PLOS ONE: o Sonic Hedgehog medeia a proliferação e Recrutamento de transformadas células-tronco mesenquimais aos Stomach

Abstract

Estudos utilizando camundongos infectados por Helicobacter
mostram que as células-tronco mesenquimais derivadas da medula óssea ( MSCs) podem repovoar o epitélio gástrico e promover a progressão do cancro gástrico. Dentro do microambiente do tumor do estômago, citocina pró-inflamatória interferão-gama (IFN-y) e hedgehog Sonic (Shh) são elevados. IFN-y está implicado na proliferação do tumor através da activação da via de sinalização de Shh em vários tecidos mas se existe um mecanismo similar no estômago é desconhecida. Nós testamos a hipótese de que IFNy impulsiona a proliferação MSC e recrutamento, uma resposta mediada pela sinalização Shh. O estudo atual usa transplante de um in vitro
transformado linha de células estaminais mesenquimais (stMSC ^{vect), que super-expressa sinalização de hedgehog, em comparação com MSCs não transformadas do tipo selvagem (wtMSCs), wtMSCs transfectada sobre-expresso Shh (wtMSC Shh) e stMSCs transduzidas com construções de lentivírus contendo shRNA alvo o gene Shh (stMSC ShhKO). O efeito de IFN-y na proliferação de MSC foi avaliada através da análise do ciclo celular In vitro
utilizando células tratadas com IFN-y recombinante (rmIFNγ) sozinho, ou em combinação com o anticorpo anti-5E1 de Shh, e In vivo
usando ratinhos transplantados com MSC tratadas com PBS ou rmIFNγ. In vitro
, IFN-y proliferação significativamente aumentada MSC, uma resposta mediada por Shh que foi bloqueado pelo anticorpo 5E1. A população MSC recolhidas a partir da medula óssea de PBS ou de murganhos tratados com IFN-y mostraram que IFN-y aumentou significativamente a percentagem de todas as linhas de células de MSC em fase S, com a excepção do stMSCs ShhKO células. Enquanto as linhas de células com expressão Shh MSC intactos foram recrutados para a mucosa gástrica em resposta a IFN-y, stMSCs ShhKO não eram. Hedgehog sinalização é necessária para a proliferação MSC e ao recrutamento para o estômago em resposta a IFN-y}

Citation:. Donnelly JM, Chawla A, Houghton J, Zavros Y (2013) de Sonic Hedgehog medeia a proliferação e Recrutamento de tronco mesenquimais Transformado as células para o estômago. PLoS ONE 8 (9): e75225. doi: 10.1371 /journal.pone.0075225

editor: Jorge Sans Burns, Hospital Universitário de Modena e Reggio Emilia, Itália |

Recebido: 24 Janeiro, 2013; Aceito: 14 de agosto de 2013; Publicação: 19 de setembro de 2013

Direitos de autor: © 2013 Donnelly et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiada pela Sociedade americana de Câncer Research Scholar Award 119072-RSG-10-167-01-MPC (Y. Zavros), Albert J. Ryan Foundation Fellowship (J. Donnelly) e em parte por do digestivo Centro de Saúde Cincinnati Children Health Medical center (DHC: banco de cabeceira Research in Digestive Disease Pediátrica) CHTF /SUB DK078392. Os autores gostariam de agradecer a assistência do gerente Monica DeLay do Fluxo Research Citometria Núcleo da Divisão de Reumatologia Infantil de Cincinnati Medical Center Hospital, apoiado em parte pelo National Institutes of Health (NIH) AR-47363. Todo o fluxo de dados de citometria de fluxo foram adquiridos utilizando o equipamento mantido pelo fluxo Research Citometria Núcleo da Divisão de Reumatologia Infantil de Cincinnati Medical Center Hospital, apoiado em parte pelo NIH AR-47363. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

Há um papel claramente estabelecido para o sonic Hedgehog (Shh) de sinalização para o desenvolvimento de câncer [1], [2], [3]. O crescimento celular em tumores do aparelho digestivo que incluem esôfago, estômago, trato biliar e pâncreas são regulados pela expressão endógena de ligantes Hedgehog como Shh [1]. A ligação do ligando ao seu receptor Hedgehog, Patched (Ptch), resulta na remoção da inibição de Ptch em Smoothened (Smo). Esta remoção da inibição em Smo resulta na activação do Gli-família de factores de transcrição Hedgehog e o crescimento do tumor, subsequentemente, que pode ser bloqueada por anticorpos neutralizantes do ouriço [1]. Embora a associação entre o cancro gástrico Shh e é claro, o papel funcional de Shh no desenvolvimento e progressão do cancro gástrico é em grande parte desconhecida. Além disso, o mecanismo que regula a produção de Shh dentro do microambiente do tumor tem ainda a ser determinado.

