 (2 ug) bij 4 ° C gedurende 16 uur. Proteïne A /G agarose kralen (20 pl, Santa Cruz Biotechnology, CA) werden toegevoegd en de monsters geïncubeerd bij 4 ° C gedurende 16 uur. Na 16 uur incubatie, werden immunoprecipitaten 3 maal gebruik PBS gewassen en geresuspendeerd in 40 pl Laemmli laadbuffer bevattende β-mercaptoethanol (Bio-Rad Laboratories, CA) voor het laden op 4-20% Tris-Glycine gradiëntgels. De gelen werden bij 80 V, 3,5 uur, eiwitten overgebracht naar nitrocellulose membranen bij 105 V, 1-2 uur, en vervolgens geblokkeerd gedurende 1 uur bij kamertemperatuur met behulp KPL detectieblok (Kirkegaard & Perry Laboratories, Inc.). Membranen werden overnacht geïncubeerd bij 4 ° C met een verdunning van 1:200 Shh antilichaam (N-19, Santa Cruz) gevolgd door een 1 uur incubatie met 1:100 AlexaFluor verdunning van anti-geit 680 (Invitrogen). Blots werden afgebeeld met behulp van een scanning densitometer met analysesoftware (Odyssey Infrarood Imaging Software System).

RNA isolatie en RT-PCR

Totaal RNA werd geïsoleerd uit weefsel met behulp maag Trizol Reagens volgens de protocol van de fabrikant (TriReagent, Molecular Research Center, Inc.). In de grote cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems) werd gebruikt voor cDNA-synthese uit RNA na het aanbevolen protocol. Voor elk monster werd 60 ng RNA omgekeerd getranscribeerd met ongeveer 2 ug totaal cDNA dat vervolgens werd gebruikt voor RT-PCR verkregen. RFP primersequenties gebruikt waren als volgt: FORWARD -5 'CCC CGT AAT GCA GAA GAA GA 3', ACHTERUIT -5 'CTT GGC CAT GTA GGT GGT CT 3'. PCR amplificaties werden uitgevoerd in een totaal volume van 20 ul, bevattende buffer, 20 mM forward en reverse primers, Taq polymerase, RNase-vrij water en cDNA template. Elke PCR-amplificatie werd uitgevoerd in duplo putjes in een GeneAmp PCR System 9700 thermocycler (Applied Biosystems) onder de volgende omstandigheden: 94 ° C 3 minuten, 94 ° C 30 seconden, 60 ° C 1 minuut en 72 ° C 1 minuut 35 cycli. PCR-producten werden gevisualiseerd op een 1,5% TAE agarose gel.

Immunohistochemie

Muizen werden geïnjecteerd met 200 ul van BrdU labeling reagens voorraad (5-Broom-2'-deoxy-uridine Labeling en detectie II kit, Roche Diagnostics) 24 uur voorafgaand aan analyse. Gastrische weefsels werden gefixeerd met fixatief Carnoy's (60 ml ethanol, 30 ml chloroform, 10 ml azijnzuur) gedurende 16 uur, in paraffine ingebed en 4 pm secties werden bereid. Na deparaffineren werd antigeenterugtrekking uitgevoerd door verhitting van de objectglaasjes gedurende 10 minuten bij 100 ° C in 0,01 M natriumcitraat buffer (Antigen ontmaskeren Solution, Vector Laboratories, Burlingame, CA). Endogene peroxidase activiteit werd vervolgens geblokkeerd door incubatie objectglaasjes in 3% waterstofperoxide /ethanol gedurende nog 20 minuten. Secties werden vervolgens geblokkeerd met 5% BSA /Tris gebufferde zoutoplossing /0,1% Tween 80 (TBS-T) en geïncubeerd met een 1:20 verdunning van anti-BrdU-antilichaam (5-Broom-2'-deoxy-uridine Labeling en detectie Kit II, Roche Diagnostics) bij 37 ° C gedurende 30 minuten. BrdU kleurontwikkeling werd uitgevoerd volgens het protocol van de fabrikant. Secties werden vervolgens geblokkeerd met 20% normaal geit serum gedurende 20 minuten geïncubeerd met een 1:400 verdunning van biotine-geconjugeerd anti-RFP antilichaam (Abcam, ab34771) gedurende 16 uur bij 4 ° C gevolgd door verdunning van anti- 1:500 konijn IgG gedurende 30 minuten en vervolgens zichtbaar gemaakt met avidine-biotine complexen met de Vectastain Elite ABC kit gebruikt diaminobenzidine (DAB) als substraat (Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA). Dia's werden gemonteerd met behulp van Permount.

