PLoS ONE: Sonic Hedgehog välittää leviämisen ja rekrytointi transformoidut mesenkymaalisten kantasolujen mahalaukkuun

tiivistelmä

Tutkimukset käyttäen Helicobacter
infektoiduista hiiristä osoittavat, että luuytimestä peräisin mesenkymaaliset kantasolut (MSC: t) voidaan asuttaa mahalaukun epiteelin ja edistää mahalaukun syövän etenemisessä. Sisällä kasvain microenvironment mahan, proinflammatoristen sytokiinien interferoni-gamma (IFNy) ja Sonic Hedgehog (Shh) ovat koholla. IFNy on osallistuvat kasvaimen leviämisen aktivoimalla Shh signalointireitin eri kudoksissa, mutta onko samaa mekanismia olemassa mahassa on tuntematon. Testasimme hypoteesia, että IFNy ajaa MSC leviämisen ja rekrytointi, vastauksen välittämä Shh signalointi. Nykyinen Tutkimuksessa käytetään elinsiirtoon olevan in vitro
transformoitu mesenkymaalisten solulinja (stMSC ^{vect), että yli-ilmentää hedgehog-signalointia, verrattuna ei-transformoitujen villityypin MSC: (wtMSCs), wtMSCs transfektoitu yli-express Shh (wtMSC Shh), ja stMSCs transdusoida lentiviraalinen konstrukteja, jotka sisältävät shRNA kohdistaminen Shh geeni (stMSC ShhKO). Vaikutus IFNy koskevan MSC proliferaatiota arvioitiin solusyklin analyysi in vitro
käyttämällä soluja käsiteltiin yhdistelmä-IFNy (rmIFNγ) yksinään tai yhdistelmänä anti-Shh 5E1-vasta-aineen, ja in vivo
hiirillä oli siirretty MSC: t on käsitelty PBS: ää tai rmIFNγ. In vitro
, IFNy huomattavasti MSC leviämisen, vastaus välittämä Shh on estetty 5E1-vasta-aineen. MSC väestöstä kerätään luuytimestä PBS: llä tai IFNy-käsitellyistä hiiristä osoittivat, että IFNy lisäsi merkittävästi osuus kaikista MSC solulinjojen S-vaiheessa, ja lukuun ottamatta stMSCs ShhKO soluja. Vaikka MSC solulinjoissa ehjät Shh ilme rekrytoitiin mahan limakalvon vastauksena IFNy, stMSCs ShhKO eivät olleet. Hedgehog signalointi tarvitaan MSC leviämisen ja rekrytointi vatsan vastauksena IFNy.}

Citation: Donnelly JM, Chawla A, Houghton J, Zavros Y (2013) Sonic Hedgehog välittää leviämisen ja rekrytointi transformoidut mesenkymaalisten solut vatsaan. PLoS ONE 8 (9): e75225. doi: 10,1371 /journal.pone.0075225

Editor: Jorge Sans Burns, yliopistollisen sairaalan Modenan ja Reggio Emilia, Italia

vastaanotettu: 24 tammikuu 2013; Hyväksytty: 14 elokuu 2013; Julkaistu: 19 syyskuu 2013

Copyright: © 2013 Donnelly et ai. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat American Cancer Society Research Scholar Award 119072-RSG-10-167-01-MPC (Y. Zavros), Albert J. Ryan Foundation Fellowship (J. Donnelly) ja osittain Digestive Health Center Cincinnati lastenterveyskeskus Health center (DHC: Bench Bedside Research in Pediatric Digestive Disease) CHTF /SUB DK078392. Tekijät haluavat tunnustaa apua Monica DeLay johtaja Research virtaussytometria Core Division of Rheumatology at Cincinnati lastensairaalassa Medical Center, tukee osittain National Institutes of Health (NIH) AR-47363. Kaikki virtaussytometriselle tiedot hankittiin käyttäen laitteita ylläpitämä Research virtaussytometria Core Division of Rheumatology at Cincinnati lastensairaalassa Medical Center, tukee osittain NIH AR-47363. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

on selvästi osoitettu rooli Sonic Hedgehog (Shh) signalointi kehittämisessä syövän [1], [2], [3]. Solukasvua ruoansulatuskanavan kasvaimet, jotka sisältävät ruokatorven, mahalaukun, sappiteiden ja haiman säädellään endogeenisen ilmentymisen Hedgehog ligandien kuten Shh [1]. Sitovat Hedgehog ligandi-reseptori, Patched (Ptch), johtaa poistaminen inhibition Ptch on Smoothenedin (Smo). Tämä poistaminen estoa Smo johtaa aktivoinnin Gli-perheen Hedgehog transkriptiotekijöiden ja sen jälkeen kasvaimen kasvu voidaan estää Hedgehog neutraloiva vasta-aine [1]. Vaikka yhdistyksen välillä Shh ja mahasyöpä on selvä, toiminnallista roolia Shh kehittämisessä ja etenemistä mahasyöpä ei juuri tunneta. Lisäksi mekanismi, joka säätelee tuotantoa Shh sisällä kasvain mikroympäristön on vielä määrittelemättä.

