PLoS ONE: Sonic Hedgehog formidler spredning og rekruttering av transform stamceller til magen

Abstract

Studier med Helicobacter
-infected mus viser at benmargavledede mesenchymale stamceller (MSC) kan fylle den på mage epitel og fremme magekreft progresjon. Innenfor tumor mikromiljøet av magen, er pro-inflammatorisk cytokin interferon-gamma (IFNy) og Sonic hedgehog (Hysj) forhøyet. IFNy er involvert i tumor spredning via aktivering av den Shh signalveien i forskjellige vev, men hvorvidt en lignende mekanisme eksisterer i magen er ukjent. Vi testet hypotesen om at IFNy driver MSC spredning og rekruttering, en respons mediert av Shh signalering. Den aktuelle studien bruker transplantasjon av en in vitro
forvandlet mesenchymale stamceller linje (stMSC ^{Vect), som over-uttrykker pinnsvin signalering, sammenlignet med ikke-transformvilltype MSC (wtMSCs), wtMSCs transfektert til over-express Shh (wtMSC Shh), og stMSCs transduced med lentiviral konstruksjoner som inneholder shRNA rettet mot Shh genet (stMSC ShhKO). Effekten av IFNy på MSC-proliferasjon ble bedømt ved cellesyklusanalyse in vitro
ved hjelp av celler ble behandlet med rekombinant IFNy (rmIFNγ) alene, eller i kombinasjon med anti-Shh 5E1-antistoff, og in vivo
ved hjelp av mus transplantert med MSC behandlet med PBS eller rmIFNγ. In vitro
, IFNy betydelig økt MSC spredning, en respons mediert av Shh som ble blokkert av 5E1 antistoff. MSC populasjon oppsamlet fra benmarg fra PBS eller IFNy-behandlede mus viste at IFNy betydelig økt prosentandel av alle MSC cellelinjer i S-fasen, med unntak av stMSCs ShhKO celler. Mens MSC cellelinjer med intakt Shh uttrykk ble rekruttert til mageslimhinnen som svar på IFNy, stMSCs ShhKO var ikke. Hedgehog signalering er nødvendig for MSC spredning og rekruttering til magen som svar på IFNy}

Citation. Donnelly JM, Chawla A, Houghton J, Zavros Y (2013) Sonic Hedgehog formidler spredning og rekruttering av transformert Mesenchymale Stem celler til magen. PLoS ONE 8 (9): e75225. doi: 10,1371 /journal.pone.0075225

Redaktør: Jorge Sans Burns, Universitetssykehuset i Modena og Reggio Emilia, Italia

mottatt: 24 januar 2013; Akseptert: 14. august 2013, Publisert: 19.09.2013

Copyright: © 2013 Donnelly et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres

Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av American Cancer Society Forskning Scholar Award 119072-RSG-10-167-01-MPC (Y. Zavros), Albert J. Ryan Foundation Fellowship (J. Donnelly) og delvis av fordøyelses Health Center Cincinnati Barnas Medical Health Senter (DHC: Benk til Bedside Research in Pediatric Digestive Disease) CHTF /SUB DK078392. Forfatterne ønsker å takke hjelp av Monica DeLay leder av Forsknings flowcytometrisystemer Kjerne i Divisjon for revmatologi ved Cincinnati Children Hospital Medical Center, støttet delvis av National Institutes of Health (NIH) AR-47363. All flowcytometrisk data ble ervervet ved bruk av utstyr vedlikeholdes av Forsknings flowcytometrisystemer Kjerne i Divisjon for revmatologi ved Cincinnati Children Hospital Medical Center, støttet delvis av NIH AR-47363. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer

Innledning

det er et klart etablert rolle for Sonic Hedgehog (Shh) signaliserte i utviklingen av kreft [1], [2], [3]. Cellevekst i fordøyelseskanalen tumorer som omfatter spiserør, mage, bukspyttkjertel og galleveier er regulert av endogen ekspresjon av pinnsvin ligander slik som Shh [1]. Binding av pinnsvin ligand til dets reseptor lappet (ptch), resulterer i fjerning av hemmingen av ptch på glattet (Smo). Denne fjernelse av hemmingen på Smo resulterer i aktivering av den Gli-familien av transkripsjonsfaktorer pinnsvin og etterfølgende tumorvekst som kan blokkeres av pinnsvin nøytraliserende antistoff [1]. Mens sammenhengen mellom Shh og magekreft er klart, er den funksjonelle rollen Shh i utvikling og progresjon av magekreft i stor grad ukjent. Videre er den mekanisme som regulerer produksjonen av Shh i svulsten mikromiljøet er ennå ikke bestemt.

