PLoS ONE: Sonic Hedgehog Vermittelt die Proliferation und Rekrutierung von Transformed mesenchymalen Stammzellen in den Magen

Abstrakt

Studien mit Helicobacter
infiziertem Mäusen zeigen, dass Knochenmark gewonnenen mesenchymalen Stammzellen (MSCs) können die Magenepithels besiedeln und Magenkrebs Progression fördern. Innerhalb der Tumor-Mikroumgebung des Magens, pro-inflammatorische Zytokin Interferon-gamma (IFN &ggr;) und Sonic-Hedgehog (Shh) erhöht sind. IFN γ wird in Tumorproliferation durch die Aktivierung des SHH-Signalwegs in verschiedenen Geweben beteiligt, sondern ob ein ähnlicher Mechanismus im Magen vorhanden ist, ist unbekannt. Wir testeten die Hypothese, dass IFNy treibt MSC-Proliferation und Rekrutierung, eine Antwort, vermittelt durch Shh-Signalisierung. Die aktuelle Studie verwendet Transplantation eines In-vitro-
transformierten mesenchymalen Stammzelllinie (stMSC ^{vect), dass überexprimiert Igel-Signalisierung, im Vergleich zu nicht-transformierten Wildtyp-MSCs (wtMSCs), wtMSCs transfizierenden überexprimieren Shh (wtMSC Shh) und stMSCs transduziert mit lentiviralen Konstrukte enthalten shRNA die Shh-Gen (stMSC ShhKO) Targeting. Die Wirkung von IFN &ggr; auf MSC-Proliferation wurde durch Zellzyklus-Analyse in vitro
mit rekombinantem IFN &ggr; (rmIFNγ) unter Verwendung allein behandelten Zellen beurteilt oder in Kombination mit anti-Shh-Antikörper 5E1 und in vivo
Mäuse transplantiert mit MSCs behandelt mit PBS oder rmIFNγ verwenden. In-vitro-
, IFNy deutlich erhöht MSC-Proliferation, eine Antwort von Shh vermittelt, die durch 5E1 Antikörper blockiert wurde. Die MSC Population aus Knochenmark von PBS- oder IFN &ggr; behandelten Mäusen gesammelt haben gezeigt, dass IFN &ggr; signifikant den Prozentsatz aller MSC-Zelllinien in der S-Phase erhöht, mit Ausnahme der stMSCs ShhKO Zellen. Während die MSC-Zelllinien mit intakten Shh Expression auf die Magenschleimhaut in Reaktion auf IFNy rekrutiert wurden, stMSCs ShhKO waren es nicht. Hedgehog-Signalisierung wird für MSC-Proliferation und Rekrutierung in den Magen als Reaktion auf IFNy erforderlich}

Citation:. Donnelly JM, Chawla A, Houghton J, Zavros Y (2013) Sonic Hedgehog Vermittelt die Proliferation und Rekrutierung von Transformed mesenchymalen Stammzellen die Zellen in den Magen. PLoS ONE 8 (9): e75225. doi: 10.1371 /journal.pone.0075225

Editor: Jorge Sans Burns, Universitätsklinik von Modena und Reggio Emilia, Italien in

Received: 24. Januar 2013 beginnen; Akzeptiert: 14. August 2013; Veröffentlicht: 19. September 2013

Copyright: © 2013 Donnelly et al. Dies ist eine Open-Access-Artikel unter den Bedingungen der Lizenz Creative Commons, die uneingeschränkte Nutzung erlaubt, die Verteilung und Vervielfältigung in jedem Medium, vorausgesetzt, der ursprüngliche Autor und Quelle genannt werden