Helicobacter pylori (H. pylori)
colonização bacteriana causa inflamação crónica que é consistentemente associada com o progressão para cancro gástrico [4]. A resposta imune mais comum e prejudicial envolve as Th1 citocinas pró-inflamatórias, o mais proeminente de IFN-y a partir de células T e IL-1β e TNFa a partir de tecido ou macrófagos invasores [5], [6], [7], [8], [ ,,,0],9]. Com efeito, uma citoquina pró-inflamatória de IFN-y tem demonstrado contribuir para a patogénese e no desenvolvimento de metaplasia gástrica [5], [9], [10] e do cancro [10]. Nos cancros induzida por inflamação, a via de sinalização Hedgehog medeia-IFNy induzida por tumor desenvolvimento [11], [12], [13]. Em particular, Shh é um gene alvo de IFN-y e de sinalização Hedgehog um mediador da proliferação induzida por IFN-y [12].

Durante infecção por Helicobacter
, inflamação crónica coincide com o recrutamento de osso derivadas de medula células-tronco mesenquimais (BM-MSCs) [14], [15]. No estômago cronicamente inflamado BM-MSCs são recrutadas a partir da medula óssea para o estômago e diferenciam-se em fibroblastos associados ao cancro (FAC) que são instrumentais em dirigir o desenvolvimento do cancro [14]. Embora claramente implicada no desenvolvimento de cancro gástrico, o mecanismo de regulação da proliferação e recrutamento de malignamente transformados BM-MSCs ao estômago durante a inflamação crónica é em grande parte desconhecida. Curiosamente, Shh é relatado para induzir a proliferação e diferenciação de BM-MSCs [16]. Shh também tem sido reconhecido como um quimioatrativo potencial de células de medula óssea derivada quando regulada em resposta à inflamação crônica [17], [18].

Com base na associação entre IFN-y e Shh, vamos supor que IFN-y induz Shh sinalização dentro de MSCs que facilitam a migração de células para o estômago. Para testar esta hipótese, o presente estudo compara in vivo
BM-MSC recrutamento para a mucosa gástrica em resposta a IFN-y utilizando uma linha de células estaminais mesenquimais espontaneamente transformada (stMSC) em comparação com untransformed BM-MSCs. Na cultura, BM-MSCs são propensas a mutação com o envelhecimento e apresentam mutações clinicamente relevantes no gene p53 [19]. Com a cultura de longo prazo BM-MSCs "espontaneamente transformar" (stMSCs), podem ser propagados in vitro durante períodos prolongados e exibem um fenótipo de promoção do cancro [19]. O presente estudo utiliza os dois stMSCs e não transformadas BM-MSC (wtMSCs) que super-expressa de sinalização Hedgehog. Usando as linhas de células wtMSC e stMSC tanto in vivo
e in vitro
, demonstramos que IFN-y induzida proliferação e recrutamento de linhas de células MSC para o estômago é uma resposta que é mediada por Shh secreção e sinalização.

Materiais e Métodos

Animais

C57BL /6 (estirpe�664) e IRG (705 estirpe) ratos utilizados para estes estudos foram adquiridos de Jackson Laboratories. Todos os estudos com ratos foram aprovados pela Universidade de Cincinnati Animal Care Institucional e Comitê de Uso (IACUC), que mantém uma Associação Americana de Avaliação e Acreditação do Laboratório Animal Care (AAALAC) instalações.

derivadas da medula óssea mesenquimais Espontaneamente Transformado As células-tronco (stMSC) e não-transformados BM-MSCs (wtMSC) Cultura e tratamentos