Helicobacter pylori (H. pylori)
bakteriekolonisering fører til kronisk betennelse som er konsekvent forbundet med progresjon til magekreft [4]. Den mest vanlige og skadelig immunrespons involverer Th1 pro-inflammatoriske cytokiner, mest fremtredende IFNy fra T-celler, og IL-1β og TNFa fra vev eller invaderende makrofager [5], [6], [7], [8], [ ,,,0],9]. Faktisk, til pro-inflammatoriske cytokin IFNy har vist seg å bidra til patogenesen og utvikling av gastrisk metaplasi [5], [9], [10] og kreft [10]. I betennelse-indusert kreft, the Hedgehog signalveien formidler IFNy-indusert tumorutvikling [11], [12], [13]. Spesielt er Shh en IFNy målet genet og Hedgehog signaliserer en formidler av IFNy-indusert spredning [12].

Under Helicobacter
infeksjon, sammenfaller kronisk betennelse med rekruttering av benmargen-avledet mesenchymale stamceller (BM-MSC) [14], [15]. I kronisk betennelse i mage BM-MSC er rekruttert fra benmargen til magen og differensieres til kreft-assosiert fibroblaster (kafeer) som er medvirkende i regi kreftutvikling [14]. Selv om det klart implisert i utvikling av magekreft, den mekanisme som regulerer proliferasjon og rekruttering av malignantly transform BM-MSC til magen i løpet av kronisk betennelse er stort sett ukjent. Interessant er Shh rapportert å indusere spredning og differensiering av BM-MSC [16]. Shh har også blitt anerkjent som en potensiell kjemotiltrekkende for benmargs avledet celler når oppregulert i respons til kronisk betennelse [17], [18].

Basert på sammenhengen mellom IFNy og Shh, hypotese vi at IFNy induserer Shh signalering innenfor MSC tilrettelegging celle migrasjon til magen. For å teste denne hypotese, sammenligner denne studien in vivo
BM-MSC rekrutteringen til den gastriske slimhinne som reaksjon på IFNy ved hjelp av en spontant transformert mesenchymal stamcelle linje (stMSC) i forhold til utransformert BM-MSC. I kultur, BM-MSC er utsatt for mutasjon med aldring og viser klinisk relevante mutasjoner i p53-genet [19]. Med langsiktig kultur BM-MSC "spontant transformere" (stMSCs), kan spres in vitro i lengre perioder og viser en kreftfremmende fenotype [19]. Den aktuelle studien bruker både stMSCs og transformerte BM-MSC (wtMSCs) som over-uttrykker Hedgehog signalering. Bruke wtMSC og stMSC cellelinjer både in vivo Hotell og in vitro
, viser vi at IFNy-indusert spredning og rekruttering av MSC cellelinjer til magen er et svar som formidles av Shh

Materialer og metoder

Dyr

C57BL /6 (stamme�664) og IRG (belastningen705) mus brukes for disse studiene ble kjøpt fra Jackson sekresjon og signalering. Laboratories. Alle mus studier ble godkjent av University of Cincinnati Institutional Animal Care og bruk Committee (IACUC) som opprettholder en American Association of Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care (AAALAC) studio.

Bone Marrow-avledet Spontant Forvandlet Mesenchymale stamceller (stMSC) og ikke-transform BM-MSC (wtMSC) Kultur og behandlinger

