PLoS One: Sonic Hedgehog közvetíti a proliferáció és felvételi transzformált mesenchymalis őssejtek a gyomor

absztrakt katalógusa

Tanulmányok a Helicobacter katalógusa-fertőzött egerek azt mutatják, hogy a csontvelő-eredetű mesenchymalis őssejtek (MSC) is benépesítik a gyomornyálkahártya és elősegíti a gyomor daganatos progresszió. Belül a tumor mikrokörnyezetében a gyomor, a pro-gyulladásos citokin interferon-gamma (IFNy) és a Sonic hedgehog (Shh) fokozott. IFNg szerepet játszik a tumor proliferációját aktiválásán keresztül a Shh jelátviteli út a különböző szövetekben hanem az, hogy egy hasonló mechanizmus létezik a gyomorban ismeretlen. Megvizsgáltuk a hipotézist, hogy az IFNy hajtja MSC proliferáció és felvételét által közvetített válasz Csitt jelátvitel. A jelenlegi tanulmány használ transzplantáció egy in vitro katalógusa transzformált mesenchymalis őssejt vonal (stMSC ^{VECT), hogy a túlzott kifejezi hedgehog jelátviteli, összehasonlítva a nem transzformált vad típusú MSC (wtMSCs), wtMSCs transzfektált túlzott express Csitt (wtMSC Csitt), és stMSCs traszdukcióra lentivirális tartalmazó konstrukciók shRNS célzó Csitt gén (stMSC ShhKO). A hatás az IFNy MSC proliferációs megítélése a sejtciklus analízis in vitro
felhasználásával kezelt sejtek rekombináns IFNy (rmIFNγ) önmagában, vagy kombinációban anti-Shh 5E1 ellenanyag, és a in vivo
használatával transzplantált egereken MSC kezelt PBS-ben vagy rmIFNγ. In vitro katalógusa IFNy jelentősen megnövekedett MSC proliferáció, a által közvetített válasz Csitt által blokkolt 5E1 antitest. Az MSC népesség összegyűjtött csontvelőjéből PBS vagy IFNy-kezelt egerekben kimutatták, hogy IFNg szignifikánsan növelte a százalékos összes MSC sejtvonalak S fázisban, kivéve az stMSCs ShhKO sejteket. Míg az MSC sejtvonalak ép Shh expresszió vettek fel a gyomor nyálkahártya válaszul IFNg, stMSCs ShhKO nem voltak. Hedgehog jelátviteli szükséges MSC proliferáció és toborzás a gyomorban, válaszul IFNg. Katalógusa}

Citation: Donnelly JM, Chawla A, Houghton J, Zavros Y (2013) Sonic Hedgehog közvetíti a proliferáció és felvételi transzformált mesenchymalis őssejtek a sejteket a gyomorba. PLoS ONE 8 (9): e75225. doi: 10,1371 /journal.pone.0075225 katalógusa

Szerkesztő: Jorge Sans Burns, University Hospital Modenai és Reggio Emilia, Olaszország katalógusa

Beérkezett: január 24, 2013; Elfogadva: augusztus 14, 2013; Megjelent: szeptember 19, 2013 katalógusa

Copyright: © 2013 Donelly és mtsai. Ez egy nyílt hozzáférésű cikk feltételei szerint terjeszthető a Creative Commons Nevezd meg! Licenc, amely engedélyezi a korlátlan használatát, a forgalmazás és a reprodukció bármilyen adathordozón, feltéve, hogy az eredeti szerző és a forrás jóváírásra. Katalógusa

Forrás: Ez a munka támogatta az American Cancer Society Research Scholar Award 119072-RSG-10-167-01-MPC (Y. Zavros), Albert J. Ryan Foundation Fellowship (J. Donnelly), részben az emésztésre Health Center Cincinnati Gyermek Medical Health Center (DHC: pad a Éjjeli Research in Pediatric emésztésre Disease) CHTF /SUB DK078392. A szerzők szeretnék elismerni a támogatást Monica Delay vezetője a kutatás áramlási citometria Core Osztályának reumatológia Cincinnati Gyermekkórház Medical Center, részben támogatta a National Institutes of Health (NIH) AR-47363. Minden áramlási citometriai adatot beszerzett berendezés használatával által fenntartott kutatási áramlási citometria Core Osztályának reumatológia Cincinnati Gyermekkórház Medical Center, részben támogatta NIH AR-47363. A finanszírozók nem volt szerepe a tanulmány tervezés, adatgyűjtés és elemzés, döntés, hogy közzéteszi, vagy a készítmény a kézirat. Katalógusa

Érdekütközés: A szerzők kijelentették, hogy nem ellentétes érdekek léteznek. Katalógusa

