PLoS ONE: Sonic jež posredovanje u proliferaciji i Zapošljavanje transformiranih mczcnhimnog matičnih stanica u želucu

Sažetak pregled

Studije koje koriste Helicobacter pregled -infected miševi pokazuju da dobiveni iz koštane srži mezenhimalne matične stanice (MSC) mogu repopulate želučani epitel i promovirati želučane progresiju raka. U tumor mikrookolini želuca, upalni citokin interferon-gama (IFNy), i hedgehog (Shh) povišena. IFNy je uključen u proliferaciju tumora putem aktivacije SHH signalnog puta u različitim tkivima, ali postoji li sličan mehanizam u želucu je nepoznat. Testirali smo hipotezu da IFNy vozi proliferaciju i zapošljavanje MSC, odgovor posredovan by Tiho signalizaciju. Trenutna studija koristi transplantacija vitro
transformirana mezenhimalne matičnih stanica (stMSC ^{vect) u, da je više-izražava jež signalizacija, u usporedbi s divljim tipom MSC nepromijenjene (wtMSCs), wtMSCs prenesen je u više-express SHH (wtMSC Tiho) i stMSCs prenesen sa lentiviralnih konstruktima koji sadrže shRNA ciljanje SHH gen (stMSC ShhKO). Učinak IFNy MSC proliferacije procijenjena analizu staničnog ciklusa in vitro pregled pomoću stanica tretiranih s rekombinantnim IFNy (rmIFNγ) sam ili u kombinaciji sa anti-Pst 5E1 antitijela i in vivo
miševima transplantirani MSC liječenih PBS ili rmIFNγ. In vitro pregled, IFNy značajno povećao MSC proliferacija, odgovor posredovan SHH koji je blokiran 5E1 antitijela. MSC populacija prikupljeni iz koštane srži ili PBS- tretiranih IFNy miševa pokazala je da IFNy značajno povećava postotak svih MSC staničnih linija u S fazu, uz iznimku stMSCs ShhKO stanica. Dok MSC stanične linije s netaknutom shh ekspresije regrutirani na želučanu sluznicu kao odgovor na IFNy, stMSCs ShhKO nisu. Jež signalizacija je potreban za proliferaciju MSC i zapošljavanje u želudac kao odgovor na IFNy pregled}

Izvor:. Donnelly JM, Chawla A, Houghton J, Zavros Y (2013) Sonic jež posredovanje u proliferaciji i zapošljavanje transformiranih mczcnhimnog Stem stanice u trbuh. PLoS ONE 8 (9): e75225. doi: 10,1371 /journal.pone.0075225 pregled

Urednik: Jorge Bez Burns, Sveučilišne bolnice u Modeni i Reggio Emilia, Italija pregled

Primljeno: 24 siječnja 2013; Prihvaćeno: 14. kolovoz 2013; Objavljeno: 19. rujna 2013 pregled

Copyright: © 2013 Donnelly i sur. Ovo je otvorenog pristupa članak distribuirati pod uvjetima Creative Commons Imenovanje License, koja omogućuje neograničeno korištenje, distribuciju i reprodukciju u bilo kojem mediju, pod uvjetom da je izvorni autor i izvor su zaslužan

financiranja. Ovo djelo je podržan od strane American Cancer Society Research Znalac nagradu 119072-RSG-10-167-01-MPC (Y. Zavros), Albert J. Ryan Foundation Fellowship (J. Donnelly), a dijelom od strane probavnog Zdravstveni centar Cincinnati Dječje Medical Health Centar (DHC: Klupa za Noćni istraživanja u pedijatrijskog bolesti probavnog) CHTF /SUB DK078392. Autori žele priznati pomoć Monica odgode voditelj istraživanja protočnom citometrijom jezgre u Odjelu za reumatologiju u Cincinnati Klinici za dječje bolesti Medicinskog centra, uz potporu u sklopu koje National Institutes of Health (NIH) AR-47363. Sve protočnom citometrijom Podaci su dobiveni korištenjem opreme koju vodi istraživanje protočnom citometrijom jezgre u Odjelu za reumatologiju u Cincinnati Klinici za dječje bolesti Medicinskog centra, uz potporu u sklopu koje NIH AR-47363. U financijeri nisu imali ulogu u studiju dizajna, prikupljanja i analize podataka, Odluka o objavi, ili pripremu rukopisa pregled

U konkurenciji interese.. Autori su izjavili da ne postoje suprotstavljeni interesi pregled