Helicobacter pylori (H. pylori) B bakteerikolonisaatiota aiheuttaa kroonista tulehdusta, joka on johdonmukaisesti liittyy eteneminen syöpään [4]. Yleisin ja haitallinen immuunivaste liittyy Th1 proinflammatoristen sytokiinien, merkittävimmin IFNy T-soluista ja IL-1β ja TNFa kudoksesta tai tunkeutuvat makrofagit [5], [6], [7], [8], [ ,,,0],9]. Itse asiassa, pro-inflammatoristen sytokiinien IFNy: n on osoitettu edistävät patogeneesiin ja kehittämiseen mahalaukun metaplasiaa [5], [9], [10] ja syöpä [10]. Tulehdus aiheuttama syöpien, the Hedgehog signalointireitin välittää IFNy aiheuttamaa kasvainten kehittymiseen [11], [12], [13]. Erityisesti Shh on IFNy kohdegeenin ja Hedgehog signalointi välittäjänä IFNy-indusoitua proliferaatiota [12].

aikana Helicobacter
infektio, krooninen tulehdus yhtyy rekrytointi luuytimestä peräisin mesenkymaaliset kantasolut (BM-MSC) [14], [15]. Kroonisesti tulehtunut vatsa BM-MSC: t rekrytoidaan luuytimestä mahalaukkuun ja erilaistua syöpään liittyvän fibroblasteja (valuuttalisiin), jotka ovat avainasemassa ohjaavat syövän kehityksen [14]. Vaikka selvästi sekaantuneet kehittämiseen mahasyövän, mekanismi säätelevät leviämisen ja rekrytointi malignisti transformoitujen BM-MSC: vatsaan aikana krooninen tulehdus ei juuri tunneta. Mielenkiintoista on, että Shh on raportoitu indusoivan proliferaatiota ja erilaistumista BM-MSC: t [16]. Shh on myös havaittu olevan mahdollinen kemoattrak- luuytimestä peräisin olevia soluja, kun yläreguloituja vastauksena krooniseen tulehdukseen [17], [18].

perusteella yhdistyksen välillä IFNy ja Shh oletamme, että IFNy indusoi Shh signalointi sisällä MSC: t helpottavat solun siirtymisen vatsaan. Tämän hypoteesin testaamiseksi, nykyinen Tutkimuksessa verrataan in vivo
BM-MSC värväyksen mahan limakalvon vastauksena IFNy käyttäen spontaanisti transformoitu mesenkymaalisten kantasolujen linja (stMSC) verrattuna transformoimattoman BM-MSC:. Kulttuuri, BM-MSC: t ovat alttiita mutaatio ikääntymiseen ja näyttelytila ​​kliinisesti merkityksellisiä mutaatioita p53-geenin [19]. Pitkäaikaisessa kulttuuri BM-MSC: t "spontaanisti muuntaa" (stMSCs), voidaan kasvattaa in vitro pidempiä aikoja ja näytteille syöpää edistävää fenotyyppi [19]. Nykyinen tutkimus käyttää sekä stMSCs ja transformoimattomien BM-MSC: (wtMSCs), että yli-ilmentää Hedgehog signalointi. Käyttäen wtMSC ja stMSC solulinjoissa sekä in vivo
ja in vitro
, osoitamme, että IFNy-indusoitua proliferaatiota ja rekrytointi MSC solulinjojen vatsaan on vastaus, joka välittää Shh eritystä ja signalointi.

Materiaalit ja menetelmät

Eläimet

C57BL /6 (kanta�664) ja IRG (kanta705) hiirillä näissä tutkimuksissa käytettiin hankittiin Jackson Laboratories. Kaikki hiiri tutkimukset hyväksynyt yliopiston Cincinnati Institutional Animal Care ja Käytä komitea (IACUC), joka ylläpitää American Association of arviointi ja akkreditointi Laboratory Animal Care (AAALAC) laitokseen.

luuytimestä peräisin Spontaanisti Muuttunut mesenkyymikasvaimia Kantasolut (stMSC) ja ei-transformoitujen BM-MSC: (wtMSC) kulttuurin ja Hoidot