Bevezető

van egy világosan meghatározott szerepet Sonic Hedgehog (Csitt) jelzést a rák kialakulásában [1], [2], [3]. Sejtnövekedés emésztőrendszerben tumorok, amelyek magukban foglalják a nyelőcső, a gyomor, epeúti és a hasnyálmirigy szabályozzák endogén expressziója Hedgehog ligandumok, mint például Shh [1]. Kötődése Hedgehog ligandum receptorához való, Folt (PTCH) eltávolítását eredményezi a gátlása PTCH a smoothened (SMO). Ez az eltávolítás a gátlás SMO eredményezi az aktiválás a Gli-család Hedgehog transzkripciós faktorok, és ezt követően a daganat növekedését, hogy lehet blokkolta Hedgehog semlegesítő antitest [1]. Bár a szövetség között Pszt és a gyomorrák világos, funkcionális szerepének Pszt a kialakulásában és progressziójában gyomorrák nagyrészt ismeretlen. Továbbá, a mechanizmus, amely szabályozza a termelés Shh belül a tumor mikrokörnyezetében még meg kell határozni.

Helicobacter pylori (H. pylori) katalógusa bakteriális kolonizáció okoz, krónikus gyulladás, hogy következetesen társított progresszió gyomorrák [4]. A leggyakoribb és káros immunválaszt magában foglalja a Th1 proinflammatorikus citokinek, leginkább IFNy a T-sejtek és IL-1β és TNFa származó szövet vagy betörő makrofágok [5], [6], [7], [8], [ ,,,0],9]. Valóban, a pro-gyulladásos citokin IFNy kimutatták, hogy hozzájárulnak a patogenezisében és fejlődését a gyomor metaplázia [5], [9], [10] és a rák [10]. Gyulladás okozta rákos, a Hedgehog jelátviteli útvonal közvetít IFNg-indukált daganat kialakulásában [11], [12], [13]. Különösen Csitt egy IFNg cél gén Hedgehog jelátviteli közvetítő IFNy-indukált proliferációját [12]. Katalógusa

alatt Helicobacter katalógusa fertőzés, krónikus gyulladás egybeesik a felvételi csontvelői mezenchymális őssejtek (BM-MSC-k) [14], [15]. A krónikusan gyulladt gyomor BM-MSC toborozza a csontvelő a gyomor és differenciálódnak rákkal összefüggő fibroblasztok (CAF), amelyek jelentős szerepet irányításában rák kialakulásában [14]. Bár egyértelműen játszik a fejlesztés a gyomorrák, a mechanizmus szabályozza a proliferáció és felvétele malignusan transzformált BM-MSC-k, hogy a gyomor alatt krónikus gyulladás nagyrészt ismeretlen. Érdekes, Shh tűnik indukál proliferációját és differenciálódását BM-MSC-k [16]. Pszt is elismerte, hogy potenciális kemoattraktáns csontvelő eredetű sejtek, ha fokozódik a krónikus gyulladásra válaszul [17], [18]. Katalógusa

Ennek alapján a szövetség között IFNg és Csitt, azt feltételezzük, hogy az IFNy indukálja Csitt jelző belül MSC megkönnyíti a sejtek migrációját a gyomorba. Ezen hipotézis, a jelenlegi tanulmány összehasonlítja in vivo katalógusa BM-MSC felvételi gyomornyálkahártya válaszul IFNg egy spontán átalakult mesenchymalis őssejt vonal (stMSC) összehasonlítva a nem transzformált BM-MSC-k. A kultúra BM-MSC-k hajlamosak a mutáció az öregedés és kiállítóterem klinikailag releváns mutáció a p53 gén [19]. A hosszú távú kultúra BM-MSC-k "spontán transzformáció" (stMSCs) szaporítható in vitro hosszabb ideig, és akiknél a rák elősegítő fenotípus [19]. A jelenlegi tanulmány egyaránt használ stMSCs és transzformált BM-MSC (wtMSCs), hogy a túlzott kifejezi Hedgehog jelátviteli. A wtMSC és stMSC sejtvonalak mindkét in vivo katalógusa és in vitro katalógusa azt bizonyítjuk, hogy IFNg-indukált proliferációját és toborzása MSC sejtvonalak a gyomor egy válasz, hogy közvetítik Csitt kiválasztás és jelzéseket. katalógusa

anyagok és módszerek katalógusa

Állatok katalógusa

C57BL /6 (törzs�664), és IRG (törzs705) egereket használják ezeket a vizsgálatokat vásároltunk a Jackson Laboratories. Minden egér tanulmányok hagyta jóvá a University of Cincinnati Institutional Animál Care and Use Committee (IACUC), amely fenntartja az American Association of Értékelési és Akkreditációs Laboratóriumi Animal Care (AAALAC) áll rendelkezésre. Katalógusa

csontvelőből származó Spontán transzformált mesenchymalis őssejtek (stMSC) és a nem-transzformált BM-MSC-k (wtMSC) Kultúra és kezelések