Voor adipocyten inductie werden stMSCs behandeld met HyClone DMEM containing10 ^{-8 M dexamethason (Sigma, D4902) en 5 ug /ml insuline (Sigma, I6634). Alle cellen werden bevestigd met 4% paraformaldehyde gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur. Differentiatie op te sporen, werd Oil Red O kleuring uitgevoerd door toevoeging van een 3,75% Oil Red O-oplossing, incubatie van 5 minuten bij KT, daarna wassen in water vóór het monteren op dia's met behulp Vectashield HardSet Mounting Medium. Beelden werden bekeken en gevangen onder een lichtmicroscoop met behulp van een Olympus BX60 met een diagnostische instrumenten "Spot" Camera.}

Immunofluorescentie

stMSC ^{vect en stMSC ShhKO cellen werden gekweekt op dekglaasjes tot 70-80% confluentie met 4% paraformaldehyde gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur, gepermeabiliseerd met PBS dat 0,5% Triton X-100 en geblokkeerd met 2% ezel serum gedurende 1 uur bij kamertemperatuur geroerd. Cellen werden vervolgens geïncubeerd met hetzij een 1:50 verdunning van anti-CD44 (Abcam ab65829) of 1:100 verdunning van anti-CD45 (Abcam ab10558) antilichaam overnacht bij 4 ° C. Alexa Fluor ezel anti-konijn 488 werd gebruikt als het secundaire antilichaam bij 1:1000 verdunning gedurende 1 uur bij kamertemperatuur geroerd. De cellen werden vervolgens tegengekleurd met 1:2000 verdunning van nucleaire vlek TO-PRO-3-jodide (Invitrogen, T3605) gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur vóór het monteren middels HardSet Vectashield Mounting Medium. Konijn IgG werd gebruikt bij een 1:25 verdunning als negatieve controle onder dezelfde omstandigheden.}

Maag secties vanuit PBS of IFNy behandelde muizen werden geblokkeerd met 20% normaal geit serum en geïncubeerd met anti- 1:400 RFP antilichaam (Abcam, ab34771) gedurende 16 uur bij 4 ° C gevolgd door 1:100 anti-konijn Alexa Fluor 488 (Invitrogen) secundair antilichaam gedurende nog 1 uur. Objectglaasjes werden vervolgens tegengekleurd met behulp van anti-E-cadherine (BD Transduction Labs, 610.181) antilichaam bij een verdunning 1:200 gedurende 1 uur bij kamertemperatuur gevolgd door 1:100 anti-muis Alexa Fluor 633 (Invitrogen) secundair antilichaam. Alle monsters werden gemonteerd met behulp van Vectashield Hardset Mounting Medium (VectaLabs). Beelden werden verkregen met behulp van een Zeiss LSM510 META confocale microscoop.

Chemotaxis Assay

De chemotaxis test werd uitgevoerd op basis van vastgestelde protocollen [22]. Getransduceerde stMSCs werden uitgezet in 24 goed transwell platen met PET-membranen met 8 urn poriën (BD Falcon). 2,5 x 10 ^{4 cellen werden in de apicale (bovenste) ruimte in DMEM medium dat 0,1% BSA. SDF-1α (rmSDF-1α, R &D Systems) werd aan de basolaterale (onderste) kamer toegevoegd in concentraties van 0 tot 150 ng /ml. Cellen werden gedurende 6 uur bij 37 ° C. Na de migratie werden de cellen gefixeerd in 4% paraformaldehyde gedurende 30 minuten vervolgens gekleurd voor 10 minuten met een Wright-Giemsa-kleuring. Cellen die overblijven op de bovenkant van het membraan verwijderd met een wattenstaafje en de resterende cellen werden geteld in 5 velden 40x vergroting. Het aantal migrerende cellen werd berekend door het gemiddeld aantal migrerende cellen in elk putje door het gemiddeld aantal migrerende cellen in het controleputje verdelen.}