Finanzierung:. Diese Arbeit wurde von der American Cancer Society Forschung Scholar Award 119072-RSG-10-167-01-MPC (Y. Zavros), Albert J. Ryan Foundation Fellowship (J. Donnelly) und teilweise durch den Magen-Darm-Health Center Cincinnati Children Medical Health Center (DHC: Bench to Bedside Forschung in Pediatric Digestive Disease) CHTF /SUB DK078392. Die Autoren möchten die Unterstützung von Monica DeLay Manager des Forschungs Flow Cytometry Kern in der Abteilung für Rheumatologie an Cincinnati Children Hospital Medical Center zu erkennen, teilweise von der National Institutes of Health (NIH) AR-47363 unterstützt. Alle durchflusszytometrischen Daten wurden mit Hilfe von Geräten von der Forschungs Flow Cytometry Kern in der Abteilung für Rheumatologie am Cincinnati Children Hospital Medical Center, unterstützt teilweise durch NIH AR-47363 beibehalten erworben. Die Geldgeber hatten keine Rolle in Studiendesign, Datenerfassung und Analyse, Entscheidung oder Vorbereitung des Manuskripts zur Veröffentlichung

Konkurrierende Interessen:.. Die Autoren haben erklärt, dass keine Interessenkonflikte bestehen

Einführung

Es gibt eine klar etablierte Rolle für Sonic Hedgehog (Shh) bei der Entwicklung von Krebs Signalisierung [1], [2], [3]. Das Zellwachstum in Verdauungstrakt Tumoren, die Speiseröhre, des Magens, der Gallenwege und der Bauchspeicheldrüse enthalten, werden durch endogene Expression von Hedgehog-Liganden reguliert wie Shh [1]. Bindung von Hedgehog-Liganden an seinen Rezeptor, Patched (Ptch), resultiert in der Entfernung der Hemmung der Ptch auf Smoothened (Smo). Diese Entfernung der Hemmung auf Smo resultiert in der Aktivierung der Gli-Familie von Transkriptionsfaktoren, Hedgehog und anschließend das Tumorwachstum, die durch Hedgehog blockiert werden können neutralisierende Antikörper [1]. Während die Assoziation zwischen Shh und Magenkrebs klar ist, ist die funktionelle Rolle von Shh in der Entwicklung und Progression von Magenkrebs weitgehend unbekannt. Außerdem ist der Mechanismus, der die Produktion von Shh im Tumormikromilieu reguliert wurde noch nicht bestimmt werden.

Helicobacter pylori (H. pylori)
bakterielle Besiedlung führt zu einer chronischen Entzündung, die konsistent mit der zugeordneten Fortschreiten zu Magenkrebs [4]. Die häufigste und schädliche Immunantwort umfasst die Th1 pro-inflammatorische Zytokine, am deutlichsten IFNy von T-Zellen und IL-1β und TNF &agr; aus Gewebe oder eindringenden Makrophagen [5], [6], [7], [8], [ ,,,0],9]. Tatsächlich pro-inflammatorischen Zytokins IFNy gezeigt worden mit der Pathogenese und Entwicklung von Magen Metaplasie [5], [9], [10] und Krebs [10] beitragen. In entzündungsbedingten Krebserkrankungen vermittelt der Hedgehog-Signalweg Tumorentwicklung-IFNy induziert [11], [12], [13]. Insbesondere ist Shh ein IFNy Zielgen und Hedgehog einen Mediator von IFNy-induzierte Proliferation Signalisierung [12].

Während Helicobacter
Infektion fällt eine chronische Entzündung mit der Rekrutierung von Knochenmark abgeleiteten mesenchymalen Stammzellen (BM-MSCs) [14], [15]. In der chronisch entzündeten Magen BM-MSCs aus dem Knochenmark in den Magen rekrutiert und differenzieren sich in Krebs-assoziierte Fibroblasten (CAFs), die bei der Leitung der Entwicklung von Krebs instrumental sind [14]. Obwohl deutlich in der Entwicklung von Magenkrebs beteiligt, der Mechanismus der Verbreitung und Rekrutierung von maligne transformierten BM-MSCs in den Magen während einer chronischen Entzündung regulieren, ist weitgehend unbekannt. Interessanterweise wird berichtet Shh Proliferation und Differenzierung von BM-MSCs [16] zu induzieren. Shh hat auch als potenzielle chemische Lockstoffe für Knochenmark abgeleiteten Zellen erkannt worden, als Reaktion auf eine chronische Entzündung nach oben reguliert [17], [18].