A wtMSC sejtvonalakat hoztunk létre egész csontvelőjéből IRG egerek és tenyésztjük, hogy áthaladás 5 a transzfekció előtt a későbbi karbantartást alacsony átjáró számát (< P10) előtt kísérleti felhasználásra. Egész csontvelő átöblítjük a combcsont és a sípcsont az egerek a későbbi kultúra és áthaladását a műanyaghoz tapadó MSC populációban [20]. Spontán transzformált csontvelő-eredetű mesenchymalis őssejtek (stMSCs) transzfektált pDsRed-Hyg-C1 plazmid expresszáló vörös fluoreszcens fehérje alkalmaztunk [21]. Minden sejteket használva HyCIone DMEM táptalajon kiegészített 10-15% magzati borjúszérumot és 1% penicillin-sztreptomicin normál körülmények között. MSC tenyésztjük kezelés arra szélesztettünk 6 lyukú lemezekre, és hagyjuk növekedni, hogy 70-80% -os összefolyás normál média majd a szérumot egy éjszakán át. Miután kultúra bővítése, a Mouse multipotens mesenchymalis stromasejtes Marker Antibody Panel-t alkalmaztuk az MSC sejtvonalak Sca-1, CD106, CD105, CD73, CD29, CD44 és a hematopoietikus markerek CD45 és CD11b (R &D Systems, SC018). A sejteket koncentrációban szuszpendáltuk 1 × 10 ^{6 sejt /ml, és megfestettük a gyártó utasításai szerint. A sejteket ezután inkubáljuk AlexaFluor 488 egy 1:100 hígításban 30 percen át 4 ° C-on. Fixation végeztük 15 percig szobahőmérsékleten egy kereskedelemben kapható reagens (Invitrogen GAS001S5). A fluoreszcencia intenzitását mértük áramlási citometriával a BD FACSCalibur és CellQuestPro szoftver. wtMSCs és stMSCs kezeltek vivőanyaggal, a rekombináns egér interferon-gamma (rmIFNγ, 100 nM, R &D Systems), vagy anti-Shh antitest 5E1 (előkezelt 6 órán át), valamint rmIFNγ 24 órán át. A kezelt sejteket azután elemezzük a változásokat a sejtciklus áramlási citometriával. Katalógusa}

Sonic Hedgehog (Csitt) kiütése által lentivírus közvetített rövid hajtű-(shRNS) segítségével stMSCs katalógusa

RFP-címkézett stMSCs voltak transzdukált öt különböző MISSION lentivirális jelátviteli részecske tartalmazó klónok eltérő szekvenciákat shRNS az Csitt és pLKO.1-Puro alkatrész átadó puromicin (Sigma Aldrich). RFP-tagged stMSCs inkubáltuk lentivirális részecskék ExpressMag mágneses gyöngyökkel (Sigma Aldrich), egy mágnes (Oz Biosciences Super mágneses lemezen, MF10000) 15 percig, a sejteket eltávolítjuk a mágnes, inkubáljuk további 16 órán át, majd alá helyeztük puromicin szelekció (DMEM tenyésztő táptalajok, amely 10% magzati borjúszérumot, 1% penicillin /sztreptomicint, 10 ng /ml puromicin) a 7 és 10 nap. Az effektív puromicin szükséges dózis kiküszöböli a nem-transzdukált sejtek határoztuk korábban keresztül egy puromicin pusztítási görbéjét, hogy a vizsgált koncentrációk 0-50 ng /ml (az adatokat nem mutatjuk be). Transzdukált sejtek jelöli egy egyedi klón azonosító száma sejtvonalakon transzdukált shRNS az Csitt (stMSC ^{ShhKO) számozott 59-63. Egy pLKO.1-Puro vektor transzdukált RFP-MSC sejtvonal (stMSC VECT) szolgált kontrollként a endogén szintjének Shh génexpressziót. Western-blot analízist alkalmaztunk annak igazolására, Shh knockdown és RFP expresszió.}

transzfektálása wtMSCs Over-Express Shh

A plazmidot (OriGene CW101340) egyesítjük a OriGene Turbofectin reagens arány mellett 0 :1, 01:01, 02:01, 03:01 és 04:01, és inkubáltuk 15 percen át szobahőmérsékleten keverjük. A transzfekciós reagens adunk hozzá cseppenként wtMSCs 70% összefolyás, és hagytuk inkubálódni 24 órán át, mielőtt a sejteket alá szelekciós normál média puromicin. Az effektív puromicin szükséges dózis kiküszöböli a nem-transzfektált sejtek határoztuk korábban keresztül egy puromicin pusztítási görbéjét vizsgálati koncentrációk 0-10 ng /ml (az adatokat nem mutatjuk be). A legalacsonyabb koncentráció, amely megölte az összes transzfektált sejteket 3-4 nappal a kezelés után jött létre, mint 2 mg /ml. Katalógusa