wtMSC solulinjat perustettiin kokonaisista luuytimestä IRG hiirten ja viljeltiin kulku 5 ennen transfektiota myöhempien ylläpitoon alhaisissa siirrostusjärjestysluku (< P10) ennen koekäyttöön. Koko luuydin huuhdeltiin reisiluusta ja hiirten sääriluun myöhemmin kulttuurin ja kulkua muovi tarttuu MSC väestöstä [20]. Spontaanisti transformoitu luuytimestä peräisin mesenkymaaliset kantasolut (stMSCs) transfektoitiin pDsRed-Hyg-C1 ekspressoivan plasmidin punainen fluoresoiva proteiini käytettiin [21]. Kaikki solut viljeltiin käyttäen HyClone DMEM elatusaineita täydennetty 10-15% naudan sikiön seerumia ja 1% penisilliini-streptomysiiniä normaaleissa olosuhteissa. MSC: viljeltiin hoitoon maljattiin 6-kuoppaisille levyille ja annettiin kasvaa 70-80% konfluenssiin normaalissa media sitten seerumia yön yli. Viljelyn jälkeen laajennus, Hiiri Multipotentit mesenkyymikasvaimia stroomakasvaimet Cell Marker Vasta Panel käytettiin leimaamiseen MSC solulinjoja Sca-1, CD106, CD105, CD73, CD29, CD44 ja hematopoieettisten markkereita CD45 ja CD11 (R &D Systems, SC018). Solut suspendoitiin pitoisuudella 1 x 10 ^{6 solua /ml, ja värjättiin mukaan valmistajan protokollaa. Sitten soluja inkuboitiin AlexaFluor 488, jonka 1:100 laimennus 30 minuutin ajan 4 ° C: ssa. Kiinnitys suoritettiin 15 minuutin ajan RT: ssä käyttäen kaupallisesti saatavissa olevaa reagenssia (Invitrogen GAS001S5). Fluoresenssi-intensiteetti mitattiin virtaussytometrillä käyttämällä BD FACSCalibur ja CellQuestPro ohjelmisto. wtMSCs ja stMSCs sai vehikkeliä, hiiren rekombinantti interferoni-gamma (rmIFNγ, 100 nM, R &D Systems) tai anti-Shh-vasta-aine 5E1 (esikäsitellään 6 tunnin ajan) plus rmIFNγ 24 tuntia. Käsitellyt solut analysoitiin sitten muutokset solusyklin virtaussytometrialla.}

Sonic Hedgehog (Shh) Knockdown by lentivirustartunnat välittämä Short Hairpin RNA (shRNA) käyttäen stMSCs

RFP-merkityt stMSCs olivat transdusoitu viidellä eri MISSION lentiviraalinen transduktio hiukkasia sisältävien kloonien eri sarjoissa shRNA varten Shh ja pLKO.1-puro-komponentti annetaan puromysiiniresistenssin (Sigma Aldrich). RFP-merkitty stMSCs inkuboitiin lentivirus- partikkeleita, ExpressMag magneettisia helmiä (Sigma Aldrich) on magneetti (Oz Biosciences Super Magnetic Plate, MF10000) 15 minuutin ajan, solut poistettiin magneetista, inkuboitiin vielä 16 tuntia ja sitten asetetaan puromysiiniselektion (DMEM Culture Media, joka sisälsi 10% vasikan sikiön seerumia, 1% penisilliini /streptomysiini, 10 ug /ml puromysiiniä) ja 7-10 päivää. Tehokas puromysiinin annos voidaan poistaa ei-transdusoidut solut määritettiin aiemmin läpi puromysiinin tapon käyrä, joka testattiin pitoisuuksilla 0-50 ug /ml (tuloksia ei ole esitetty). Transdusoimattomia soluja merkitään yksilöllinen klooni tunnusnumero solulinjoihin transdusoitu shRNA varten Shh (stMSC ^{ShhKO) numeroitu 59-63. PLKO.1-puro vektori transdusoidut RFP-MSC solulinja (stMSC vect) toimi kontrollina endogeenisen tason Shh geenin ilmentymisen. Western blot-analyysiä käytettiin vahvistamaan Shh Knockdown ja RFP ilme.}

transfektio wtMSCs yli-express Shh

Plasmidi (Origene CW101340) yhdistettiin Origene Turbofectin reagenssin suhteilla 0 :1, 01:01, 02:01, 03:01 ja 04:01, ja inkuboitiin 15 minuuttia huoneen lämpötilassa. Transfektioreagenssi lisättiin sitten tipoittain wtMSCs 70% konfluenssiin ja annettiin inkuboitua 24 tuntia ennen kuin solut laittaa alle valinnan normaalissa media puromysiinin kanssa. Tehokas puromysiinin annos voidaan poistaa ei-transfektoiduissa soluissa määritettiin aiemmin läpi puromysiinin tapon käyrä testaus pitoisuuksia 0-10 ng /ml (tuloksia ei ole esitetty). Pienin pitoisuus, joka tappoi kaikki transfektoimattomilla solut 3-4 päivän kuluttua hoidon perustettiin 2 ug /ml.