Statistische analyse

De resultaten werden geanalyseerd met ofwel een ongepaarde student t-test of ANOVA met behulp van commercieel verkrijgbare software (GraphPad Prism, GraphPad software, San Diego, CA). Een P
waarde < 0,05 werd beschouwd als significant

Resultaten

IFNy-geïnduceerde stMSC Proliferatie wordt gemedieerd door Shh Afscheiding en Signaling

De rol van. hedgehog signalering als een mediator van IFNy-geïnduceerde stMSC en wtMSC proliferatie werd door stromingscytometrie en celcyclus. Na behandeling werden de cellen gekleurd met propidium jodide en celcyclus door flow-cytometrie geanalyseerd op een geselecteerde cel populatie (Figuur S1A). Figuur 1 geeft de gemiddelde waarden van percentage celverdeling in verschillende fasen van de celcyclus in de behandelingsgroepen in figuren S1B-E. Cijfers S1B-E vertegenwoordigen plots met de veranderingen in de celcyclus fasen. De gemiddelde waarden en statistische significantie in reactie op alle behandelingen is samengevat in figuur S1F en G. Analyse van de ruwe fluorescentiegegevens toonden een verhoogd percentage stMSCs in S fase en G _{2 /M-fase en een lager percentage cellen in G 0 /G 1 fase reactie op rmIFNγ vergelijking met de met drager behandelde cellen (Figuur 1A). Om de rol van Shh afgescheiden identificeren als een mediator van IFNy-geïnduceerde proliferatie stMSC we gebruikte anti-egel neutraliserende 5E1 monoklonaal antilichaam dat bindt aan Shh ligand en verstoort binding aan de receptor Ptch [1]. De proliferatieve respons van stMSCs op rmIFNγ significant geremd door behandeling 5E1 antilichaam (Figuur 1A). Vergeleken met de stMSCs, niet-getransformeerde wtMSCs reageerde eveneens in reactie op IFNy suggereert dat de waargenomen toename in proliferatie werd niet het resultaat van de transformatie alleen. IFNy induceerde aanmerkelijk het percentage wtMSCs in S-fase, een reactie die werd geblokkeerd door anti-Shh antilichaam (Figuur 1B). Gezamenlijk Figuur 1 toont aan dat IFNy induceert proliferatie van zowel getransformeerde en spontaan getransformeerd MSC, een reactie die wordt gemedieerd door uitgescheiden Shh.}

zwijgen de Shh Gene binnen Bone Marrow-afgeleide stMSCs

Om volledig bestuderen van de rol van Hedgehog signaaltransductie in BM-MSC-proliferatie en werving in vivo
, wtMSCs werden getransfecteerd om over-express Shh terwijl stMSCs werden getransduceerd met lentivirale shRNAs tegen Shh. Een pLKO.1-puro base lentivirale vector die een korte hairpin sequentie tegen het transcript van de Shh gen werd gebruikt. Controle MSC cellijnen werden vastgesteld met behulp van wtMSC met endogene expressie van Shh en transfectie van stMSCs met de pLKO.1-puro base lentivirale vector (stMSC ^{vect). Vijf lentivirale klonen, elke kloon uiting van een ander korte hairpin sequentie, werden geanalyseerd (stMSC ShhKO59-stMSC ShhKO63). Knockdown van Shh werd bevestigd door Western blot analyse dat 100% knock-down van Shh eiwitexpressie in alle klonen toonde in vergelijking met de niet getransduceerde cellen (wtMSCs) en Shh overexpressie cellijnen (wtMSC Shh en stMSC vect) ( Figuur S2A). Kloon stMSC ShhKO59 werd gebruikt voor daaropvolgende experimenten als stMSC ShhKO worden aangeduid. Expressie van pDsRed-Hyg-C1 plasmide dat rood fluorescerend eiwit (RFP) werd bevestigd door immunoblot behulp cellysaat verzameld uit getransduceerde stMSCs (figuur S2A). Belangrijker wtMSCs stabiel getransfecteerd met overexpressie Shh eiwit tot expressie Shh op een niveau vergelijkbaar met de stMSCs (figuur S2A).}