In vivo stMSC Toborzás és proliferáció katalógusa

C57BL /6 egereket ültettünk 1 × 10 ^{6 wtMSCs, wtMSCs Csitt, stMSCs VECT vagy stMSCs ShhKO farokvénába. Három nappal a transzplantáció után, az egereket hordozóval (steril PBS-sel, i.p.) vagy rmIFNγ (1 ng /nap, ip) 7, vagy 21 nap. Egereket injektálunk 200 ul BrdU címkézés készlet reagens (5-bróm-2'-dezoxi-uridin-jelölő és detektáló kit II, Roche Diagnostics, ip) 24 órával az analízis előtt, és a gyomor szakaszok rögzített 4% paraformaldehidben, paraffinba ágyazott és 3 nmol szakaszok készült immunhisztokémiai és immunfluoreszcens elemzéseket. Egész csontvelő is izoláltuk combcsontjából ugyanazon egerek PBS-sel kipirulás. A vörösvérsejteket lizáltuk alkalmazásával vörösvérsejt lízis pufferben (4,14 g NH _{4Cl, 0,5 g KHCO 3, 0,5 M EDTA-t tartalmazó 500 ml-es, pH = 7.2-7,4). Körülbelül 11 × 10 6 sejteket fixáltuk és permeabilizáltuk segítségével Caltag Laboratories áramlási citometria szerinti készlet, a gyártó protokollja (Invitrogen, GAS-004), és megfestjük az anti-RFP FITC-konjugált antitestet (1:100, ABCAM, ab34764 ), majd megfestjük Vybrant DyeCycle Ruby folt (Invitrogen) alkalmazásával a gyártó protokollja. Fluoreszcencia alkalmazásával analizáltuk a BD LSRII Áramlási citométer rendszerrel. Ahhoz, hogy elemezni kifejezetten az RFP-MSC-k, kapuzási használtunk, hogy elemezze a sejtciklus csak a FITC pozitív sejteket. Peak fluoreszcencia analizáltuk ModFitLT szoftver határozza meg a százalékos a népesség minden szakaszában a sejtciklust.}}

áramlási citometriával és cell cycle analysis

A sejteket szérum-éheztetett 16 órával az elemzés . A sejteket rögzítettük jéghideg 70% etanol /PBS-ben 15 percen át -20 ° C-on, mossuk, majd propidium-jodiddal festettük 45 percig. A mért értékek a csúcs fluoreszcencia per sejtek teljes száma használva kaptuk a program CellQuest Pro (Becton Dickson). A sejtek százalékát a lakosság minden fázisában a sejtciklus számoltuk a csúcs fluoreszcencia méréseket keresztül analízis ModFit LT szoftver. Áramlási citometria használatával FACSCalibur ™ rendszer (Becton Dickson) végeztünk minden transzdukált sejtek az egér segítségével multipotens mesenchymális őssejtek sejt-marker antitest szerinti burkolólap, a gyártó protokollja (R &D Systems, SC018).

Immunprecipitáció és Western blot analízis

a sejtlizátumokat készítettünk M-PER emlős fehérje Extraction Reagent (Thermo Scientific, IL) kiegészített proteáz inhibitorokkal (Roche) alkalmazásával a gyártó protokollja szerint. Media mintát sejteket koncentrált, 15 ml-con Ultra centrifugális szűrőeszközök (Millipore). Sejtlizátumokat (100 ng összes fehérje) és a média immunprecipitáltuk anti-Shh 5E1 antitest (2 ug), 4 ° C-on 16 órán át keverjük. Protein A /G agaróz gyöngyöket (20 ul, Santa Cruz Biotechnoiogy, CA) adunk hozzá, és a mintákat inkubáltuk 4 ° C-on 16 órán át keverjük. Miután a 16 órás inkubálás immunoprecipitátumokban 3-szor mostuk PBS-sel, és újra szuszpendáljuk 40 pl Laemmli töltőpufferrel tartalmazó β-merkapto-etanol (Bio-Rad Laboratories, CA), felrakodás előtt 4-20% -os Tris-glicin Gradiens géleken. A géleket futni 80 V, 3,5 óra, fehérje nitrocellulóz membránokra visszük át, 105 V, 1-2 óra, majd blokkoltuk 1 órán át szobahőmérsékleten alkalmazásával KPL Detektor Block (Kirkegaard &Perry Laboratories, Inc.). A membránokat egy éjszakán át inkubáltuk 4 ° C-on 1:200 hígításával Shh ellenanyag (N-19, Santa Cruz), majd 1 órás inkubálás 1:100 hígítású AlexaFluor anti-kecske 680 (Invitrogen). Blotokat leképezett egy pásztázó denzitométerrel együtt elemző szoftver (Odyssey infravörös képalkotó szoftver rendszer). Katalógusa