wtMSC cellelinjer ble etablert fra hele benmarg fra IRG mus og kultur til passasje 5 før transfeksjon med påfølgende vedlikehold ved lav passasje nummer (< P10) før eksperimentell bruk. Hel benmarg ble spylt fra femur og tibia hos mus for etterfølgende kultur og passasje av plastheft MSC befolkning [20]. Spontant transform benmarg-avledede stamceller (stMSCs) transfektert med et pDsRed-Hyg-C1 plasmid som uttrykker rød fluorescerende protein ble anvendt for [21]. Alle celler ble dyrket ved bruk av HyClone DMEM kulturmedium supplert med 10-15% føtalt kalveserum og 1% penicillin-streptomycin under normale forhold. MSC dyrket i behandling ble sådd ut i 6-brønners plater og fikk vokse til 70-80% konfluens i vanlige medier så serum sultet over natten. Etter kultur utvidelse ble Mouse multipotente Mesenchymale stromal Cell Marker Antistoff Panel brukes til å merke MSC cellelinjer for Sca-en, CD106, CD105, CD73, CD29, CD44 og blodkreft markørene CD45 og CD11b (R &D Systems, SC018). Cellene ble suspendert ved en konsentrasjon på 1 x 10 ^{6 celler /ml og farget i henhold til produsentens protokoll. Cellene ble deretter inkubert med AlexaFluor 488 ved en 1:100 fortynning i 30 minutter ved 4 ° C. Fiksering ble utført i 15 minutter ved romtemperatur med en kommersielt tilgjengelig reagens (Invitrogen GAS001S5). Fluorescensintensiteten ble målt ved flowcytometri bruk av BD FACSCalibur og CellQuestPro programvare. wtMSCs og stMSCs ble behandlet med bærer, rekombinant mus interferon gamma (rmIFNγ, 100 nM, R &D Systems) eller anti-Shh antistoff 5E1 (forhåndsbehandlet i 6 timer) pluss rmIFNγ i 24 timer. Behandlet celler ble deretter analysert for endringer i cellesyklusen ved flowcytometri.}

Sonic Hedgehog (Shh) knockdown av Lentivirus-mediert Kort hårnål RNA (shRNA) med stMSCs

RFP-merkede stMSCs var transduced med fem forskjellige MISSION lentiviral transduksjon partikkel kloner som inneholder forskjellige sekvenser av shRNA for Shh og en pLKO.1-puro komponent givende puromycin motstand (Sigma Aldrich). RFP-merkede stMSCs ble inkubert med lentiviral partikler med ExpressMag magnetiske perler (Sigma Aldrich) på en magnet (Oz Biosciences Super magnetplaten, MF10000) i 15 minutter, ble cellene fjernet fra magneten, inkubert i ytterligere 16 timer og deretter plassert under puromycin utvalg (DMEM Dyrkningsmedier inneholdende 10% føtalt kalveserum, 1% penicillin /streptomycin, 10 ug /ml puromycin) i 7 til 10 dager. Den effektive puromycin dose som er nødvendig for å eliminere ikke-transduserte celler ble bestemt som tidligere gjennom en puromycin kill kurve som testet i konsentrasjoner fra 0 til 50 ug /ml (data ikke vist). Transduced celler ble merket med et unikt klone ID-nummer med cellelinjer transduced med shRNA for Shh (stMSC ^{ShhKO) nummerert 59-63. En pLKO.1-puro vektor omformet RFP-MSC cellelinje (stMSC Vect) fungerte som kontroll for den endogene nivået av Hysj genuttrykk. Western blot analyse ble brukt til å bekrefte Shh knockdown og RFP uttrykk.}

Transfeksjon av wtMSCs til Over-express Shh

plasmid (Origene CW101340) ble kombinert med Origene Turbofectin reagent på prosenter av 0 :1, 01:01, 02:01, 03:01 og 04:01 og inkubert i 15 minutter ved romtemperatur. Transfeksjon reagens ble deretter tilsatt dråpevis til wtMSCs ved 70% konfluens og fikk inkubere i 24 timer før cellene ble satt under seleksjon i normal media med puromycin. Den effektive puromycin dose som er nødvendig for å eliminere ikke-transfekterte celler ble bestemt som tidligere gjennom en puromycin kill kurve testkonsentrasjoner fra 0 til 10 ug /ml (data ikke vist). Den laveste konsentrasjonen som drepte alle utransfekterte celler i 3-4 dager etter behandling ble etablert som to mikrogram /ml.