As linhas celulares wtMSC foram estabelecidas a partir da medula óssea de ratos todo IRG e cultivadas à passagem 5 antes da transfecção com posterior manutenção em baixa número de passagens (< P10) antes da utilização experimental. medula óssea total foi lavada do fémur e da tíbia de ratos para a cultura e passagem da população MSC aderente plástico [20] subsequente. células transformadas espontaneamente de osso derivadas de medula estaminais mesenquimais (stMSCs) transfectadas com um plasmídeo pDsRed-Hyg-C1 expressar a proteína fluorescente vermelha foram usadas [21]. Todas as células foram cultivadas utilizando meios de cultura HyClone DMEM suplementado com 10-15% de soro fetal de vitela e 1% de penicilina-estreptomicina, sob condições normais. MSCs cultivadas para tratamento foram plaqueadas em placas de 6 poços e deixadas a crescer até 70-80% de confluência em meios normais então privadas de soro durante a noite. Após a expansão da cultura, a célula de rato Multipotentes estromais mesenquimais marcador painel de anticorpos foi utilizado para marcar linhas celulares MSC para Sca-1, CD106, CD105, CD73, CD29, CD44 e os marcadores hematopoiéticas CD45 e CD11b (R & D Systems, SC018). As células foram suspensas a uma concentração de 1 × 10 ^{6 células /ml e coradas de acordo com o protocolo do fabricante. As células foram então incubadas com 488 AlexaFluor a uma diluição 1:100 durante 30 minutos a 4 ° C. A fixação foi realizada durante 15 minutos a RT utilizando um reagente comercialmente disponível (Invitrogen GAS001S5). A intensidade de fluorescência foi medida por citometria de fluxo utilizando o software BD FACSCalibur e CellQuestPro. wtMSCs stMSCs e foram tratados com veículo, de pequeno rato recombinante interferão gama (rmIFNγ, 100 nM, R & D Systems) ou anti-Shh anticorpo 5E1 (pré-tratados durante 6 horas) mais rmIFNγ durante 24 horas. As células tratadas foram então analisadas para mudanças no ciclo celular por citometria de fluxo.}

o Sonic Hedgehog (Shh) Knockdown por Lentivírus mediada Curto Hairpin RNA (shRNA) usando stMSCs

stMSCs RFP-marcadas eram transduzidas com cinco clones MISSÃO lentiviral transdução de partículas diferentes contendo diferentes sequências de shRNA para Shh e uma resistência puromicina componente pLKO.1-puro conferindo (Sigma Aldrich). stMSCs RFP-marcadas foram incubadas com partículas de lentivírus com ExpressMag esferas magnéticas (Sigma Aldrich) em um íman (Oz Biosciences Placa super magnética, MF10000) durante 15 minutos, as células foram removidas a partir do íman, incubadas durante mais 16 horas e, em seguida, colocado sob puromicina selecção (DMEM Meio de Cultura contendo 10% de soro de vitela fetal, 1% de penicilina /estreptomicina, 10 ug /ml de puromicina) durante 7 a 10 dias. A dose eficaz puromicina necessário para eliminar as células não transduzidas foi determinada previamente por meio de uma curva de puromicina mortes que testou concentrações de 0 a 50 ug /ml (dados não mostrados). células transduzidas foram indicados por um número único clone ID com linhas de células transduzidas com shRNA para Shh (stMSC ^{ShhKO) numeradas 59-63. A (vect stMSC ) pLKO.1-puro vector transduzidas linha de células RFP-MSC serviu como controlo para o nível endógeno da expressão do gene Shh. análise de Western blot foi utilizada para confirmar Shh knockdown e expressão RFP.}

A transfecção de wtMSCs para Over-expressa Shh

O plasmídeo (Origene CW101340) foi combinado com o reagente Origene Turbofectin em proporções de 0 :1, 1:01, 2:01, 3:01 e 4:01 e incubadas durante 15 minutos à temperatura ambiente. O reagente de transfecção foi então adicionada gota a gota a wtMSCs a 70% de confluência e deixado a incubar durante 24 horas antes de as células foram colocadas sob selecção em meio normal com puromicina. A dose eficaz puromicina necessário para eliminar as células não transfectadas foi determinada previamente por meio de uma puromicina matar as concentrações de teste de curva de 0 a 10 ug /ml (dados não mostrados). A menor concentração que matou todas as células não transfectadas em 3-4 dias após o tratamento foi estabelecido como 2 ug /ml.