RNS izolálás és RT-PCR katalógusa

A teljes RNS-t izoláltunk gyomor szöveti Trizol reagens szerint gyártó protokollja (TriReagent Molecular Research Center, Inc.). A nagy kapacitású cDNS reverz transzkripciós Kit (Applied Biosystems) alkalmaztunk a cDNS-szintézis RNS követő ajánlott protokollt. Minden egyes minta esetében, 60 ng RNS-t reverz transzkripcióval így körülbelül 2 ug teljes cDNS hogy ezután használt RT-PCR-rel. RFP primer szekvenciákat a következők voltak: ELŐRE -5 "CCC CGT AAT GCA GAA GAA GA 3 ', fordított -5' CTT GGC CAT GTA GGT GGT CT-3 '. PCR amplifikáció végeztünk összesen 20 pl térfogatban, tartalmazó puffer, 20 mM forward és reverz primert, Taq polimeráz, RNáz-mentes vízben és cDNS sablont. Az egyes PCR-amplifikációt végeztünk párhuzamos mérőhellyel egy GeneAmp PCR System 9700 thermocycler (Applied Biosystems), a következő körülmények között: 94 ° C 3 perc, 94 ° C-on 30 másodperc, 60 ° C-on 1 percig és 72 ° C-on 1 perc 35 cikluson keresztül. A PCR-termékeket tettük láthatóvá egy 1,5% -os agaróz TAE gélen.

Immunhisztokémia

Egereket injektálunk 200 ul BrdU címkézés készlet reagens (5-bróm-2'-dezoxi-uridin-jelölő és detektáló Kit II, Roche Diagnostics) 24 órán át analízis előtt. Gyomor szöveteket fixáltuk Carnoy fixálóban (60 ml etanol, 30 ml kloroform, 10 ml ecetsavban) 16 órán át, paraffinba ágyazott és 4 jim-es metszeteket készítettünk. Miután deparaffinization, antigén-visszanyerés végeztük melegítésével a lemezeket 10 percen át 100 ° C-on 0,01 M nátrium-citrát-puffer (antigén Lelepleződése Solution, Vector Laboratories, Burlingame, CA). Az endogén peroxidáz aktivitást ezután blokkolta inkubáljuk tárgylemezeket 3% -os hidrogén-peroxid /etanol további 20 percig. A metszeteket azután blokkoltuk 5% BSA /Tris pufferolt sóoldat /0,1% Tween 80 (TBS-T) és inkubáljuk 1:20 hígítású anti-BrdU antitesttel (5-bróm-2'-dezoxi-uridin-jelölő és detektáló készlet II, Roche Diagnostics) 37 ° C-on 30 percig. BrdU szín kifejlődését szerint végeztük a gyártó utasításai szerint. A metszeteket azután blokkoljuk 20% -os normál kecske szérummal 20 percig, és inkubáltuk egy 1:400 hígítás biotin-konjugált anti-RFP-antitest (ABCAM, ab34771), 16 órán át 4 ° C hőmérsékleten, majd 1:500 hígításával anti- nyúl IgG-on 30 percig, majd láthatóvá avidin-biotin-komplexek a Vectastain Elite ABC Kit felhasználásával diaminobenzidin (DAB), mint a hordozó (Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA). A metszeteket szerelt alkalmazásával Permount.

adipocita indukció, stMSCs kezeltük HyCIone DMEM containing10 ^{-8 M dexametazon (Sigma, D4902) és 5 ug /ml inzulinnal (Sigma, I6634). Minden sejteket fixáltuk anyagként 4% -os paraformaldehiddel 20 percig szobahőmérsékleten. Annak észlelésére differenciálódás, Oil Red O festéssel végeztük hozzáadásával 3,75% Oil Red O oldatot, inkubáljuk 5 percen keresztül szobahőmérsékleten, majd mosás előtt vízben szereléshez csúszdák segítségével Vectashield HardSet beágyazó közeg. A képeket nézve, és elfoglalták fénymikroszkóp alatt egy Olympus BX60 a Diagnostic Instruments "Spot" Camera. Katalógusa}

Immunfluoreszcenciás katalógusa

stMSC ^{VECT és stMSC ShhKO sejteket fedőlemezen amíg 70-80% -os összefolyásig, fixáltuk 4% paraformaldehiddel 30 percen át szobahőmérsékleten keverjük, permeabilizált PBS-sel, amely 0,5% Triton X-100 és blokkoltuk 2% szamár szérum 1 órán át szobahőmérsékleten keverjük. A sejteket ezután vagy egy 1:50 hígítású anti-CD44 (ABCAM ab65829), vagy egy 1:100 hígítású anti-CD45 (ABCAM ab10558) antitesttel egy éjszakán át 4 ° C hőmérsékleten. Alexa Fluor szamár anti-nyúl 488 használtunk szekunder antitestet 1:1000 hígítás 1 órán át szobahőmérsékleten keverjük. A sejteket ezután ellenfestettük egy 1:2000 hígítás a nukleáris folt TO-PRO-3-jodidot (Invitrogen, T3605) 20 percen át szobahőmérsékleten, mielőtt szerelési használata Vectashield HardSet beágyazó közeg. Nyúl IgG-t használtak 1:25 hígítás negatív kontrollként azonos körülmények között.}