Om knockdown van Shh in MSC verifiëren zonder dat de differentiatie van de cellen, een expressiepatroon voor de klassieke cd-markers (CD29, CD106, CD105, CD44 en CD73) en SCA-1 met behulp van flowcytometrie werd uitgevoerd met behulp van gekweekte stMSC ^{vect (figuur S2B) en stMSC ShhKO (figuur S2C) cellen. Beide stMSC vect en stMSC ShhKO cellen waren negatief voor CD45 (Figuur S3). Bovendien, zowel stMSC cellijnen waren in staat om onderscheid te maken naar een adipocyten fenotype gebaseerd op positieve Oil Red O kleuring van lipide druppeltjes geproduceerd (figuur S3). Tezamen zijn deze gegevens suggereren dat knock-down van Shh eiwit in stMSCs de differentiatie van deze cellen niet heeft gewijzigd.}

IFNy Veroorzaakt verspreiding van wtMSCs en stMSCs in Bone Marrow

Om het effect van IFNy op te bepalen wtMSC en stMSC proliferatie in vivo
, muizen werden getransplanteerd met RFP-tag wtMSC, wtMCS ^{Shh, stMSC vect of stMSC ShhKO cellen en behandeld met rmIFNγ gedurende 21 dagen. Na behandeling IFNy werd beenmerg geoogst en geanalyseerd op veranderingen in de celcyclus en het aantal RFP-positieve cellen door flowcytometrie. IFNy induceerde een aanzienlijke toename van het aantal RFP positieve cellen in het beenmerg van alle experimentele groepen met uitzondering van die dieren getransplanteerd met stMSC ShhKO cellen (Figuur 2A, B). Immunofluorescentie beenmerg gebleken dat er een significante toename in het bijzonder van het aantal prolifererende RFP positieve cellen in reactie op IFNy als co-gelokaliseerd met BrdU immunokleuring (figuur 2C, D). Dit werd verder ondersteund door figuur S4A, B en C die representatief lichtverstrooiing analyse onthullen een populatie stMSCs die positief waren RFP en omvatte ongeveer 0,1% van de totale celpopulatie beenmerg toont. RFP-positieve cellen werden gated voor de enkele cel populatie (figuur S4C) en celcyclus geanalyseerd. Cellen verzameld uit het beenmerg van muizen getransplanteerd met stMSC vect cellen behandeld met rmIFNγ had een significant groter percentage cellen in S-fase (55,5 ± 2,82%) in vergelijking met die muizen die met PBS (32,9 ± 5,14%, P Restaurant < 0,05 in vergelijking met stMSC vect getransplanteerde muizen behandeld met PBS) (Figuur S4F). Het percentage cellen in S-fase vanuit het beenmerg van muizen getransplanteerd met stMSC ShhKO behandeld met rmIFNγ waren niet significant verschillend (32,9 ± 2,64%) in vergelijking met die muizen die met PBS (38,4 ± 1,47%, P Restaurant > 0,05 in vergelijking met stMSC ShhKO getransplanteerde muizen behandeld met PBS) (Figuur S4i). Figuren S4D, E, G en H geven plots tonen de veranderingen in de celcyclus fasen. Zo IFNy induceert proliferatie van zowel wtMSCs en stMSCs In vivo
binnen het beenmerg, een antwoord dat lijkt te worden gemedieerd door Shh signalering.}