In vivo stMSC Recrutamento e Proliferação

camundongos C57BL /6 foram transplantados com 1 × 10 ^{6 wtMSCs, wtMSCs Shh, stMSCs vect ou stMSCs ShhKO através de injecção na veia da cauda. Três dias após o transplante, os ratinhos foram injectados com veículo (PBS estéril, i.p.) ou rmIFNγ (1 ug /dia, i.p.) durante 7 ou 21 dias. Os ratinhos foram injectados com (rotulagem 5-bromo-2'-desoxi-uridina e Detecção Kit II, Roche Diagnostics, ip) de 200 ul de solução mãe de reagente de rotulagem BrdU 24 horas antes da análise, e secções de estômago fixado em paraformaldeído a 4%, parafina-embedded e 3 uM secções preparado para imuno-histoquímica e análise de imunofluorescência. medula integral foi também isolado a partir dos fémures de ratos com a mesma PBS lavagem. Os glóbulos vermelhos foram lisados ​​utilizando tampão de lise de glóbulos vermelhos (4,14 g NH _{4Cl, 0,5 g KHCO 3, 0,5 M de EDTA em 500 ml, de pH 7.2-7,4). Cerca de 11 × 10 6 as células foram fixadas e permeabilizadas utilizando o kit Caltag Laboratories citometria de fluxo, de acordo com o protocolo do fabricante (Invitrogen, GAS-004) e coradas utilizando anticorpo anti-RFP conjugado com FITC (1:100, Abcam, ab34764 ) e, em seguida, coradas utilizando mancha Vybrant DyeCycle ruby ​​(Invitrogen) de acordo com o protocolo do fabricante. A fluorescência foi analisada utilizando o sistema BD LSRII citómetro de fluxo. Para analisar especificamente a RFP-MSC, gating foi usado para analisar o ciclo celular de apenas as células positivas para FITC. pico de fluorescência foi analisada pelo software ModFitLT para determinar a percentagem da população em cada fase do ciclo celular.}}

citometria de fluxo e Análise do Ciclo Celular

As células foram privadas de soro 16 horas antes da análise . As células foram fixadas com gelo frio de 70% de etanol /PBS durante 15 minutos a -20 ° C, lavadas e depois coradas com iodeto de propídio durante 45 minutos. Os valores medidos de pico de fluorescência por número total de células foram obtidos utilizando o programa CellQuest Pro (Becton Dickson). A percentagem de células da população em cada fase do ciclo celular foi calculada a partir das medições de fluorescência através da análise de pico com o software ModFit LT. A citometria de fluxo utilizando o sistema FACSCalibur ™ (Becton Dickson) foi realizada em todas as células transduzidas utilizando o rato Multipotentes mesenquimais Stem Cell marcador painel de anticorpos de acordo com o protocolo do fabricante (R & D Systems, SC018).

Imunoprecipitação e Western análise de mancha

os lisados ​​celulares foram preparados utilizando M-PER de mamífero reagente de extracção de proteína (Thermo Scientific, IL) suplementado com inibidores de protease (Roche) de acordo com o protocolo do fabricante. amostras de mídia a partir de células foram concentradas utilizando 15 mL Amicon dispositivos de filtração centrífuga Ultra (Millipore). Os lisados ​​celulares (100 ug de proteína total) e os meios foram imunoprecipitados utilizando um anticorpo anti-5E1 de Shh (2? g) a 4 ° C durante 16 horas. /G esferas de agarose de proteína A (20 uL, Santa Cruz Biotechnology, CA) foram adicionados e as amostras incubadas a 4 ° C durante 16 horas. Após a 16 horas de incubação, os imunoprecipitados foram lavados 3 vezes com PBS e ressuspensas em 40 ul de tampão de carga Laemmli contendo β-mercaptoetanol (Bio-Rad Laboratories, CA) antes do carregamento para 4-20% de Tris-Glicina de gradiente geles. Os géis foram corridos a 80 V, 3,5 horas, proteínas transferidas para membranas de nitrocelulose a 105 V, 1-2 horas, e depois bloqueadas durante 1 hora à temperatura ambiente utilizando KPL bloco detector (Kirkegaard & Perry Laboratories, Inc.). As membranas foram incubadas durante a noite a 4 ° C com uma diluição de anticorpo Shh (N-19, Santa Cruz) seguido de uma incubação de 1 hora com diluição 1:100 AlexaFluor de cabra anti-680 (Invitrogen) 1:200. As transferências foram fotografadas utilizando um densitómetro de varrimento juntamente com o software de análise (Odyssey Infrared Imaging System Software).