Auf der Grundlage der Assoziation zwischen IFNy und Shh, wir nehmen an, dass IFN &ggr; induziert Shh Signalisierung innerhalb MSCs Zellmigration in den Magen zu erleichtern. Um diese Hypothese zu testen, vergleicht die aktuelle Studie in vivo
BM-MSC Rekrutierung der Magenschleimhaut in Reaktion auf IFNy einer spontan transformierten mesenchymalen Stammzelllinie (stMSC) im Vergleich zu nicht-transformierten BM-MSCs verwenden. In der Kultur sind BM-MSCs anfällig für Mutation mit dem Altern und zeigen klinisch relevante Mutationen im p53-Gen [19]. Mit Langzeitkultur BM-MSCs "spontan transform" (stMSCs) können für längere Zeiträume und weisen eine krebsfördernde Phänotyp [19] in vitro vermehrt werden. Die aktuelle Studie verwendet beide stMSCs und untransformierten BM-MSCs (wtMSCs), dass überexprimiert Hedgehog-Signalisierung. Mit Hilfe der wtMSC und stMSC Zelllinien sowohl in vivo
und In-vitro-
zeigen wir, dass IFNy-induzierte Proliferation und die Rekrutierung von MSC-Zelllinien in den Magen eine Antwort ist, die durch Shh vermittelt wird Sekretion und Signalisierung.

Materialien und Methoden

Tiere

C57BL /6 (Stamm�664) und IRG (Stamm705) Mäuse für diese Studien verwendet wurden von Jackson gekauft Laboratories. Alle Maus Studien wurden von der University of Cincinnati Institutional Animal Care und Use Committee (IACUC) genehmigt, die eine American Association of Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care (AAALAC) Anlage unterhält.

aus dem Knochenmark Spontan Transformed mesenchymale Stammzellen (stMSC) und Nicht transformierte BM-MSCs (wtMSC) Kultur und Behandlungen

Die wtMSC Zelllinien aus Gesamtknochenmark von Mäusen IRG und kultiviert Passage 5 vor der Transfektion mit anschließender Wartung bei niedrigen etabliert wurden Passagezahl (< P10) vor der experimentellen Verwendung. Gesamtknochenmark wurde aus dem Femur und Tibia von Mäusen für die nachfolgende Kultur und Passage der Kunststoff anhaftenden MSC Population [20] gespült. Spontan transformierten Knochenmark stammenden mesenchymalen Stammzellen (stMSCs) transfiziert mit einem pDsRed-Hyg-C1 Plasmids wurden rot fluoreszierendes Protein exprimieren, verwendet [21]. Alle Zellen wurden mit 10-15% fötalem Kälberserum und 1% Penicillin-Streptomycin unter normalen Bedingungen ergänzt HyClone DMEM-Kulturmedium. MSCs gezüchtet für die Behandlung wurden in 6-Well-Platten und erlaubt plattiert auf 70-80% Konfluenz in normalen Medien zu wachsen dann Serum über Nacht ausgehungert. Nach Kultur Expansion wurde die Maus Multipotente Mesenchymale Stromal Cell Marker-Antikörper-Panel verwendet MSC Zelllinien für Sca-1, CD106, CD105, CD73, CD29, CD44 und den hämatopoetischen Marker CD45 und CD11b zu etikettieren (R & D Systems, SC018). Die Zellen wurden bei einer Konzentration von 1 × 10 ^{6 Zellen /ml suspendiert und gefärbt nach dem Protokoll des Herstellers. Zellen wurden dann mit AlexaFluor 488 bei einer 1:100 Verdünnung für 30 Minuten bei 4 ° C inkubiert. Fixierung wurde für 15 Minuten bei RT mit einem handelsüblichen Reagenz (Invitrogen GAS001S5) durchgeführt. Die Fluoreszenzintensität wurde mittels Durchflusszytometrie unter Verwendung des BD FACSCalibur und CellQuestPro Software gemessen. (; D Systems rmIFNγ, 100 nM, R &) oder anti-Shh-Antikörper 5E1 (für 6 Stunden vorbehandelt) zuzüglich rmIFNγ für 24 Stunden wtMSCs und stMSCs wurden mit Vehikel, rekombinantes Maus-Interferon-gamma behandelt. Behandelten Zellen wurden dann auf Veränderungen im Zellzyklus durch Durchflusszytometrie analysiert.}