In vivo
Rekrutering van wtMSCs en stMSCs aan het maagslijmvlies in reactie op IFNy

om de rol van Hedgehog signalering te identificeren als een mediator van IFNy-geïnduceerde stMSC werving voor de maag epitheel, muizen getransplanteerd met stMSC ^{vect en stMSC ShhKO cellen werden behandeld met PBS of IFNy voor 21 dagen. Magen werden vervolgens verzameld en de werving van RFP-tag stMSC vect en stMSC ShhKO cellen door immunohistochemie geanalyseerd (figuur 3). stMSC vect cellen werden aangeworven om het maagslijmvlies muizen geïnjecteerd met IFNy (Figuur 3C, D) vergeleken met de afwezigheid van RFP hebben stMSC vect cellen in de maag van PBS-geïnjecteerde muizen (Figuur 3A, B ). stMSC ShhKO cellen getransplanteerd in muizen geïnjecteerd met IFNy niet werden aangeworven om het maagslijmvlies (figuur 3E, F). Expressie van RFP hebben stMSC vect cellen met IFNy behandeling werd bevestigd door RT-PCR (Figuur 3G). Om te bepalen of de aanwerving van MSC aan het maagslijmvlies in reactie op IFNy was uniek voor de stMSCs, werd het experiment herhaald met behulp van wtMSCs of wtMSCs overexpressie Shh (wtMSC Shh). Hoewel beide wtMSC en wtMSC Shh cellen in de maag van IFNy-behandelde muizen werden gedetecteerd, waren er significant hogere aantallen wtMSC Shh en stMSC vect cellen in het maagslijmvlies in vergelijking met de wtMSC cel getransplanteerde groep (Figuur 3H). Gezamenlijk suggereren deze gegevens dat Shh signalering zal waarschijnlijk werving van MSCs aan het maagslijmvlies als reactie op IFNy bemiddelen.}

Er was een significante toename van het aantal prolifererende cellen in het maagslijmvlies als reactie op IFNy behandelde wtMSC ^{Shh en stMSC vect getransplanteerde muizen in vergelijking met de PBS-geïnjecteerde muizen (Figuur 4A-D, Figuur S5A-F). Echter, MSCs werden BrdU negatief (Figuur 4B, C en figuur S5A-D). Hoewel stMSC ShhKO getransplanteerd in muizen geïnjecteerd met IFNy niet aangeworven om het maagslijmvlies, was er geen verschil in epitheliale proliferatie tussen PBS en IFNy behandeling in deze experimentele groep suggereert verhoogde MSC-afgeleide Shh nodig zijn om dit te ondersteunen verhoogde proliferatie (figuur 4D). Bovendien, hoewel wtMSCs werden aangeworven om het maagslijmvlies in reactie op IFNy, was er geen verschil in epitheliale proliferatie tussen de PBS en IFNy behandelingen (figuur 4D). Deze gegevens suggereren dat Shh signalering binnen wtMSCs Shh en stMSCs reactie op IFNy induceert proliferatie in de maag epitheel. IFNy alleen, in afwezigheid van stMSCs, niet proliferatie induceert in het maagslijmvlies bevestigt dit effect niet gerelateerd alleen ontstekingen.}

Om te bepalen of verminderde stMSC proliferatie na werving werd geassocieerd met celadhesie in de maag epitheel, magen werden vervolgens co-gekleurd voor E-cadherine en RFP (figuur 4G-I). PBS-behandelde muizen die waren getransplanteerd met RFP hebben stMSC ^{vect cellen vertoonden geen rekruteren van cellen aan het maagslijmvlies (Figuur 4G). In overeenstemming met Figuur 3, IFNy-geïnjecteerde muizen die werden getransplanteerd met RFP tag stMSC vect cellen vertoonden duidelijke rekrutering van cellen om het maagslijmvlies (figuur 4H). RFP-gemerkte stMSC Vect cellen co-gelokaliseerd met E-cadherine (Figuur 4G, I) het ondersteunen van die aangeworven cellen in de maag epitheel was geënt.}

Hedgehog Signalering Bemiddelt de expressie van Focal Adhesie Eiwitten in Response SDF-1α chemokine

We kozen voor de SDF-1α /CXCR4 signalering as onderzoeken omdat is vastgesteld dat deze signaleringsroute bevordert MSC recruitment [23], [24].

• PLoS ONE: Onverwachte Headless en Tailless Vissen in de maaginhoud van makreelhaai Isurus oxyrinchus
• PLoS ONE: Insectenetende Bats Digest chitine in de maag met behulp van Zure Mammalian Chitinase