Isolamento de ARN e RT-PCR

O ARN total foi isolado a partir de tecido do estômago utilizando o reagente Trizol de acordo com a fabricantes de protocolo (TriReagent, Molecular Research Center, Inc.). A High Capacity cDNA de transcrição reversa Kit (Applied Biosystems) foi utilizado para síntese de ADNc a partir de ARN seguindo o protocolo recomendado. Para cada amostra, 60 ng de ARN foi transcrito de forma inversa para produzir cerca de 2 ug de ADNc total que foi, em seguida, utilizado para RT-PCR. sequências iniciadoras RFP utilizadas foram as seguintes: FRENTE -5 'CCC CGT AAT GCA GAA GAA GA 3', inverta -5 'CTT GGC CAT GTA GGT GGT CT 3'. As amplificações de PCR foram realizadas num volume total de 20 uL, contendo tampão, 20 mM de iniciadores, para a frente e contra a Taq polimerase, ARNase-livre de água e de molde de ADNc de inverter. Cada amplificação por PCR foi realizado em poços em duplicado numa PCR GeneAmp sistema 9700 termociclador (Applied Biosystems), utilizando as seguintes condições: 94 ° C 3 minutos, 94 ° C 30 segundos, 60 ° C 1 minuto e 72 ° C, 1 minuto para 35 ciclos. Os produtos de PCR foram visualizados num gel de agarose TAE a 1,5%.

A imuno-histoquímica

Os ratinhos foram injectados com 200 uL de solução mãe de reagente de rotulagem BrdU (rotulagem 5-bromo-2'-desoxi-uridina e Detecção kit II, Roche Diagnostics) 24 horas antes da análise. tecidos gástricos foram fixadas com fixador de Carnoy (60 ml de etanol, 30 ml de clorofórmio, 10 ml de ácido acético) durante 16 horas, embebidas em parafina, e 4 uM secções foram preparados. Após desparafinização, recuperação de antigénio foi realizada por aquecimento das lâminas durante 10 minutos a 100 ° C na de sódio 0,01 M de tampão de citrato (antigénio desmascaramento Solução, Vector Laboratories, Burlingame, CA). A actividade da peroxidase endógena foi bloqueada através da incubação em seguida, as lâminas em 3% de peróxido de hidrogénio /etanol durante mais 20 minutos. As secções foram então bloqueadas com BSA a 5% /solução salina tamponada com Tris /0,1% de Tween 80 (TBS-T) e incubadas com uma diluição de anticorpo anti-BrdU (rotulagem 5-bromo-2'-desoxi-uridina e Kit de Detecção de 01:20 II, Roche Diagnostics) a 37 ° C durante 30 minutos. o desenvolvimento da cor de BrdU foi realizada de acordo com o protocolo do fabricante. As secções foram então bloqueadas com soro de cabra normal a 20% durante 20 minutos e incubadas com uma diluição 1:400 de anticorpo anti-RFP conjugado com biotina (Abcam, ab34771) durante 16 horas a 4 ° C, seguido por diluição de anti-1:500 IgG de coelho durante 30 minutos e, em seguida visualizados com complexos de avidina-biotina, utilizando o kit Vectastain Elite ABC utilizando diaminobenzidina (DAB) como substrato (Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA). As lâminas foram montadas usando Permount.

Para a indução de adipócitos, stMSCs foram tratados com HyClone DMEM containing10 ^{-8 M dexametasona (Sigma, D4902) e 5 ug /ml de insulina (Sigma, I6634). Todas as células foram fixadas com paraformaldeído a 4% durante 20 minutos à TA. Para detectar diferenciação, Oil Red O coloração foi realizada por adição de uma solução 3,75% Oil Red O, incubando 5 minutos, à TA, em seguida, a lavagem com água antes da montagem em lâminas com Vectashield HardSet Meio de montagem. As imagens foram vistos e capturados em microscopia de luz utilizando um Olympus BX60 com uma câmera Diagnostic Instruments "Spot".}

Imunofluorescência

stMSC ^{vect e stMSC células ShhKO foram cultivadas em lamelas até 70-80% de confluência, fixadas com paraformaldeído a 4% durante 30 minutos à temperatura ambiente, permeabilizadas com PBS contendo 0,5% Triton X-100 e bloqueadas com soro de burro a 2% durante 1 hora à temperatura ambiente. As células foram então incubadas com uma diluição de 1:50 de anti-CD44 (Abcam ab65829) ou uma diluição 1:100 de anticorpo anti-CD45 (Abcam ab10558) durante a noite a 4 ° C. Alexa Fluor de burro anti-coelho 488 foi usado como o anticorpo secundário em 1:1000 diluição durante 1 hora à temperatura ambiente. As células foram então contrastadas com uma diluição do corante nuclear de TO-PRO-3 iodeto de (Invitrogen, T3605) durante 20 minutos à temperatura ambiente antes da montagem 1:2000 utilizando Vectashield HardSet Meio de Montagem. IgG de coelho foi utilizado a uma diluição 1:25 como controlo negativo sob as mesmas condições.}