Gyomor szakaszok gyűjtött PBS-ben vagy IFNy kezelt egereket blokkoltuk 20% -os normál kecske szérummal, és inkubáltuk 1:400 anti- RFP antitest (ABCAM, ab34771), 16 órán át 4 ° C hőmérsékleten, majd 1:100 antinyúl Alexa Fluor 488 (Invitrogen) szekunder antitest további 1 órán át. Lemezeket ezután ellenfestettük anti-E-kadherin (BD Transduction Labs, 610.181) antitesttel egy 1:200 hígítás 1 órán át szobahőmérsékleten, majd 1:100 antiegér Alexa Fluor 633 (Invitrogen) másodlagos antitesttel. Minden mintát szerelt segítségével Vectashield Hardset fedőoldattal (VectaLabs). Kép alkalmazásával kaptuk egy Zeiss LSM510 META konfokális mikroszkóppal.

Kemotaxis vizsgálat

A kemotaxis assay-t alapul megállapított protokollokkal [22]. Transzdukált stMSCs vittük 24 lyukú transwell lemezek tartalmazó PET membránok 8 um pórusokat (BD Falcon). 2.5 × 10 ^{4 sejteket szélesztettünk az apikális (felső) kamra DMEM közegben, amely 0,1% BSA-ban. SDF-1α (rmSDF-1α, R &D Systems) adtunk a bazolaterális (alsó) kamra koncentrációkban 0-150 ng /ml. A sejteket 6 órán át 37 ° C-on. Miután a migráció, a sejteket fixáltuk 4% paraformaldehiddel 30 percig, majd megfestettük alkalmazásával 10 perc alatt egy Wright-Giemsa festéssel. Maradt sejtek a tetején a membrán eltávolítottuk egy pamut végű applikátor és a maradék sejteket megszámoltuk 5 mező 40 × nagyítással. A több vándorló sejtek kiszámítani az átlagos száma a migráló sejtek minden jól átlagos száma a migráló sejtek a kontroll is. Katalógusa}

Statisztikai elemzés katalógusa

Eredmények elemeztük vagy egy hallgató páratlan t-próbával vagy ANOVA kereskedelmi forgalomban kapható szoftvert (GraphPad Prism GraphPad Software, San Diego, CA). A P katalógusa érték < 0,05 értéket tekintettük szignifikánsnak. Katalógusa

Eredmények katalógusa

IFNg-indukált stMSC proliferáció által közvetített Csitt szekréciója és jelző katalógusa

A szerepe Hedgehog jeladás, mint a közvetítő IFNy-indukált stMSC és wtMSC proliferációt azonosítottuk áramlási citometriával és a sejtciklus progressziójában. A kezelés után a sejteket propidium-jodiddal festettük és a sejtciklus áramlási citometriával elemezzük egy kiválasztott egyetlen sejt populáció (ábra S1A). Az 1. ábra az átlagos értékeit sejt elosztási százalék különböző sejtciklus fázisok a kezelési csoportok ábrákon látható S1B-E. Ábrák S1B-E képviseli parcellákon mutatja a változásokat a sejtciklus fázisban. Az átlagos értékeket és a statisztikai szignifikancia válaszként összes kezelés ábra foglalja össze S1F és G. Elemzés a nyers fluoreszcencia adatok azt mutatták, megnövekedett százalékú stMSCs S-fázisban, és G _{2 /M fázisban, és csökkent sejtek százalékát G 0 /G 1 fázis válaszul rmIFNγ összehasonlítva a vivőanyaggal kezelt sejtek (1a ábra). Azonosításához a szerepe a szekretált Shh mediátorként IFNy-indukált stMSC proliferációs használtuk az anti-Hedgehog semlegesítő 5E1 monoklonális antitest, amely kötődik Shh ligandum és megbontja kötődése a receptorhoz PTCH [1]. A proliferatív válasza stMSCs hogy rmIFNγ szignifikánsan gátolta a 5E1 antitesttel végzett kezelés (1a ábra). Ha összehasonlítjuk a stMSCs, nem transzformált wtMSCs reagáltak hasonlóan válaszul IFNg ami arra utal, a megfigyelt növekedése proliferáció nem volt transzformáció eredményeként egyedül. IFNg jelentősen indukált a százalékos wtMSCs S fázisban, egy válasz által blokkolt anti-Shh antitest (1B ábra). Együttesen 1. ábra azt mutatja, hogy IFNg indukálja elterjedése mind a nem transzformált és spontán átalakult MSC, a válaszban közvetítik kiválasztódó Pszt. Katalógusa}