In vivo stMSC rekrytointi ja leviämisen

C57BL /6-hiiriä, joihin on siirretty 1 × 10 ^{6 wtMSCs, wtMSCs Shh, stMSCs vect tai stMSCs ShhKO kautta häntälaskimoinjektio. Kolme päivää transplantaation jälkeen, hiiriin injektoitiin vehikkeliä (steriili PBS, i.p.) tai rmIFNγ (1 ug /päivä, i.p.) 7 tai 21 päivää. Hiiret injektoitiin 200 ui BrdU merkintöjä varastossa reagenssia (5-bromi-2'-deoksi-uridiini Labeling ja Detection Kit II, Roche Diagnostics, ip) 24 tuntia ennen analysointia, ja vatsa osat kiinnitettiin 4% paraformaldehydi, parafinoidut ja 3 uM: n leikkeet valmistautunut immunohistokemiallista ja immunofluoresenssimenetelmällä analyysejä. Koko luuytimen eristettiin myös reisiluista saman hiiriä PBS: llä huuhtelun. Punaiset verisolut lyysattiin käyttämällä punasolujen lyysipuskuria (4,14 g NH _{4CL, 0,5 g KHCO 3, 0,5 M EDTA: ta 500 ml: ssa, pH 7.2-7,4). Noin 11 x 10 6 solut kiinnitettiin ja permeabilisoitiin Caltagin Laboratories virtaussytometria Kit, mukaan valmistajan protokollan (Invitrogen, GAS-004) ja värjättiin käyttäen anti-RFP FITC-konjugoitu vasta-aine (1:100, Abcam, ab34764 ) ja ne värjättiin sitten käyttäen Vybrant DyeCycle Ruby tahra (Invitrogen) mukaisesti valmistajan protokollaa. Fluoresenssi analysoitiin BD LSRII -virtaussytometrillä järjestelmään. Analysoida nimenomaan RFP-MSC gating käytettiin analysoimaan solu- sykli vain FITC positiivisia soluja. Piikin fluoresenssi analysoitiin ModFitLT ohjelmisto määrittää osuus väestöstä on kunkin vaiheen solusyklin.}}

virtaussytometria ja Cell Cycle Analysis

Soluja seerumia 16 tuntia ennen analyysiä . Solut kiinnitettiin jääkylmällä 70% etanoli /PBS: ssä 15 minuutin ajan -20 ° C: ssa, pestiin ja värjättiin sitten propidiumjodidilla 45 minuuttia. Mitattujen arvojen piikin fluoresenssi kohti Solujen kokonaismäärä saatiin käyttämällä ohjelmaa CellQuest Pro (Becton Dickson). Prosenttiosuus solujen populaation kunkin vaiheen solusyklin laskettiin piikin fluoresenssimittausten analyysien kanssa ModFit LT-ohjelmisto. Virtaussytometrialla käyttäen FACSCalibur ™ -järjestelmän (Becton Dickson) suoritettiin kaikille transdusoidut solut käyttämällä hiiren Multipotentit mesenkymaalisen kantasolun Marker vasta-aine mukainen paneeli valmistajan protokollan (R &D Systems, SC018).

immunosaostus ja Western blot analyysi

Solulysaatit valmistettiin käyttämällä M-PER nisäkäsproteiini uuttoreagenssi (Thermo Scientific, IL) täydennettynä proteaasinestäjät (Roche) mukaan valmistajan protokollaa. Media näytteitä soluista konsentroitiin käyttäen 15 ml Amicon Ultra Centrifugal Filter Devices (Millipore). Solulysaateista (100 ug kokonaisproteiinia) ja media immunosaostettiin käyttäen anti-Shh 5E1-vasta-aine (2 ug) 4 ° C: ssa 16 tunnin ajan. Proteiini A /G-agaroosi-helmiä (20 ui, Santa Cruz Biotechnology, CA) lisättiin ja näytteitä inkuboitiin 4 ° C: ssa 16 tunnin ajan. Sen jälkeen, kun 16 tunnin inkubaation, immunosaostumat pestiin 3 kertaa käyttäen PBS: lla ja suspendoitiin uudelleen 40 ul: Laemmli Loading Buffer sisältävät β-merkaptoetanolia (Bio-Rad Laboratories, CA) ennen lataamista 4-20% Tris-glysiini-gradienttigeeleillä. Geelit ajettiin 80 V, 3,5 tuntia, proteiini siirrettiin nitroselluloosamembraaneille 105 V, 1-2 tuntia, ja sitten blokattiin 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa käyttäen KPL Detector Block (Kirkegaard &Perry Laboratories, Inc.). Membraaneja inkuboitiin yön yli 4 ° C: ssa 1:200 laimennus Shh-vasta-aine (N-19, Santa Cruz), jota seurasi 1 tunnin inkubaatio 1:100 laimennus AlexaFluor anti-vuohi 680 (Invitrogen). Blotit kuvattiin käyttäen skannaus densitometriä yhdessä analyysin ohjelmisto (Odyssey Infrared Imaging Software System).