In vivo stMSC Rekruttering og sprednings

C57BL /6 mus ble transplantert med en × 10 ^{6 wtMSCs, wtMSCs Hysj, stMSCs Vect eller stMSCs ShhKO via halevenen injeksjon. Tre dager etter transplantasjonen, ble musene injisert med bærer (sterilt PBS, i.p.) eller rmIFNγ (1 ug /dag, i.p.) i 7 eller 21 dager. Mus ble injisert med 200 mL BrdU merking lager reagens (5-brom-2-deoksy-uridin Merking og Detection Kit II, Roche Diagnostics, ip) 24 timer før analyse, og mage seksjoner fiksert i 4% paraformaldehyde, parafin-embedded og 3 mikrometer seksjoner forberedt for immunhistokjemisk og immunfluorescens analyser. Hel benmarg ble også isolert fra lårben av samme mus med PBS spyling. Røde blodceller ble lysert ved bruk av røde blodceller lyseringsbuffer (4,14 g NH _{4Cl, 0,5 g KHCO 3, 0,5 M EDTA i 500 ml, pH 7.2-7,4). Omtrent 11 × 10 6 celler ble fiksert og permeabilized hjelp Caltag Laboratories flowcytometrisystemer Kit, i henhold til produsentens protokoll (Invitrogen, GAS-004) og farget ved hjelp av anti-RFP FITC-konjugert antistoff (1:100, Abcam, ab34764 ) og deretter farget ved hjelp Vybrant DyeCycle Ruby flekk (Invitrogen) i henhold til produsentens protokoll. Fluorescens ble analysert ved hjelp av BD LSRII Flowcytometer system. For å analysere spesifikt RFP-MSC, gating ble anvendt for å analysere cellesyklus av bare de FITC-positive celler. Peak fluorescens ble analysert ved ModFitLT programvare for å fastslå hvor stor prosentandel av befolkningen i hver fase av cellesyklusen.}}

flowcytometrisystemer og Cell Cycle Analysis

Celler ble serum-sultet 16 timer før analyse . Celler ble fiksert med iskald 70% etanol /PBS i 15 minutter ved -20 ° C, vasket og deretter farget med propidiumjodid i 45 minutter. De målte verdier for fluorescens-topp pr totale antall celler ble oppnådd ved bruk av programmet Cellquest Pro (Becton Dickson). Prosentandelen av celler fra populasjonen i hver fase av cellesyklusen ble beregnet fra fluorescensmålinger toppen gjennom analyse med ModFit LT programvare. Flowcytometri bruker FACSCalibur ™ -system (Becton Dickson) ble utført på alle omsatte celler ved hjelp av musen multipotente Mesenchymale Stem Cell Marker Antistoff Panel i henhold til produsentens protokoll (R &D Systems, SC018).

Immunpresipitasjon og Western blot analyse

Cellelysater ble utarbeidet etter M-PER pattedyr protein Ekstraksjonsreagens (Thermo Scientific, IL) supplert med proteasehemmere (Roche) i henhold til produsentens protokoll. Media prøver fra celler ble konsentrert ved hjelp av 15 ml Amicon Ultra sentrifugalfilter Devices (Millipore). Cellelysater (100 ug totalt protein) og media ble immunopresipitert ved bruk av anti-Shh 5E1-antistoff (2 ug) ved 4 ° C i 16 timer. Protein A /G-agarose-perler (20 ul, Santa Cruz Biotechnology, California) ble tilsatt og prøvene ble inkubert ved 4 ° C i 16 timer. Etter 16 timers inkubasjon ble immunpresipitatene vasket 3 ganger med PBS og resuspendert i 40 ul Laemmli Loading Buffer inneholder β-mercaptoethanol (Bio-Rad Laboratories, CA) før du legger på 4-20% Tris-Glycine Gradient Gel. Gelene ble kjørt ved 80 V, 3,5 timer, protein overført til nitrocellulosemembraner ved 105 V, 1-2 timer, og deretter blokkert i 1 time ved romtemperatur ved anvendelse av KPL detektorblokken (Kirkegaard &Co. Perry Laboratories, Inc.). Membraner ble inkubert over natten ved 4 ° C med en 1:200 fortynning av Shh antistoff (N-19, Santa Cruz), fulgt av en 1 times inkubering med 1:100 fortynning av AlexaFluor anti-geit 680 (Invitrogen). Blottene ble fotografert ved hjelp av et scanning densitometer sammen med analyseprogramvare (Odyssey Infrared Imaging Software System).