secções de estômago recolhidos a partir de PBS ou ratinhos tratados com IFN-y foram bloqueadas com soro de cabra normal a 20% e incubadas com anti-1:400 anticorpo RFP (Abcam, ab34771) durante 16 horas a 4 ° C, seguido por anticorpo secundário anti-coelho 1:100 Alexa Fluor 488 (Invitrogen) durante mais 1 hora. As lâminas foram então contrastadas utilizando anticorpos anti-E-caderina (BD Transduction Labs, 610181) a uma diluição de anticorpo 1:200 durante 1 hora à temperatura ambiente, seguido por anticorpo anti-ratinho 1:100 Alexa Fluor 633 (Invitrogen) secundário. Todas as amostras foram montadas usando Vectashield Hardset meio de montagem (VectaLabs). As imagens foram obtidas utilizando um microscópio confocal Zeiss LSM510 META.

Ensaio de Quimiotaxia

O ensaio de quimiotaxia foi realizada com base em protocolos estabelecidos [22]. stMSCs transduzidas foram semeadas em 24 placas bem transpo� contendo membranas de PET com 8 mm poros (BD Falcon). 2,5 × 10 ^{4 células foram semeadas na câmara apical (superior) em meio DMEM contendo 0,1% de BSA. SDF-1α (rmSDF-1α, R & D Systems) foi adicionado à (inferior) câmara basolateral em concentrações de 0 a 150 ng /ml. As células foram incubadas durante 6 horas a 37 ° C. Após a migração, as células foram fixadas em paraformaldeído a 4% durante 30 minutos, em seguida, coradas durante 10 minutos, utilizando uma coloração de Wright-Giemsa. As células remanescentes na parte superior da membrana foram removidos com um aplicador com ponta de algodão e as células restantes foram contadas em 5 campos de uma ampliação de 40 ×. O número de células que migram foi calculado dividindo-se o número médio de células em cada poço de migrar por o número médio de células migrantes na cavidade de controlo.}

Análise estatística

Os resultados foram analisados ​​por qualquer um desemparelhado teste t de Student ou ANOVA utilizando software comercialmente disponível (GraphPad Prism, GraphPad software, San Diego, CA). A P
valor < 0,05 foi considerado significativo

Resultados

IFNy induzida por stMSC Proliferação é mediada por Shh Secreção e sinalização

O papel da. Hedgehog sinalização como um mediador da proliferação stMSC e wtMSC induzida por IFN-y foi identificado por citometria de fluxo e a progressão do ciclo celular. Após o tratamento, as células foram coradas com iodeto de propídio e do ciclo celular analisada por citometria de fluxo em uma única população de células seleccionada (Figura S1A). A Figura 1 representa os valores médios da percentagem de distribuição de células em diferentes fases do ciclo celular nos grupos de tratamento mostradas nas Figuras S1B-E. Figuras S1B-E representam parcelas que mostram as mudanças nas fases do ciclo celular. Os valores médios e significância estatística em resposta a todos os tratamentos está resumida na Figura S1F e G. Análise dos dados de fluorescência em bruto mostrou um aumento na percentagem de stMSCs em fase S e G _{2 /H de fase, e uma percentagem reduzida de células em G 0 /L 1 fase em resposta a rmIFNγ em comparação com as células tratadas com veículo (Figura 1A). Para identificar o papel de Shh segregada como um mediador da proliferação induzida por IFNy stMSC o uso do anti-hedgehog neutralizante 5E1 anticorpo monoclonal que se liga ao ligando de Shh e interrompe a proteína de ligação ao receptor Ptch [1]. A resposta proliferativa das stMSCs para rmIFNγ foi significativamente inibida com tratamento com anticorpo 5E1 (Figura 1A). Quando comparado com os stMSCs, wtMSCs não transformadas responderam de forma semelhante em resposta a IFN-y sugerindo o aumento observado na proliferação não foi o resultado da transformação sozinho. IFNy induziu significativamente a percentagem de wtMSCs em fase S, uma resposta que foi bloqueado pelo anticorpo anti-Shh (Figura 1B). Colectivamente, a figura 1 demonstra que o IFN-y induz a proliferação de ambas as MSCs não transformadas e transformadas espontaneamente, uma resposta que é mediada por Shh segregada.}