RNA: n eristäminen ja RT-PCR

Yhteensä-RNA eristettiin mahalaukun kudoksesta käyttämällä Trizol reagenssia mukaan valmistajat protokolla (TriReagent, Molecular Research Center, Inc.). High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems) käytettiin cDNA-synteesi RNA: sta jälkeen suositellaan protokollaa. Kustakin näytteestä 60 ng RNA: ta käänteistranskriptio, jolloin saatiin noin 2 ug kokonais-cDNA: ta, joka käytettiin sitten RT-PCR. RFP alukesekvensseissä olivat seuraavat: ETEENPÄIN -5 'CCC CGT AAT GCA GAA GAA GA 3', REVERSE -5 'CTT GGC CAT GTA GGT GGT CT 3'. PCR-monistukset suoritettiin kokonaistilavuudessa 20 ui, joka sisältää puskuria, 20 mM eteenpäin ja reverse-alukkeita, Taq-polymeraasin, RNaasi-vapaata vettä ja cDNA-templaattia. Kukin PCR-monistus suoritettiin kahtena kuoppaa GeneAmp PCR System 9700 -PCR-(Applied Biosystems), käyttäen seuraavia olosuhteita: 94 ° C 3 minuuttia, 94 ° C 30 sekuntia, 60 ° C 1 minuutti ja 72 ° C 1 minuutti 35 sykliä. PCR-tuotteet tehtiin näkyviksi 1,5% agaroosi-TAE-geelissä.

immunohistokemia

Hiiret injektoitiin 200 ui BrdU merkintöjä varastossa reagenssia (5-bromi-2'-deoksi-uridiini Labeling ja Detection Kit II, Roche Diagnostics) 24 tuntia ennen analyysiä. Mahalaukun fiksoitiin Carnoy fiksatiiviin (60 ml etanolia, 30 ml kloroformia, 10 ml: aan etikkahappoa) 16 tuntia, parafiiniin ja 4 um: n leikkeitä valmistettiin. Jälkeen deparaffinization, antigeeni haku suoritettiin kuumentamalla objektilasit 10 minuutin ajan 100 ° C: ssa 0,01 M natriumsitraatti-puskuriin (Antigen paljastamaan Solution, Vector Laboratories, Burlingame, CA). Endogeeninen peroksidaasiaktiivisuus estettiin sen jälkeen inkuboimalla liukuu 3% vetyperoksidia /etanoli vielä 20 minuuttia. Kohdat blokattiin sitten käyttämällä 5% BSA /Tris puskuroidussa suolaliuoksessa /0,1% Tween 80: tä (TBS-T) ja inkuboitiin laimennetaan 1:20 anti-BrdU-vasta-ainetta (5-bromi-2'-deoksi-uridiini Labeling ja Detection Kit II, Roche Diagnostics) 37 ° C: ssa 30 minuutin ajan. BrdU väri kehitys suoritettiin valmistajan protokollan. Sitten leikkeet blokattiin 20% normaalia vuohen seerumia 20 minuuttia ja inkuboitiin 1:400 laimennus biotiini-konjugoitu anti-RFP-vasta-ainetta (Abcam, ab34771) 16 tuntia 4 ° C: ssa, jota seuraa 1:500 laimentamalla anti- kanin IgG: tä 30 minuutin ajan ja sitten visualisoitiin avidiini-biotiini-komplekseja käyttäen Vectastain Elite ABC Kit käyttäen diaminobentsidiiniä (DAB) substraattina (Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA). Objektilasit kiinnitettiin käyttämällä Permount-peitinlaseilla.

adiposyyttien induktio, stMSCs hoidettiin HyClone DMEM containing10 ^{-8 M deksametasonilla (Sigma, D4902) ja 5 ug /ml insuliinia (Sigma, I6634). Kaikki solut kiinnitettiin käyttämällä 4% paraformaldehydillä 20 minuutin ajan RT: ssä. Havaita erilaistuminen, Oil Red O värjäys suoritettiin lisäämällä 3,75% Öljy Red O ratkaisu, inkuboimalla 5 minuuttia huoneenlämpötilassa, sitten pesemällä vedessä ennen asennusta dioja käyttäen Vectashield HardSet Mounting Medium. Kuvat näytettiin ja jää valomikroskoopilla käyttäen Olympus BX60 kanssa Diagnostic Instruments "Piste" Kamera.}

Immunofluoresenssikoe

stMSC ^{vect ja stMSC ShhKO soluja kasvatettiin coverslip kunnes 70-80% konfluenssiin, kiinnitettiin 4% paraformaldehydillä 30 minuuttia huoneen lämpötilassa, permeabilisoitiin PBS: llä, joka sisälsi 0,5% Triton X-100 ja blokattiin 2% aasi seerumissa 1 tunti huoneen lämpötilassa. Soluja inkuboitiin sitten joko 1:50 laimennosta anti-CD44 (Abcam ab65829) tai 1:100 laimennosta anti-CD45 (Abcam ab10558) vasta-ainetta yli yön 4 ° C: ssa. Alexa Fluor aasin anti-kani-488 käytettiin toisen vasta-aineen 1:1000 laimennus 1 tunnin ajan huoneen lämpötilassa. Sitten solut vastavärjättiin kanssa 1:2000 laimennus tumaväriä TO-PRO 3-jodidia (Invitrogen, T3605) 20 minuutin ajan RT: ssä ennen asennusta käyttämällä Vectashield HardSet Mounting Medium. Kani-IgG: tä käytettiin 1:25 laimennus negatiivisena kontrollina samoissa olosuhteissa.}