RNA Isolation og RT-PCR

Total RNA ble isolert fra mage vev ved hjelp av Trizol reagens ifølge produsenter protokollen (TriReagent, Molecular Research Center, Inc.). The High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems) ble benyttet for cDNA syntese fra RNA følge den anbefalte protokollen. For hver prøve ble 60 ng av RNA reverstranskribert for å gi omtrent 2 pg total cDNA som så ble brukt for RT-PCR. RFP primer sekvenser som ble brukt var som følger: FORWARD -5 'CCC CGT AAT GCA GAA GAA GA 3', REVERS -5 'CTT GGC CAT GTA GGT GGT CT 3'. PCR-amplifikasjoner ble utført i et totalvolum på 20 ul, inneholdende buffer, 20 mM forover og revers primere, Taq-polymerase, RNase-fritt vann og cDNA-template. Hver PCR-amplifikasjon ble utført i to brønner i en GeneAmp PCR System 9700 thermocycler (Applied Biosystems), ved anvendelse av følgende betingelser: 94 ° C 3 minutter, 94 ° C i 30 sekunder, 60 ° C 1 minutt og 72 ° C 1 minutt til 35 sykluser. PCR-produkter ble visualisert på en 1,5% agarose-TAE-gel.

Immunhistokjemi

Mus ble injisert med 200 ul av BrdU merking lager reagens (5-brom-2'-deoksy-uridin Merking og Detection Kit II, Roche Diagnostics) 24 timer før analyse. Gastrisk vev ble fiksert med Carnoy sin fikseringsmiddel (60 ml etanol, 30 ml kloroform og 10 ml eddiksyre) i 16 timer, parafin innleiret, og 4 um snitt ble fremstilt. Etter deparaffinization, ble antigen gjenfinning utføres ved oppvarming av lysbildene i 10 minutter ved 100 ° C i 0,01 M natrium-citrat-buffer (Antigen avmaskering løsning, Vector Laboratories, Burlingame, CA). Endogen peroksidaseaktivitet ble deretter blokkert ved inkubering glir i 3% hydrogenperoksid /etanol i ytterligere 20 minutter. Snittene ble deretter blokkert ved anvendelse av 5% BSA /Tris-bufret saltvann /0,1% Tween 80 (TBS-T) og inkubert med en 1:20 fortynning av anti-BrdU-antistoff (5-brom-2'-deoksy-uridin Merking og Detection Kit II, Roche Diagnostics) ved 37 ° C i 30 minutter. BrdU fargeutvikling ble utført i henhold til produsentens protokoll. Seksjonene ble deretter blokkert med 20% normalt geiteserum i 20 minutter og inkubert med en 1:400 fortynning av biotin-konjugert anti-RFP-antistoff (Abcam, ab34771) i 16 timer ved 4 ° C, etterfulgt av fortynning av anti- 1:500 kanin IgG i 30 minutter og deretter visualisert med avidin-biotin-komplekser ved å bruke Vectastain Elite ABC Kit ved hjelp av diaminobenzidin (DAB) som substrat (Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA). Lysbilder ble montert ved hjelp Permount.

For adipocyte induksjon, ble stMSCs behandlet med HyClone DMEM containing10 ^{-8 M deksametason (Sigma, D4902) og 5 mikrogram /ml insulin (Sigma, I6634). Alle celler ble fiksert ved bruk av 4% paraformaldehyd i 20 minutter ved RT. For å oppdage differensiering, ble Oil Red O farging utføres ved å legge til en 3,75% Olje Red O løsning, ruger 5 minutter ved romtemperatur, deretter vaske i vann før montering på lysbilder ved hjelp Vectashield HardSet Mounting Medium. Bilder ble sett og fanget i henhold lysmikroskopi bruker et Olympus BX60 med en Diagnostic Instruments "Spot" Camera.}

immunfluorescens

stMSC ^{Vect og stMSC ShhKO celler ble dyrket på dekk til 70-80% konfluens, fiksert med 4% paraformaldehyd i 30 minutter ved romtemperatur, permeabiliserte med PBS inneholdende 0,5% TritonX-100 og blokkert med 2% esel serum i 1 time ved romtemperatur. Cellene ble deretter inkubert med enten en 1:50 fortynning av anti-CD44 (Abcam ab65829) eller et 1:100 fortynning av anti-CD45 (Abcam ab10558) antistoff over natten ved 4 ° C. Alexa Fluor esel anti-kanin-488 ble anvendt som det sekundære antistoff ved 1:1000 fortynning i 1 time ved romtemperatur. Cellene ble deretter motfarget med en 1:2000 fortynning av den kjernefysiske flekk TO-PRO 3-jodid (Invitrogen, T3605) i 20 minutter ved romtemperatur før montering ved hjelp av Vectashield HardSet monteringsmedium. Kanin IgG ble brukt ved en 1:25 fortynning som negativ kontroll under de samme betingelser.}