silenciamento do gene Shh dentro derivadas da medula óssea stMSCs

Para exaustivamente estudar o papel da sinalização de Hedgehog na proliferação BM-MSC e recrutamento in vivo
, wtMSCs foram transfectadas a sobre-expresso Shh, enquanto stMSCs foram transduzidas com shRNAs lentivirais contra Shh. Foi utilizado um vector base lentiviral pLKO.1-puro expressar uma sequência hairpin curto contra a transcrição do gene Shh. linhas celulares de controle MSC foram estabelecidas usando wtMSC com expressão endógena de Shh e transfecção de stMSCs com a pLKO.1-puro base de lentiviral vector (stMSC ^{vect). Cinco clones de lentivírus, cada clone expressando uma sequência hairpin curto diferente, foram analisados ​​(stMSC ShhKO59-stMSC ShhKO63). Knockdown de Shh foi confirmada por análise de transferência de Western que apresentaram% knockdown da expressão da proteína Shh 100 em todos os clones em comparação com as células não transduzidas (wtMSCs) e Shh sobre-expressando linhas celulares (wtMSC Shh e stMSC vect) ( Figura S2A). Clone stMSC ShhKO59 foi utilizado para experiências posteriores e será referido como stMSC ShhKO. Expressão do plasmídeo pDsRed-Hyg-C1 expressando proteína fluorescente vermelha (RFP) foi confirmada por imunotransferência utilizando lisado de células recolhidas a partir stMSCs transduzidas (Figura S2a). Importante, wtMSCs estavelmente transfectada sobre-expressar a proteína Shh, expressa Shh em um nível semelhante ao dos stMSCs (Figura S2A).}

Para verificar knockdown de Shh em MSCs sem alterar a diferenciação das células, um padrão de expressão para os marcadores CD clássicos (CD29, CD106, CD105, CD44 e CD73) e SCA-1 utilizando citometria de fluxo foi realizada utilizando stMSC cultivadas ^{vect (Figura S2B) e stMSC células ShhKO (Figura S2C). Ambos stMSC stMSC células ShhKO vect e foram negativas para CD45 (Figura S3). Além disso, ambas as linhas celulares stMSC foram capazes de diferenciar para um fenótipo de adipócitos com base em Oil Red O coloração positiva das gotículas lipídicas produzidas (Figura S3). Colectivamente, estes dados sugerem que o knockdown da proteína Shh em stMSCs não alterou a diferenciação destas células.}

IFN-y induz a proliferação de wtMSCs e stMSCs em Medula Óssea

Para determinar o efeito de IFN-y em proliferação wtMSC e stMSC in vivo
, os ratos foram transplantados com wtMSC marcado-RFP, células ^{vect ou stMSC ShhKO wtMCS Shh, stMSC e tratada com rmIFNγ durante 21 dias. Após o tratamento de IFN-y, a medula óssea foi colhida e analisado para alterações no ciclo celular e o número de células RFP-positiva, por citometria de fluxo. IFNy induziu um aumento significativo no número de células positivas RFP dentro da medula óssea de todos os grupos experimentais com excepção para os animais transplantados com stMSC ShhKO células (Figura 2A, B). Imunofluorescência de medula óssea revelaram que houve um aumento significativo no número especificamente de proliferação de células positivas RFP em resposta a IFN-y como co-localizada por imunocoloração com BrdU (Figura 2C, D). Isto foi ainda apoiado pela Figura S4A, B e C mostra que a análise de dispersão de luz-representativo revelando uma população de stMSCs que foram positivas para RFP e perfazendo aproximadamente 0,1% de toda a população de células de medula óssea. células RFP-positivos foram fechado para a população de célula única (Figura S4C) e ciclo celular analisado. Células coletadas da medula óssea de ratos transplantados com stMSC vect células tratadas com rmIFNγ tinha uma porcentagem significativamente maior de células em fase S (55,5 ± 2,82%) em comparação com os ratinhos tratados com PBS (32,9 ± 5,14%, P Art < 0,05 em comparação com stMSC ratos vect transplantados tratados com PBS) (Figura S4F). A percentagem de células na fase S recolhidas a partir da medula óssea de murganhos transplantados com stMSC ShhKO tratada com rmIFNγ não foram significativamente diferentes (32,9 ± 2,64%) em comparação com os ratinhos tratados com PBS (38,4 ± 1,47%, P
> 0,05 em comparação com ratinhos stMSC ShhKO transplantados tratados com PBS) (Figura S4I). Figuras S4D, E, G e H representam parcelas que mostram as mudanças nas fases do ciclo celular. Assim, IFN-y induz a proliferação de ambos os wtMSCs e stMSCs in vivo
dentro da medula óssea, uma resposta que parece ser mediada pela sinalização Shh.}