Vatsa osat kerätään PBS: ää tai IFNy-käsitellyistä hiiristä blokattiin 20% normaalia vuohen seerumia, ja niitä inkuboitiin 1:400 anti- RFP-vasta-ainetta (Abcam, ab34771) 16 tuntia 4 ° C: ssa ja sen jälkeen 1:100 anti-kani-Alexa Fluor 488 (Invitrogen) sekundaarisen vasta-aineen vielä 1 tunti. Jälkeen objektilasit vastavärjättiin käyttäen anti-E-kadheriini (BD Transduction Labs, 610181), vasta-ainetta 1:200 laimennus 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa, minkä jälkeen 1:100 anti-hiiri-Alexa Fluor 633 (Invitrogen) sekundaarisella vasta-aineella. Kaikki näytteet asennetaan käyttäen Vectashield Hardset Mounting Medium (VectaLabs). Kuvat saatiin käyttäen Zeiss LSM510 META konfokaalimikroskoopilla.

Kemotaksismääritvs

Kemotaksismääritys suoritettiin perustuen perustettu protokollia [22]. Transdusoidut stMSCs maljattiin 24-kuoppaisille transwell levyillä, jotka sisälsivät PET kalvoja 8 um huokosia (BD Falcon). 2,5 x 10 ^{4-solut ympättiin apikaalisessa (ylempi) kammion DMEM-väliaineessa, joka sisälsi 0,1% BSA: ta. SDF-1α (rmSDF-1α, R &D Systems) lisättiin basolateraaliseen (alempi) kammion pitoisuuksina 0-150 ng /ml. Soluja inkuboitiin 6 tuntia 37 ° C: ssa. Siirron jälkeen solut kiinnitettiin 4% paraformaldehydillä 30 minuuttia sitten värjätään 10 minuuttia käyttäen Wright-Giemsa tahra. Solut jäljellä päälle kalvon poistettiin kanssa pumpulipuikolla ja loput solut laskettiin 5 kentät 40-kertaisella suurennuksella. Lukumäärä vaeltavien solujen laskettiin jakamalla keskimääräinen määrä vaeltavia solujen kussakin hyvin keskimääräisellä määrä vaeltavia solujen valvonnassa hyvin.}

Tilastollinen analyysi

Tulokset analysoitiin joko opiskelijan parittomia t-testin tai ANOVA käyttäen kaupallisesti saatavilla oleva ohjelmisto (GraphPad Prism, GraphPad Software, San Diego, CA). P
arvo < 0,05 pidettiin merkittävänä.

Tulokset

IFNy aiheuttama stMSC leviämisen välittyy Shh eritys ja signalointi

rooli hedgehog-signaloinnin välittäjänä IFNy-indusoidun stMSC ja wtMSC proliferaatiota havaittiin virtaussytometrialla ja solusyklin etenemisen. Käsittelyn jälkeen solut värjättiin propidiumjodidilla ja solukierron analysoitiin virtaussytometrialla on valittu yhden solupopulaation (kuvio S1A). Kuvio 1 esittää keskiarvoja solun jakautuminen prosentteina eri solusyklivaiheista hoitoryhmissä kuvioissa S1B-E. Kuviot S1B-E edustavat tontteja osoittavat muutoksia solusyklivaiheista. Keskiarvot ja tilastollista merkittävyyttä vastaus kaikkiin hoitoja on esitetty yhteenvetona kuviossa S1F ja G. Analyysi raaka fluoresenssin Tutkimustulokset osoittivat suuremman prosenttiosuuden stMSCs S-vaiheessa ja G _{2 /M vaiheessa, ja alennettu solujen prosenttiosuutena G 0 /G 1 vaihe vastauksena rmIFNγ verrattuna vehikkelillä käsiteltyjen solujen (kuvio 1A). Tunnistaa rooli eritetyn Shh välittäjänä IFNy-indusoidun stMSC leviämisen käytimme anti-Hedgehog neutraloiva 5E1 monoklonaalinen vasta-aine, joka sitoutuu Shh ligandin ja häiritsee proteiinin sitoutumista reseptoriin Ptch [1]. Proliferatiivinen vaste stMSCs on rmIFNγ oli merkitsevästi inhiboi 5E1-vasta-aineen käsittelystä (kuvio 1A). Kun verrataan stMSCs, ei-transformoidut wtMSCs reagoivat samalla vastauksena IFNy viittaa havaittu proliferaation lisääntymisen ei tulosta muutoksen yksin. IFNy merkittävästi aiheuttama prosenttiosuutta wtMSCs S-vaiheessa, vastaus on estetty anti-Shh-aineella (kuvio 1 B). Yhdessä Kuvio 1 osoittaa, että IFNy indusoi sekä transformoimattomista ja spontaanisti transformoitu MSC vastauksen, joka välittää eritetyt Shh.}