Mage seksjoner er samlet inn fra PBS eller IFNy-behandlede mus ble blokkert med 20% normalt geiteserum og inkubert med anti- 1:400 RFP antistoff (Abcam, ab34771) i 16 timer ved 4 ° C, etterfulgt av 1:100 anti-kanin Alexa Fluor 488 (Invitrogen) sekundært antistoff i ytterligere 1 time. Objektglassene ble deretter motfarget ved anvendelse av anti-E-cadherin (BD Transduction Labs, 610181) -antistoff ved en 1:200 fortynning i 1 time ved romtemperatur fulgt av 1:100 anti-mus Alexa Fluor 633 (Invitrogen) sekundært antistoff. Alle prøver ble montert ved hjelp Vectashield Hardset monteringsmedium (VectaLabs). Bilder ble innhentet ved hjelp av en Zeiss LSM510 META konfokalmikroskop.

Chemotaxis analysen

chemotaxis analysen ble utført basert på etablerte protokoller [22]. Transduced stMSCs ble belagt i 24 vel Transwell plater som inneholder PET membraner med 8 mikrometer porer (BD Falcon). 2,5 x 10 ^{4 celler ble sådd i den apikale (øvre) kammer i DMEM medium inneholdende 0,1% BSA. SDF-1α (rmSDF-1α, R &D Systems) ble tilsatt til basolateral (lavere) kammer ved konsentrasjoner på 0 til 150 ng /ml. Celler ble inkubert i 6 timer ved 37 ° C. Etter overføringen ble cellene fiksert i 4% paraformaldehyd i 30 minutter og deretter farget i 10 minutter ved bruk av en Wright-Giemsa beis. Celler igjen på toppen av membranen ble fjernet med en bomullstupp applikator og gjenværende celler ble tellet i 5 felt ved 40 x forstørrelse. Antallet migrerende celler ble beregnet ved å dividere gjennomsnittlig antall trekkende celler i hver brønn med gjennomsnittlig antall trekkende celler i kontroll godt.}

Statistical Analysis

Resultatene ble analysert ved enten en studentens uparet t-test eller ANOVA med egnet programvare (GraphPad Prism, GraphPad Software, San Diego, California). En P
verdi < 0,05 ble betraktet som signifikant

Resultater

IFNy-indusert stMSC spredning medieres av Shh sekresjon og Signa

rolle. Hedgehog signalering som en formidler av IFNy-indusert stMSC og wtMSC spredning ble identifisert ved flowcytometri og cellesyklusprogresjon. Etter behandling ble cellene farget med propidiumjodid og cellesyklus analysert ved flowcytometri på et valgt enkelt cellepopulasjon (figur S1A). Figur 1 representerer de gjennomsnittlige verdier av cellefordelingen i prosent ved forskjellige cellesyklus faser i behandlingsgruppene vist på fig S1B-E. Figurene S1B-E representerer tomter som viser endringene i cellesyklus faser. De gjennomsnittlige verdier og statistisk signifikans i respons til alle behandlinger er oppsummert i figur S1F og G. Analyse av rå fluorescens data viste en økt prosentandel av stMSCs i S-fasen og G _{2 /M-fase, og en redusert prosentandel av cellene i G 0 /G en fase som svar på rmIFNγ forhold til kjøretøy-behandlede celler (figur 1A). Å identifisere rollen utskilt Shh som en formidler av IFNy-indusert stMSC spredning brukte vi anti-Hedgehog nøytral 5E1 monoklonalt antistoff som binder seg til Shh ligand og forstyrrer protein binding til reseptoren ptch [1]. Den proliferative respons til stMSCs til rmIFNγ var signifikant inhibert med 5E1-antistoff-behandling (figur 1A). Når sammenlignet med stMSCs, ikke-transformerte wtMSCs reagerte på samme måte som reaksjon på IFNy antyder den observerte økning i proliferasjon var ikke et resultat av transformasjonen alene. IFNy betydelig indusert andelen wtMSCs i S-fasen, et svar som ble blokkert av anti-Shh antistoff (Figur 1B). Kollektivt, Figur 1 viser at IFNy induserer spredning av både ikke-transformerte og spontant forvandlet MSC, et svar som formidles av utskilt Shh.}