Uvod pregled

Tu je jasno utvrđeno uloga Sonic jež (Tiho) signalizacija u razvoju raka [1], [2], [3]. Rast stanica u probavnom traktu tumora koji uključuju jednjaka, želuca, žučnog sustava i gušterače regulirani su endogenog izražavanja ježa liganada kao što SHH [1]. Vezanje liganda jež na njegov receptor zakrpanim (PTCH), rezultira uklanjanjem inhibicije PTCH na zaglađena (SMO). Ovo uklanjanje inhibicije na SMO rezultira aktivacijom Gli-porodice hedgehog faktora transkripcije i posljedično rast tumora koji može biti blokirana hedgehog neutralizirajuće protutijelo [1]. Iako je povezanost između SHH i rakom želuca je jasno, funkcionalna uloga SHH u razvoju i progresiji karcinoma želuca je u velikoj mjeri nepoznanica. Nadalje, mehanizam koji regulira proizvodnju SHH u mikro tumora još treba utvrditi. Pregled

Helicobacter pylori (H. pylori) pregled, bakterijska kolonizacija uzrokuje kroničnu upalu koja je dosljedno povezan s napredovanje raka želuca [4]. Najčešći i štetan imunosni odgovor uključuje PH1 pro-upalnih citokina, najviše istaknut IFNy iz T-stanica, i IL-1 i TNFa iz tkiva ili invaziju makrofage [5], [6], [7], [8], [ ,,,0],9]. Doista, upalni citokin IFNy je pokazano da doprinose patogenezi i razvoju želučane metaplazije [5], [9], [10] i rak [10]. U karcinomima upale uzrokovane, the Hedgehog signalnog puta posreduje IFNy induciranu tumora razvoja [11], [12], [13]. Posebno, Shh je ciljni gen IFNy i Hedgehog signalizirajući medijator IFNy induciranu proliferaciju [12]. Pregled

U Helicobacter pregled infekcija, kronična upala podudara s zapošljavanjem dobiveni iz koštane srži mezenhimalne matične stanice (BM-MSC) [14], [15]. U kronično upaljenog želuca BM-MSC regrutiraju iz koštane srži u želudac i diferenciraju se u raka povezane fibroblasta (CAFs) koje su ključnu ulogu u usmjeravanju razvoja raka [14]. Iako je jasno uključen u razvoj raka želuca, mehanizam koji regulira proliferaciju i regrutiranje maligno transformirane BM-MSC u želucu tijekom kronične upale nepoznanica. Zanimljivo, Tiho je izvijestio da potiču proliferaciju i diferencijaciju BM-MSC-[16]. Psst također je prepoznata kao potencijalni kemijsku pobudu kod stanica koštane srži izvedena kada reguliran u odgovoru na kronične upale [17], [18]. Pregled

Na temelju povezanosti IFNy i Tiho, mi pretpostavljamo da IFNy inducira SHH signalizacije u MSC olakšavanje stanične migracije u želudac. Da bi testirali tu hipotezu, trenutna studija uspoređuje in vivo
BM-MSC zapošljavanje na sluznicu želuca, kao odgovor na IFNy korištenja u odnosu na netransformiranim BM-MSC spontano transformiran mezenhimalne matičnih stanica linije (stMSC). U kulturi, BM-MSC skloni su mutaciji sa starenjem i pokazuju klinički relevantnim mutacija u genu p53 [19]. Uz dugoročne kulture BM-MSC-"spontano preobraziti" (stMSCs), može se razmnožavati in vitro dulje i pokazuju rak-promoviranje fenotip [19]. Trenutna studija koristi i stMSCs i nepromijenjeno BM-MSC (wtMSCs) koje prekomjerno izražava jež signalizaciju. Pomoću wtMSC i stMSC stanične linije i in vivo pregled i in vitro pregled smo pokazali da IFNy-induciranu proliferaciju i regrutiranje MSC stanične linije na želucu je odgovor koji je posredovan Shh sekrecija i signalizacije. pregled

Materijali i metode pregled

Životinje pregled

C57BL /6 (soj�664) i IRG (soj705) miševi koriste za ove studije su kupljeni od Jackson laboratorijima. Sve studije miš su odobreni od strane University of Cincinnati Institucionalni Animal Care i korištenja odbora (IACUC) koja održava američku Udrugu procjenu i akreditaciju laboratorija brige o životinjama (AAALAC) objekta. Pregled

dobiveni iz koštane srži Spontano Preobrazba mczcnhimnog matične stanice (stMSC) i non-transformira BM-MSC (wtMSC) Kultura i tretmani pregled