vaimentaminen Shh-geenin sisällä luuytimestä peräisin stMSCs

kattavasti roolin tutkimiseksi Hedgehog signalointi BM-MSC leviämisen ja rekrytointi in vivo
, wtMSCs transfektoitiin yli-express Shh taas stMSCs transdusoitiin lentivi- shRNAs vastaan ​​Shh. PLKO.1-puro base lentivirusvektorilla ilmentämään lyhyt hiusneula sekvenssin vastaan ​​transkriptio Shh geeniä käytettiin. Ohjaus MSC solulinjat perustettiin käyttämällä wtMSC endogeenisen ilmentymisen Shh ja transfektion stMSCs kanssa pLKO.1-puro base lentivirusvektorilla (stMSC ^{vect). Viisi lentiviruksen klooneja, kukin klooni ekspressoi eri lyhyt hiusneula järjestyksessä, analysoitiin (stMSC ShhKO59-stMSC ShhKO63). Pudotus Shh vahvistettiin Western blot-analyysi, joka osoitti 100% pudotus Shh-proteiinin ilmentymistä kaikissa kloonien verrattuna trandusoidun soluja (wtMSCs) ja Shh yli-ilmentäviä solulinjoja (wtMSC Shh ja stMSC vect) ( Kuva S2A). Klooni stMSC ShhKO59 käytettiin seuraavissa kokeissa, ja niitä kutsutaan stMSC ShhKO. Expression of pDsRed-Hyg-C1 ekspressoivan plasmidin punainen fluoresoiva proteiini (RFP) vahvistettiin immunoblottauksella käyttäen solulysaattia kerättyjä transdusoitujen stMSCs (kuvio S2A). Tärkeää on, wtMSCs siirretty stabiilisti yli-express Shh-proteiini, ilmaistu Shh tasolle samanlainen stMSCs (kuva S2A).}

Voit tarkistaa knockdovvn Shh MSC-muuttamatta solujen erilaistumisen, ekspressiokuviota että klassisen CD markkereita (CD29, CD106, CD105, CD44 ja CD73) ja Sca-1 käyttäen virtaussytometrialla suoritettiin käyttäen viljeltyjä stMSC ^{vect (kuvio S2B) ja stMSC ShhKO (kuva S2C) soluja. Molemmat stMSC vect ja stMSC ShhKO solut olivat negatiivisia CD45 (kuva S3). Lisäksi molemmat stMSC solulinjat kykenivät erottamaan kohteena on adiposyytin fenotyypin perustuvan positiivisen Oil Red O värjäys lipidipisaroita tuotettu (kuvio S3). Yhdessä nämä tiedot viittaavat siihen, että knockdovvn Shh proteiinin stMSCs ei muuttanut näiden solujen erilaistumisen.}

IFNy indusoi wtMSCs ja stMSCs luuytimen

vaikutuksen määrittämiseksi IFNy on wtMSC ja stMSC leviämisen in vivo
, hiiriä, joihin on siirretty RFP-merkityn wtMSC, wtMCS ^{Shh, stMSC vect tai stMSC ShhKO soluja ja käsiteltiin rmIFNγ varten 21 päivää. Jälkeen IFNy hoito, luuydin kerättiin ja analysoitiin muutokset solusyklin ja useita RFP-positiivisten solujen virtaussytometrialla. IFNy indusoi merkittävää kasvua määrä RFP positiivisten solujen luuytimessä kaikkien koeryhmien lukuun ottamatta eläimille, joihin on siirretty stMSC ShhKO soluissa (kuvio 2A, B). Immunofluoresenssimenetelmällä luuytimen paljasti, että oli olemassa merkittävä kasvu erityisesti määrän lisääntyvien RFP positiivisten solujen vastauksena IFNy toisena paikallistaa BrdU immunovärjäyksellä (kuvio 2C, D). Tämä tuki lisäksi kuvio S4A, B ja C, jotka esitetään edustavat valoa hajottaa analyysi paljastaa populaation stMSCs jotka olivat positiivisia RFP ja käsitti noin 0,1% koko luuytimen solupopulaation. RFP-positiiviset solut aidatulla yhden solupopulaation (kuvio S4C) ja solukierron analysoitiin. Solut kerätään luuytimen hiirten transplantoitujen stMSC vect soluja käsiteltiin rmIFNγ oli merkittävästi suurempi prosenttiosuus soluja S-vaiheessa (55,5 ± 2,82%) verrattuna hiirissä, joita käsiteltiin PBS: llä (32,9 ± 5,14%, P
< 0,05 verrattuna stMSC vect siirrettyjen hoidettujen hiirien PBS) (Kuva S4F). Prosenttiosuus soluja S-vaiheessa kerätään luuytimen hiirten transplantoitujen stMSC ShhKO käsiteltiin rmIFNγ ei ollut merkitsevästi erilainen (32,9 ± 2,64%) verrattuna hiirissä, joita käsiteltiin PBS: llä (38,4 ± 1,47%, P
> 0,05 verrattuna stMSC ShhKO siirrettyjen hoidettujen hiirien PBS) (Kuva S4i). Luvut S4d, E, G ja H edustavat esitetty graafisesti muutokset solusyklin vaiheissa. Täten IFNy indusoi sekä wtMSCs ja stMSCs in vivo
luuytimessä, vastauksen, joka näyttää välittyvän Shh signalointi.}