Dempe den Shh Gene innen Bone Marrow-avledet stMSCs

Å omfattende studere rollen til Hedgehog signalisering i BM-MSC spredning og rekruttering in vivo
, wtMSCs ble transfektert til over-express Shh mens stMSCs ble transduced med lentiviral shRNAs mot Shh. En pLKO.1-puro basen lentiviral vektor uttrykker en kort hårnål sekvens mot transkripsjon av Shh genet ble brukt. Kontroll MSC cellelinjer ble etablert ved hjelp wtMSC med endogen uttrykk for Shh og transfeksjon av stMSCs med pLKO.1-puro basen lentiviral vektor (stMSC ^{Vect). Fem lentiviral kloner, hver klon uttrykker et annet kort hårnål sekvens, ble analysert (stMSC ShhKO59-stMSC ShhKO63). Knockdown av Shh ble bekreftet ved Western blot analyse som viste 100% knockdown av Shh protein uttrykk i alle kloner i forhold til de untransduced celler (wtMSCs) og Shh over-uttrykker cellelinjer (wtMSC Shh og stMSC Vect) ( Figur S2A). Klon stMSC ShhKO59 ble anvendt for etterfølgende forsøk, og vil bli referert til som stMSC ShhKO. Uttrykk for pDsRed-Hyg-C1 plasmid som uttrykker rød fluorescerende protein (RFP) ble bekreftet av immunoblot hjelp cellelysat samlet inn fra omsatte stMSCs (Figur S2A). Viktigere, wtMSCs stabilt transfektert til over-express Shh protein, uttrykt Shh på et nivå som ligner på stMSCs (figur S2A).}

For å verifisere knockdown av Shh i MSC uten å endre differensiering av cellene, et uttrykk mønster for de klassiske CD-markører (CD29, CD106, CD105, CD44 og CD73) og Sca-en ved hjelp av flowcytometri ble utført ved hjelp av dyrket stMSC ^{Vect (figur S2B) og stMSC ShhKO (figur S2C) celler. Både stMSC Vect og stMSC ShhKO cellene var negativ for CD45 (Figur S3). I tillegg er begge stMSC cellelinjer var i stand til å differensiere til en adipocytt fenotype basert på positiv Oil Red O farging av lipid-dråper produseres (fig S3). Sammen er disse data tyder på at knockdown av Shh protein i stMSCs ikke endret differensiering av disse cellene.}

IFNy induserer spredning av wtMSCs og stMSCs i Bone Marrow

For å bestemme effekten av IFNy på wtMSC og stMSC spredning in vivo
, mus ble transplantert med RFP-merket wtMSC, wtMCS ^{Hysj, stMSC Vect eller stMSC ShhKO celler og behandlet med rmIFNγ i 21 dager. Etter IFNy behandling, ble benmarg høstet og analysert med hensyn på endringer i cellesyklus og antall RFP-positive celler ved flowcytometri. IFNy induserte en signifikant økning i antall RFP positive celler i benmargen fra alle eksperimentelle grupper med unntak av de dyr transplantert med stMSC ShhKO celler (figur 2A, B). Immunfluorescens av benmarg viste at det var en signifikant økning i spesifikt antall prolifererende RFP positive celler som respons på IFNy som co-lokalisert med BrdU immunfarging (figur 2C, D). Dette ble ytterligere understøttet av fig S4A, B og C som viser representative lys-sprednings analyse avslører en populasjon av stMSCs som var positive for RFP og omfattet omtrent 0,1% av hele benmarg-cellepopulasjonen. RFP-positive celler ble gated for den enkeltcellepopulasjon (figur S4C) og cellesyklus analysert. Celler samlet fra benmargen hos mus transplantert med stMSC Vect celler behandlet med rmIFNγ hadde en betydelig større andel av celler i S-fase (55,5 ± 2,82%) sammenlignet med de mus som var behandlet med PBS (32,9 ± 5,14%, P
< 0,05 sammenlignet med stMSC Vect transplanterte mus behandlet med PBS) (Figur s4F). Prosentandelen av celler i S-fase oppsamlet fra benmargen hos mus transplantert med stMSC ShhKO behandlet med rmIFNγ var ikke signifikant forskjellige (32,9 ± 2,64%) sammenlignet med de mus som var behandlet med PBS (38,4 ± 1,47%, P
> 0,05 sammenlignet med stMSC ShhKO transplanterte mus behandlet med PBS) (Figur S4i). Figurene S4D, E, G og H representerer plott som viser endringer i cellesyklusfaser. Dermed induserer IFNy spredning av både wtMSCs og stMSCs in vivo
i benmarg, et svar som ser ut til å være mediert av Hysj signalering.}