elhallgattatása a Csitt Gene belül csontvelőből származó stMSCs katalógusa

Hogy átfogóan szerepének vizsgálata Hedgehog jelátviteli BM-MSC proliferáció és felvételi in vivo katalógusa, wtMSCs transzfektáltuk túlzott express Csitt míg stMSCs voltak transzdukált lentivirális shRNS ellen Pszt. A pLKO.1-Puro bázis lentivirális vektor kifejező rövid hajtű szekvencia, az átirat az Csitt-t használtuk. Ellenőrző MSC sejtvonalak használatával létesített wtMSC endogén expressziója Shh és transzfekciója stMSCs a pLKO.1-Puro bázis lentivirális vektorba (stMSC ^{VECT). Öt Lentivirális klónok, mindegyik klón kifejező különböző rövid hajtű szekvencia, elemeztük (stMSC ShhKO59-stMSC ShhKO63). Kiütése Shh igazoltuk Western-blot analízis azt mutatta, 100% kiütése Shh protein expresszió az összes klón, mint a untransduced sejtek (wtMSCs) és Shh túl-expresszáló sejtvonal (wtMSC Shh és stMSC VECT) ( ábra S2A). Clone stMSC ShhKO59 használtuk a későbbi kísérletek és nevezik stMSC ShhKO. Expression of pDsRed-Hyg-C1 plazmid expresszáló vörös fluoreszcens fehérje (RFP) igazoltuk immunoblot segítségével sejtlizátumot gyűjtött transzdukált stMSCs (ábra S2A). Fontos megjegyezni, hogy wtMSCs stabilan transzfektált túlzott express Csitt fehérje kifejezett Csitt hasonló szinten a stMSCs (ábra S2A). Katalógusa}

Annak ellenőrzésére kiütése Csitt az MSC megváltoztatása nélkül a sejtek differenciálódása, az expressziós mintázata a klasszikus CD markerek (CD29, CD106, CD105, CD44 és CD73) és Sca-1 átfolyásos citometria segítségével végeztük tenyésztett stMSC ^{VECT (ábra S2B) és stMSC ShhKO (ábra S2C) sejtek. Mindkét stMSC VECT és stMSC ShhKO sejtek negatívak voltak a CD45 (S3 kép). Emellett mindkét stMSC sejtvonalak képesek voltak különbséget egy adipocita fenotípus alapján pozitív Oil Red O festéssel lipidcseppecskék előállított (ábra S3). Együttesen ezek az adatok arra utalnak, hogy kiütése Shh protein stMSCs nem változott a differenciálódását ezen sejtek.}

IFNg Előidéz proliferációja wtMSCs és stMSCs csontvelőben

Annak megállapításához, a hatás az IFNy a wtMSC és stMSC proliferáció in vivo katalógusa, egerekbe transzplantáltunk RFP-címkézett wtMSC, wtMCS ^{Shh, stMSC VECT vagy stMSC ShhKO sejtek és kezeltük rmIFNγ 21 napig. Miután IFNy kezelés, csontvelő összegyűjtöttük és analizáltuk változások sejtciklus és száma RFP-pozitív sejtek áramlási citometriával. IFNg indukált jelentős növekedése száma RFP pozitív sejtek a csontvelőben, valamennyi kísérleti csoport, kivéve azokat az állatokat transzplantált stMSC ShhKO sejtek (2A ábra, B). Immunfluoreszcens csontvelő kiderült, hogy nem volt jelentős növekedés kifejezetten számának proliferáló RFP pozitív sejtek válasz IFNy mint társ-lokalizálható BrdU immunfestéssel (2C ábra, D). Ezt alátámasztja továbbá az ábrán S4A, B és C, amely azt mutatja reprezentatív fény-szórás elemzés felfedve egy populációját stMSCs hogy volt pozitív RFP és tartalmazott körülbelül 0,1% -a a teljes csontvelő sejt populációban. RFP-pozitív sejteket kapuzott az egyetlen sejt populáció (ábra S4C) és a sejtciklus elemezzük. A sejteket összegyűjtöttük a csontvelőből a transzplantált egereken stMSC VECT kezelt sejtek rmIFNγ volt lényegesen nagyobb százaléka a sejtek az S-fázisban (55,5 ± 2,82%), mint azok az egerek kezelt PBS-sel (32,9 ± 5,14%, p
< 0,05 képest stMSC VECT transzplantált kezelt egerek PBS-ben) (ábra S4F). A sejtek százalékát S-fázisban gyűjtött a csontvelő egerek transzplantált stMSC ShhKO kezelt rmIFNγ nem volt jelentősen különböző (32,9 ± 2,64%), mint azok az egerek kezelt PBS-sel (38,4 ± 1,47%, P
&0,05 képest stMSC ShhKO transzplantált kezelt egerek PBS-ben) (ábra S4i). Ábrák S4D, E, G és H jelentése parcellákon mutatja a változásokat a sejtciklus fázisban. Így IFNg indukálja elterjedése mind wtMSCs és stMSCs in vivo katalógusa a csontvelőben, a válasz úgy tűnik, hogy közvetítik Csitt jelátvitel. Katalógusa}