In vivo
rekrytointi wtMSCs ja stMSCs että mahalaukun limakalvon vastauksena IFNy

tunnistaa roolin Hedgehog signalointi välittäjänä IFNy aiheuttaman stMSC värväyksen mahalaukun epiteelin, hiiriä, joihin on siirretty stMSC ^{vect ja stMSC ShhKO soluja käsiteltiin PBS: lla tai IFNy ja 21 päivää. Mahat kerättiin sitten ja rekrytointi RFP-tagged stMSC vect ja stMSC ShhKO solut analysoitiin immunohistokemiallisesti (kuvio 3). stMSC vect soluja rekrytoitiin mahalaukun limakalvon injektoitujen hiirten kanssa IFNy (kuvio 3C, D) verrattuna ilman RFP-tagged stMSC vect solujen vatsat PBS-ruiskutetaan hiiriin (kuvio 3A, B ). stMSC ShhKO soluja istutettiin hiiriin ruiskutettiin IFNy ei palvelukseen mahalaukun limakalvo (kuvio 3E, F). Expression of RFP-tagged stMSC vect solujen IFNy hoidon varmistettiin RT-PCR: llä (kuvio 3G). Sen selvittämiseksi, onko rekrytointi MSC: eiden ja mahan limakalvon vastauksena IFNy oli ainutlaatuinen stMSCs, koe toistettiin käyttäen joko wtMSCs tai wtMSCs yli-ilmentävät Shh (wtMSC Shh). Vaikka sekä wtMSC ja wtMSC Shh-soluja havaittiin vatsat IFNy-käsitellyistä hiiristä oli merkittävästi suurempi määrä wtMSC Shh ja stMSC vect solujen mahalaukun limakalvon verrattuna wtMSC solun siirrettyjen ryhmä (kuvio 3H). Yhdessä nämä tiedot viittaavat siihen, että Shh-signalointi tapahtuu todennäköisesti aikaansaavat rekrytointi MSC: eiden ja mahan limakalvon vastauksena IFNy.}

oli merkitsevä lisääntyminen lisääntyvien solujen mahalaukun limakalvon vastauksena IFNy käsiteltyä wtMSC ^{Shh ja stMSC vect istutetut hiiret verrattuna PBS-hiiriin on injektoitu (kuvio 4A-D, Kuvio S5a-F). Kuitenkin, MSC: t olivat BrdU negatiivisia (kuvio 4B, C ja kuvio S5a-D). Vaikka stMSC ShhKO soluja istutettiin hiiriin ruiskutettiin IFNy ei palvelukseen mahan limakalvon, ei ollut eroa epiteeliproliferaation välillä PBS ja IFNy hoitoja tässä kokeellisessa ryhmässä, mikä viittaa lisääntynyt MSC johdettuja Shh voidaan vaatia tukemaan tätä lisääntyvän leviämisen (kuvio 4D). Lisäksi, vaikka wtMSCs rekrytoitiin mahan limakalvon vastauksena IFNy, ei ollut eroa epiteeliproliferaation välillä PBS: llä ja IFNy-hoitoja (kuvio 4D). Nämä tiedot viittaavat siihen, että Shh signalointi sisällä wtMSCs Shh ja stMSCs vastauksena IFNy indusoi sisällä mahalaukun epiteelissä. IFNy yksin, ilman stMSCs, ei indusoi leviämisen sisällä mahalaukun limakalvon vahvistava vaikutus ei liity tulehdukseen yksin.}

Voit selvittää vähentynyt stMSC leviämisen, kun rekrytointi, liittyi solun tarttumiseen sisällä mahalaukun epiteelin, mahat sitten yhteistyössä värjätään E-kadheriinin ja RFP (kuvio 4G-I). PBS-käsitellyistä hiiristä, jotka siirrettiin yhdessä RFP-tagged stMSC ^{vect solut eivät osoittaneet rekrytointi solujen mahalaukun limakalvon (Kuva 4G). Yhdenmukainen Kuva 3, IFNy suihkutuksella hiirillä, siirrettiin yhdessä RFP-tagged stMSC vect solut osoittivat selvästi rekrytointi solujen mahalaukun limakalvon (Kuva 4H). RFP-tagged stMSC Vect solujen yhteistyötä paikallistaa E-kadheriinin (kuvio 4G, I) tuetaan että palvelukseen solut olivat Siirto tehty sisällä mahalaukun epiteelin.}

Hedgehog Signaling välittää Expression of Focal Adhesion Protein in Response SDF-1α Kemokiini

Päätimme tutkia SDF-1α /CXCR4 signalointi akselin on todettu, että tämä signalointireitille edistää MSC rekrytointi [23], [24].

• PLoS ONE: Odottamaton Päätön ja hännättömyys kala vatsassa sisältö makrillihaiden Isurus oxyrinchus
• PLoS ONE: hyönteisiä Bats Digest Kitiini vatsassa käyttäminen Happamat Nisäkkäiden Chitinase