In vivo
Rekruttering av wtMSCs og stMSCs til mageslimhinnen for å håndtere IFNy

å identifisere hvilken rolle Hedgehog signalering som en formidler av IFNy-indusert stMSC rekruttering til gastrisk epitel, mus transplantert med stMSC ^{Vect og stMSC ShhKO celler ble behandlet med PBS eller IFNy i 21 dager. Magene ble deretter samlet og rekruttering av RFP-merket stMSC Vect og stMSC ShhKO celler analysert ved immunhistokjemi (figur 3). stMSC Vect celler ble rekruttert til gastrisk mucosa fra mus injisert med IFNy (figur 3C, D) sammenlignet med fravær av RFP-merket stMSC Vect cellene i mave PBS-injiserte mus (figur 3A, B ). stMSC ShhKO celler transplantert inn mus injisert med IFNy ble ikke rekruttert til mageslimhinnen (Figur 3E, F). Ekspresjon av RFP-merket stMSC Vect celler med IFNy behandling ble bekreftet ved RT-PCR (figur 3G). For å finne ut om rekruttering av MSC til mageslimhinnen som svar på IFNy var unikt for stMSCs, ble forsøket gjentatt ved hjelp av enten wtMSCs eller wtMSCs over-uttrykker Shh (wtMSC Shh). Selv om både wtMSC og wtMSC shh-celler ble detektert i magen på IFNy-behandlede mus, var det signifikant høyere antall wtMSC Shh og stMSC Vect celler i mageslimhinnen når sammenlignet med wtMSC celle transplantert gruppe (figur 3 H). Til sammen tyder disse data på at Shh signalering er egnet til å mediere rekrutteringen av MSCene til den gastriske slimhinne som reaksjon på IFNy.}

Det var en signifikant økning i antall prolifererende celler i mageslimhinnen som reaksjon på IFNy -behandlet wtMSC ^{Shh og stMSC Vect transplanterte mus sammenlignet med PBS-injiserte mus (figur 4A-D, figur s5a-F). Imidlertid MSC ble BrdU negativ (figur 4B, C og figur S5a-D). Selv om stMSC ShhKO celler transplantert inn i mus injisert med IFNy ikke ble rekruttert til den gastriske slimhinne, var det ingen forskjell i epitelproliferasjon mellom PBS og IFNy-behandlinger i denne forsøksgruppen, noe som antyder økt MSC-avledet Shh kan være nødvendig for å understøtte denne økt spredning (figur 4D). I tillegg, selv wtMSCs ble rekruttert til den gastriske slimhinne i respons til IFNy, var det ingen forskjell i epitelproliferasjon mellom PBS og IFNy-behandling (Figur 4D). Disse dataene antyder at Shh signale innen wtMSCs Shh og stMSCs svar på IFNy induserer spredning i mage epitel. IFNy alene, i fravær av stMSCs, ikke induserer spredning i mageslimhinnen som bekrefter denne effekten er ikke relatert til betennelse alene.}

For å avgjøre om redusert stMSC spredning, etter rekruttering, var assosiert med celle adhesjon innenfor gastrisk epitelium, magene ble deretter samtidig er farget for E-cadherin og RFP (figur 4G-i). PBS-behandlede mus som ble transplantert med RFP-merket stMSC ^{Vect celler viste ingen rekruttering av celler til mageslimhinnen (figur 4G). I samsvar med figur 3, IFNy-injiserte mus som ble transplantert med RFP-merket stMSC Vect celler viste markant rekruttering av celler til mageslimhinnen (figur 4H). RFP-merket stMSC Vect celler samlokalisert med E-cadherin (figur 4G, jeg) som støtter at rekruttert celler hadde innpodet i mage epitel.}

Hedgehog Signa formidler uttrykk for Focal Heft Protein i Response til SDF-1α kjemokin

Vi valgte å undersøke SDF-1α /CXCR4 signale akse som det er fastslått at denne signalveien fremmer MSC rekruttering [23], [24].

• PLoS ONE: Uventet Headless og hale fisk i magen innhold Shortfin Mako Isurus oxyrinchus
• PLoS ONE: insectivorous Flaggermus Digest Chitin i magen Bruke Surt pattedyr Chitinase