In vivo katalógusa felvétele wtMSCs és stMSCs a gyomornyálkahártya válasz IFNg katalógusa

azonosítása szerepének Hedgehog jelátviteli mint közvetítő IFNy-indukált stMSC toborzás a gyomornyálkahártya, transzplantált egerekben stMSC ^{VECT és stMSC ShhKO sejteket kezeltünk PBS-ben vagy IFNg 21 napig. Gyomor szedtünk és toborzása RFP-jelölt stMSC VECT és stMSC ShhKO elemzett sejtek immunhisztokémiai módszerrel (3. ábra). stMSC VECT sejteket toborzott a gyomornyálkahártya egerek fecskendeznek IFNg (3C, ábra, D), mint a hiánya RFP-címkézett stMSC VECT sejtek a gyomor PBS injekciózott egerekben (3A, B ). stMSC ShhKO beültetett sejtek injektált egerekben IFNg nem toborzott a gyomor nyálkahártya (ábra 3E, F). Expression of RFP-címkézett stMSC VECT sejtek IFNy kezelés igazoltuk RT-PCR (ábra 3G). Lehet azonosítani, hogy felvételét MSC-k a gyomor nyálkahártya válaszul IFNg egyedi volt a stMSCs, a kísérletet megismételtük segítségével akár wtMSCs vagy wtMSCs túl-expresszáló Shh (wtMSC Shh). Bár mind wtMSC és wtMSC Shh sejtet találtak a gyomor IFNy-kezelt egerekben, szignifikánsan magasabb számú wtMSC Shh és stMSC VECT sejtek a gyomor nyálkahártyáját, ha összehasonlítjuk a wtMSC sejt átültetett csoport (ábra 3H). Együttesen ezek az adatok arra utalnak, hogy az Shh jelátviteli valószínűleg, hogy közvetítsen a felvételi MSC a gyomornyálkahártya válaszul IFNg.}

szignifikáns számának növekedése a szaporodó sejtek a gyomornyálkahártya válaszul IFNg -gyel kezelt wtMSC ^{Shh és stMSC VECT transzplantált egerekben, mint a PBS-injekciózott egerekben (4a ábra-D, ábrán S5A-F). Azonban MSC-k voltak BrdU negatív (4B ábra, C és ábra S5A-D). Bár stMSC ShhKO beültetett sejtek injektált egerekben IFNg nem toborzott a gyomor nyálkahártya, nem volt különbség a epithelialis proliferáció közötti PBS-sel és IFNy-kezelést ebben a kísérleti csoportban, ami arra utal, fokozott MSC-eredetű Shh lehet szükség, hogy támogassa ezt a fokozott proliferáció (ábra 4D). Ezen kívül, bár wtMSCs vettek fel a gyomor nyálkahártya válaszul IFNg, nem volt különbség a epithelialis proliferáció közötti PBS-ben és IFNy kezelés (ábra 4d). Ezek az adatok arra utalnak, hogy Csitt jelátviteli belül wtMSCs Csitt és stMSCs válaszul IFNg indukálja elterjedése a gyomornyálkahártya. IFNg egyedül hiányában stMSCs, nem proliferációt a gyomornyálkahártya megerősíti ezt a hatást nem kapcsolódik a gyulladás egyedül. Katalógusa}

Annak megállapításához, hogy a csökkent stMSC proliferáció felvétel utáni társult sejt adhéziós belül gyomornyálkahártya, gyomrukat majd közösen festettük E-cadherin és RFP (ábra 4G-I). PBS-sel kezelt egereknél transzplantált RFP-címkézett stMSC ^{VECT sejtek nem mutattak felvételét sejteket a gyomor nyálkahártya (ábra 4G). Összhangban a 3. ábra, IFNy-injektált egerek transzplantáltunk RFP-címkézett stMSC VECT sejtek mutattak jelentős felvételét sejteket a gyomor nyálkahártya (ábra 4H). RFP-címkézett stMSC Vect sejtek ko-lokalizált E-cadherin (ábra 4G, I) támogatja, hogy felvett sejtek graftolódtak a gyomornyálkahártya. Katalógusa}

Hedgehog Signaling expresszióját közvetítő fokális adhéziós fehérje érzékelésével SDF-1α kemokin katalógusa

Azért választottuk, hogy vizsgálja meg az SDF-1α /CXCR4 jelző tengelyen azt állapították meg, hogy ez a jelátviteli elősegíti MSC felvételi [23], [24].

• PLoS One: Váratlan Fejetlen és farkatlan Hal a gyomor tartalma lándzsafogú cápa Isurus oxyrinchus
• PLoS One: rovarevő denevérek Digest kitin a gyomor savas emlős Chitinase