Sonic Hedgehog (Shh) Knockdown von Lentivirus-vermittelte short hairpin RNA (shRNA) stMSCs

RFP-tagged stMSCs verwendet wurden mit verschiedenen Sequenzen von shRNA für Shh und einer pLKO.1-puro Komponente zur Übertragung der Puromycin-Resistenz (Sigma Aldrich) mit fünf verschiedenen MISSION lentivirale Transduktion Partikel Klone transduziert. RFP-tagged stMSCs für lentivirale Partikel mit ExpressMag magnetischen Kügelchen (Sigma Aldrich) auf einem Magneten (Oz Biosciences Super-magnetische Platte, MF10000) 15 Minuten inkubiert wurden, wurden die Zellen von dem Magneten entfernt wird, für weitere 16 Stunden inkubiert und dann platziert unter Puromycin-Selektion (DMEM Kulturmedien, enthaltend 10% fötales Kälberserum, 1% Penicillin /Streptomycin, 10 ug /ml Puromycin) für 7 bis 10 Tage. Die wirksame Dosis Puromycin benötigt nicht-transduzierten Zellen zu eliminieren, wurde vorher durch ein Puromycin Abtötungskurve bestimmt, die Konzentrationen von 0 bis 50 &mgr; g /ml getestet (Daten nicht gezeigt). Transduzierten Zellen durch eine eindeutige ID-Nummer Klon mit Zelllinien transduziert mit shRNA für Shh bezeichnet wurden (stMSC ^{ShhKO) nummeriert 59-63. Ein pLKO.1-puro Vektor transduziert RFP-MSC-Zelllinie (stMSC vect) diente als Kontrolle für die endogene Menge von Shh Genexpression. Western-Blot-Analyse wurde verwendet, Shh Knockdown und RFP-Expression zu bestätigen.}

Die Transfektion von wtMSCs zu überexprimieren Shh

Das Plasmid (Origene CW101340) wurde bei Verhältnissen von 0 mit dem Origene Turbofectin Reagenz kombiniert :1, 1.01 Uhr, 2.01 Uhr, 03.01 Uhr und 04.01 Uhr und 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Das Transfektionsreagens wurde dann tropfenweise zu wtMSCs bei 70% Konfluenz und man ließ für 24 Stunden inkubieren, bevor Zellen unter Selektion mit Puromycin in normalen Medien gestellt wurden. Die effektive Puromycin Dosis benötigt, um nicht-transfizierten Zellen zu eliminieren wurde von 0 bis 10 ug /ml vorher durch ein Puromycin Abtötungskurve Testkonzentrationen bestimmt (Daten nicht gezeigt). Die niedrigste Konzentration, die alle nicht-transfizierten Zellen bei 3-4 Tage nach der Behandlung getötet wurde als 2 ug /ml hergestellt.

In vivo stMSC Rekrutierung und Proliferation

C57BL /6-Mäuse mit 1 transplantiert × 10 ^{6 wtMSCs, wtMSCs Shh, stMSCs vect oder stMSCs ShhKO über Schwanzveneninjektion. Drei Tage nach der Transplantation wurden Mäuse mit Vehikel (steriles PBS, i.p.) injiziert oder rmIFNγ (1 &mgr; g /Tag, i.p.) für 7 oder 21 Tage. Die Mäuse wurden mit 200 &mgr; l BrdU Stammreagens injiziert (5-Brom-2'-Desoxy-Uridin Labeling and Detection Kit II, Roche Diagnostics, ip) 24 Stunden vor der Analyse und Magen Abschnitte in 4% Paraformaldehyd fixiert und in Paraffin eingebetteten und 3 &mgr; M Abschnitte vorbereitet für immunhistochemischen und Immunofluoreszenz analysiert. Gesamtknochenmark wurde aus den Oberschenkelknochen von derselben Mäuse mit PBS Spülung isoliert. Rote Blutzellen wurden unter Verwendung des roten Puffer Blutzellen-Lyse aufgeschlossen (4,14 g NH _{4 Cl, 0,5 g KHCO 3, 0,5 M EDTA in 500 ml, pH 7.2-7,4). Etwa 11 x 10 6 Zellen wurden fixiert und permeabilisiert Caltag Laboratories Flow Cytometry Kit gemäß dem Protokoll des Herstellers (Invitrogen, GAS-004) und anti-RFP FITC-konjugierten Antikörper gefärbt unter Verwendung von (1:100, Abcam, ab34764 ) und dann Vybrant DyeCycle Rubin stain (Invitrogen) entsprechend dem Protokoll des Herstellers gefärbt werden. Die Fluoreszenz wurde unter Verwendung des BD LSRII Durchflusszytometer System analysiert. Zur Analyse wurde speziell auf die RFP-MSCs, Gating verwendet, um den Zellzyklus von nur die FITC-positiven Zellen zu analysieren. Peak-Fluoreszenz wurde durch ModFitLT Software analysiert, um den Prozentsatz der Bevölkerung in jeder Phase des Zellzyklus zu bestimmen.}}