In vivo
Recrutamento de wtMSCs e stMSCs à Mucosa gástrica em resposta a IFN-y

para identificar o papel da sinalização Hedgehog como mediador do recrutamento stMSC induzida por IFN-y ao epitélio gástrico, ratos transplantados com stMSC ^{vect e stMSC ShhKO células foram tratados com PBS ou IFN-y, durante 21 dias. Estômagos foram então recolhidos e recrutamento de stMSC marcado-RFP vect e células stMSC ShhKO analisados ​​por imuno-histoquímica (Figura 3). stMSC vect células foram recrutados para a mucosa gástrica de ratos injectados com IFNy (Figura 3C e D) em comparação com a ausência de stMSC marcaram-RFP vect células em estômagos de ratos injectados com PBS (Figura 3A, B ). stMSC ShhKO células transplantadas em ratinhos injectados com IFN-y não foram recrutados para a mucosa gástrica (Figura 3E, F). Expressão de stMSC marcaram-RFP vect células com IFNy tratamento foi confirmada por RT-PCR (Figura 3G). Para identificar se o recrutamento de MSC para a mucosa gástrica em resposta a IFN-y foi única para os stMSCs, a experiência foi repetida utilizando quer wtMSCs wtMSCs ou sobre-expressam Shh (wtMSC Shh). Embora ambos os células Shh wtMSC e wtMSC foram detectados nos estômagos dos ratinhos tratados com IFN-y, havia um número significativamente superior de wtMSC Shh e stMSC vect células dentro da mucosa gástrica quando comparada com a célula wtMSC transplantado grupo (Figura 3H). Colectivamente, estes dados sugerem que a sinalização do Shh é provavelmente para mediar o recrutamento de MSCs para a mucosa gástrica em resposta a IFN-y.}

Houve um aumento significativo no número de células que proliferam dentro da mucosa gástrica em resposta a IFNy tenha sido tratada com wtMSC ^{Shh e stMSC vect ratinhos transplantados em comparação com os ratos injectados com PBS (Figura 4A-D, a Figura S5A-F). No entanto, as MSC foram BrdU negativa (Figura 4B, C e A Figura S5A-D). Embora stMSC células ShhKO transplantadas em ratinhos injectados com IFN-y não foram recrutados para a mucosa gástrica, não houve diferença na proliferação epitelial entre tratamentos PBS e IFNy neste grupo experimental, o que sugere um aumento Shh MSC-derivado pode ser necessário para suportar este aumento da proliferação (figura 4D). Além disso, embora wtMSCs foram recrutados para a mucosa gástrica em resposta a IFN-y, não houve diferença na proliferação epitelial entre os tratamentos PBS e IFNy (Figura 4D). Estes dados sugerem que a sinalização dentro de Shh wtMSCs Shh e stMSCs em resposta a IFN-y induz a proliferação no epitélio gástrico. IFN-y sozinho, na ausência de stMSCs, não induz a proliferação da mucosa gástrica confirmando deste efeito não está relacionado com a inflamação sozinho.}

Para determinar se a diminuição da proliferação stMSC, após o recrutamento, foi associada com a adesão de células no interior da epitélio gástrico, os estômagos foram, em seguida, co-coradas para a e-caderina e RFP (Figura 4G-I). PBS-tratados ratinhos que foram transplantados com marcaram-RFP stMSC ^{vect células não mostrou recrutamento de células para a mucosa gástrica (Figura 4G). Consistente com a Figura 3, os murganhos que foram transplantados com marcaram-RFP stMSC vect células apresentaram acentuada do recrutamento de células da mucosa gástrica (Figura 4H), IFN-y-injectado. células stMSC VECT co-localizada com a E-caderina (Figura 4G, i) ao apoio que as células recrutadas RFP-marcado tinham em vós implantada dentro do epitélio gástrico.}

Hedgehog sinalização medeia a expressão de proteína de adesão focal em Response a SDF-1α quimiocinas

Nós escolhemos para investigar o eixo SDF-1α /sinalização CXCR4, tal como foi estabelecido que esta via de sinalização promove MSC recrutamento [23], [24].

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