Durchflusszytometrie und Zellzyklus-Analyse

Die Zellen wurden Serum-ausgehungert 16 Stunden vor der Analyse . Die Zellen wurden für 15 Minuten bei -20 ° C mit eiskaltem 70% Ethanol /PBS fixiert, gewaschen und dann mit Propidiumiodid für 45 Minuten gefärbt. Die Messwerte der Peakfluoreszenz pro Gesamtzahl der Zellen wurden unter Verwendung des Programms Cellquest Pro (Becton Dickson) erhalten. Der Prozentsatz der Zellen aus der Population in jeder Phase des Zellzyklus wurde aus den Peak-Fluoreszenzmessungen durch Analyse mit ModFit LT-Software berechnet. Durchflusszytometrie die FACSCalibur ™ -System (Becton Dickson) wurde auf allen transduzierten Zellen durchgeführt, mit der Maus multipotenten mesenchymalen Zellmarker Antikörper-Panel nach dem Herstellerprotokoll (R & D Systems, SC018) Vorbau.

Immunpräzipitation und Western- Verwendung von M-PER Säugerprotein Extraktionsreagens (Thermo Scientific, IL), ergänzt mit Proteaseinhibitoren (Roche) gemäß Herstellerprotokoll Blot Analyse

Zelllysate wurden hergestellt. Medienproben von Zellen wurden konzentriert unter Verwendung von 15 ml Amicon Ultra-Zentrifugen-Filtergeräte (Millipore). Zell-Lysate (100 ug Gesamtprotein) und Medien wurden anti-Shh-Antikörper 5E1 immunpräzipitiert unter Verwendung von (2 &mgr; g) bei 4 ° C für 16 Stunden. Protein A /G-Agarose-Perlen (20 &mgr; l, Santa Cruz Biotechnology, CA) zugesetzt und die Proben für 16 Stunden bei 4 ° C inkubiert. Nach 16 Stunden Inkubation Immunpräzipitate wurden 3 mal mit PBS gewaschen und in 40 &mgr; l Laemmli-Ladepuffer, enthaltend β-Mercaptoethanol (Bio-Rad Laboratories, CA) resuspendiert, bevor Tris-Glycin-Gelen mit einem Gradienten auf 4-20% Beladung. Die Gele wurden bei 80 V, 3,5 Stunden laufen, Protein bei 105 auf Nitrocellulosemembranen übertragen V, 1-2 Stunden und dann für 1 Stunde bei Raumtemperatur unter Verwendung von KPL Detektorblock blockiert (Kirkegaard & Perry Laboratories, Inc.). Die Membranen wurden über Nacht bei 4 ° C mit einer 1:200 Verdünnung von Shh-Antikörper (N-19, Santa Cruz), gefolgt von einer 1-stündigen Inkubation mit 1:100 Verdünnung von AlexaFluor anti-Ziege-680 (Invitrogen) inkubiert. Die Blots wurden zusammen mit Analysesoftware (Odyssey Infrared Imaging Software System) unter Verwendung eines Abtastdensitometers abgebildet.

RNA-Isolierung und RT-PCR

Gesamt-RNA wurde von Magengewebe mit Trizolreagenz isoliert nach dem Herstellerprotokoll (TriReagent, Molecular Research Center, Inc.). Die High Capacity cDNA Reverse Transkription-Kit (Applied Biosystems) wurde für die cDNA-Synthese von RNA gemäß dem empfohlenen Protokoll verwendet. Für jede Probe wurden 60 ng von RNA transkribiert wurde revers etwa 2 &mgr; g Gesamt-cDNA zu erhalten, die dann für die RT-PCR verwendet wurde. RFP Primersequenzen verwendet wurden, waren wie folgt: FORWARD -5 'CCC CGT AAT GCA GAA GAA GA 3', REVERSE -5 'CTT GGC CAT GTA GGT GGT CT 3'. PCR-Amplifikationen wurden in einem Gesamtvolumen von 20 ul durchgeführt, mit Puffer, 20 mM Forward- und Reverse-Primer, Taq-Polymerase, RNase-freies Wasser und cDNA-Template. 94 ° C 3 min 94 ° C 30 Sekunden, 60 ° C 1 Minute und 72 ° C 1 Minute, 35: jede PCR-Amplifikation wurde in zwei Vertiefungen in einem GeneAmp PCR System 9700 Thermocycler (Applied Biosystems) unter Verwendung der folgenden Bedingungen durchgeführt Fahrräder. PCR-Produkte wurden auf einem 1,5% Agarose-TAE-Gel sichtbar gemacht.

Immunhistochemie

Mäuse mit 200 ul BrdU Stammreagens injiziert wurden (5-Brom-2'-Desoxy-Uridin Markierungs- und Nachweis Kit II, Roche Diagnostics) 24 Stunden vor der Analyse. Magengewebe wurden mit Carnoy-Fixativ (60 ml Ethanol, 30 ml Chloroform, 10 ml Essigsäure) fixiert für 16 Stunden, in Paraffin eingebettet, und 4 &mgr; m-Schnitte wurden hergestellt. Nach Entparaffinierung wurde Antigen-Retrieval durch Erhitzen der Objektträger für 10 Minuten bei 100 ° C in 0,01 M Natriumcitratpuffer (Antigen Unmasking Lösung, Vector Laboratories, Burlingame, CA) durchgeführt. Endogene Peroxidase-Aktivität wurde dann durch Inkubieren Dias in 3% Wasserstoffperoxid /Ethanol für weitere 20 Minuten blockiert. Die Schnitte wurden dann mit 5% BSA blockiert unter Verwendung von /Tris-gepufferter Salzlösung /0,1% Tween 80 (TBS-T) und mit einer 1:20 Verdünnung von anti-BrdU-Antikörper (5-Bromo-2'-deoxy-uridin Labeling and Detection Kit inkubiert II, Roche Diagnostics) bei 37 ° C für 30 Minuten. BrdU Farbentwicklung wurde nach dem Protokoll des Herstellers durchgeführt. Die Schnitte wurden dann für 20 Minuten mit 20% normalem Ziegenserum blockiert und bei 4 ° C gefolgt von 1:500 Verdünnung von Anti-Biotin-konjugierter anti-RFP-Antikörper (Abcam, ab34771) inkubiert 16 Stunden lang mit einer Verdünnung von 1:400 Kaninchen-IgG für 30 Minuten und dann mit Avidin-Biotin-Komplexe unter Verwendung des Vectastain Elite ABC Kit unter Verwendung von Diaminobenzidin (DAB) als Substrat (Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA) sichtbar gemacht. Die Objektträger wurden mit Permount montiert.

Für Adipozyten-Induktion wurden stMSCs mit HyClone DMEM behandelt enthaltend10 ^{-8 M Dexamethason (Sigma, D4902) und 5 ug /ml Insulin (Sigma, I6634). Alle Zellen wurden mit 4% Paraformaldehyd für 20 min bei RT fixiert. Zur Differenzierung erkennen, wurde Oil Red-O-Färbung durch Zugabe einer 3,75% Oil Red O-Lösung, Inkubation 5 Minuten bei RT durchgeführt, dann in Wasser gewaschen, bevor sie auf Folien Montage mit Vectashield HardSet Mounting Medium. Die Bilder wurden betrachtet und erfasst unter Lichtmikroskopie unter Verwendung eines Olympus BX60 mit einem Diagnostic Instruments "Spot" Kamera.}

Immunofluoreszenz

stMSC ^{vect und stMSC ShhKO Zellen wurden auf Deckgläsern gezüchtet bis 70-80% Konfluenz, mit 4% Paraformaldehyd für 30 Minuten bei Raumtemperatur permeabilisiert mit PBS 0,5% Triton X-100 und blockiert mit 2% Eselserum für 1 Stunde bei Raumtemperatur enthält. Die Zellen wurden dann entweder mit einer Verdünnung von 1:50 von anti-CD44 (Abcam ab65829) oder einer 1:100 Verdünnung von anti-CD45 (Abcam ab10558) Antikörper über Nacht bei 4 ° C inkubiert. Alexa Fluor Esel-anti-Kaninchen-488 wurde als sekundärer Antikörper bei 1:1000 Verdünnung für 1 Stunde bei Raumtemperatur verwendet. Die Zellen wurden dann mit einer 1:2000 Verdünnung des Kernfärbung TO-PRO-3 Iodid (Invitrogen, T3605) für 20 Minuten bei RT counterstained vor Vectashield HardSet Mounting Medium unter Verwendung von Befestigungs. Kaninchen-IgG wurde bei einer Verdünnung 01.25 als negative Kontrolle unter den gleichen Bedingungen verwendet.}

Stomach Abschnitte gesammelt aus PBS oder IFN &ggr; behandelten Mäusen wurden blockiert mit 20% normalem Ziegenserum inkubiert und mit 1:400 anti- RFP Antikörper (Abcam, ab34771) für 16 Stunden bei 4 ° C gefolgt von 1:100 anti-Kaninchen-Alexa Fluor 488 (Invitrogen) sekundärer Antikörper für eine weitere 1 Stunde. Die Objektträger wurden dann gegengefärbt mit Anti-E-Cadherin (BD Transduction Labs, 610.181) Antikörper in einer 1:200 Verdünnung für 1 Stunde bei Raumtemperatur, gefolgt von 1:100 anti-Maus-Alexa Fluor 633 (Invitrogen) sekundären Antikörper. Alle Proben wurden unter Verwendung von Vectashield Hardset Mounting Medium (VectaLabs) angebracht ist. Die Bilder wurden mit einem Zeiss LSM510 META Konfokalmikroskop erhalten.

Chemotaxis Assay

Der Chemotaxis-Assay basiert auf etablierten Protokollen durchgeführt wurde [22]. Transduzierten stMSCs wurden in 24-Well Transwell-Platten, die PET-Membranen mit 8 um Poren (BD Falcon) plattiert. 2,5 x 10 ^{4 Zellen wurden in der apikalen (oberen) Kammer in DMEM-Medium, enthaltend 0,1% BSA geimpft. SDF-1α (rmSDF-1α, R & D Systems) wurde in Konzentrationen von 0 bis 150 ng /ml zur basolateralen (untere) Kammer zugegeben. Zellen wurden bei 37 ° C für 6 Stunden inkubiert. Nach der Migration wurden die Zellen für 30 Minuten in 4% Paraformaldehyd fixiert, dann für 10 Minuten gefärbt einer Wright-Giemsa-Färbung verwendet. Zellen, die auf der Oberseite der Membran verblieben, wurden mit einem Wattestäbchen entfernt und die verbleibenden Zellen wurden in 5 Felder bei 40-facher Vergrößerung gezählt. Die Zahl der wandernden Zellen wurde berechnet, indem die durchschnittliche Anzahl der berechneten Zellen in jeder Vertiefung durch die durchschnittliche Anzahl von wandernden Zellen in der Kontrolle und der Migration.}

Statistische Analyse

Ergebnisse entweder durch eine analysiert wurden Schüler ungepaarten t-Test oder ANOVA im Handel erhältliche Software (GraphPad Prism, GraphPad Software, San Diego, CA) verwendet wird. A P
Wert < 0,05 wurde als signifikant angesehen

Ergebnisse

• PLoS ONE: Unerwarteter Headless und Tailless Fische im Mageninhalt von Shortfin Mako Isurus oxyrinchus
• PLoS ONE: Insectivorous Bats Digest Chitin im Bauch unter Verwendung saurer Mammalian Chitinase