stanične linije wtMSC su osnovane od cijele koštane srži IRG miševa i kulturan za prolaz 5 prije transfekcije s naknadnim održavanje na low broj prolaza (< P10) prije početka eksperimenta. Cijeli koštana srž je isprana iz femura i tibije miševa za daljnju kulture i prolaz plastične prijanja MSC populacije [20]. korištene su spontano transformirani dobiveni iz koštane srži mezenhimalnih matične stanice (stMSCs) transfektirane s pDsRed-Hyg-C1 plazmida koji izražava crveni fluorescentni protein [21]. Stanice su uzgojene pomoću HyClone DMEM medij kulture dopunjen s 10-15% fetalnog telećeg seruma i 1% penicilin-streptomicina u normalnim uvjetima. MSC uzgojene za liječenje su nasađene u 6 jažica i ostavljeni da rastu do 70-80% -tne konfluencije u normalnim mediju a zatim izgladnjuju preko noći. Nakon ekspanzije kulture miša multipotentnim mezenhimalnog strome Cell Marker protutijela ploča se koristi za označavanje MSC stanične linije za Sca-1, CD106, CD 105, CD73, CD29, CD44 i hematopoetskih markera CD45 i CD 11 (R &D Systems, SC018). Stanice su suspendirane pri koncentraciji od 1 x 10 ^{6 stanica /ml i obojene u skladu s uputama proizvođača. Stanice su zatim inkubirane s AlexaFluor 488 na 1:100 razrjeđenja tijekom 30 minuta na 4 ° C. Fiksiranje je provedena tijekom 15 minuta na sobnoj temperaturi uz korištenje komercijalno dostupne reagensa (Invitrogen GAS001S5). Intenzitet fluorescencije je mjerena protočnom citometrijom korištenjem FACSalibur BD i CellQuestPro softver. wtMSCs i stMSCs su tretirani sa nosačem, rekombinantni mišji interferon gama (rmIFNγ, 100 nM, R &D Systems) ili anti-Shh antitijelo 5E1 (prethodno obrađene tijekom 6 sati) plus rmIFNγ 24 sata. Tretirane stanice su zatim analizirani su za promjene u staničnom ciklusu protočnom citometrijom. Pregled}

Sonic jež (Tiho) obaranje po lentivirusom posredovanog Kratki ukosnica RNA (shRNA) pomoću stMSCs

RFP-označene stMSCs su prenesen s pet različitih klonova MISIJA lentivirusni sstanično čestica koje sadrže različite nizove shRNA za SHH i pLKO.1-puro komponenta donose otpornost puromicinskom (Sigma Aldrich). RFP-označeni stMSCs su inkubirani s lentivirusni čestica ExpressMag magnetske kuglice (Sigma Aldrich) na magnet (Oz Biosciences Super magnetske ploče MF10000) tijekom 15 minuta, stanice se ukloni od magneta i inkubirane daljnjih 16 sati, a zatim stavi pod izbor puromicin (DMEM mediju za kulturu, koji sadržava 10% fetalnog telećeg seruma, 1% penicilin /streptomicina, 10 ug /ml puromicina) tijekom 7 do 10 dana. Efektivna doza puromicin potrebno eliminirati ne-transducirati stanice prethodno određena je krivulja puromicin ubijanja koji testiranim koncentracijama od 0 do 50 ug /mL (podaci nisu prikazani). Transduced stanice su obilježeni jedinstvenim klon JMBG sa staničnim linijama prenosio s shRNA za SHH (stMSC ^{ShhKO) brojevima 59-63. PLKO.1-puro vektor prenesen RFP-MSC stanične linije (stMSC vect) poslužila je kao kontrola za endogene razine ekspresije Psst gena. Western blot analiza je korištena za potvrdu SHH obaranje i RFP izraz. Pregled}

Transformacija wtMSCs da Over-express Psst pregled

plazmid (Origene CW101340) se pomiješa s Origene Turbofectin reagensa u omjerima 0 :1, 1:01, 02:01, 03:01 i 04:01 i inkubira 15 minuta na sobnoj temperaturi. Transfekcijski reagens se dodaje kap po kap u wtMSCs pri 70% konfluencije i ostavi inkubirati 24 sata prije stanice su stavljene pod selekcijom u normalnom mediju s puromicinom. Efektivna doza puromicin potrebno eliminirati Ne-transfektirane stanice prethodno određena je puromicin klanje koncentracijama ispitnih krivulja od 0 do 10 ug /mL (podaci nisu prikazani). Najniža koncentracija koja je ubila sve Netransfecirane stanica na 3-4 dana nakon tretmana je osnovana kao 2 g /ml. Pregled

In vivo stMSC Regrutiranje i proliferacije pregled

C57BL /6 miševa transplantirani su 1 × 10 ^{6 wtMSCs, wtMSCs Tiho, stMSCs vect ili stMSCs ShhKO repne vene injekcije. Tri dana nakon presađivanja, miševima je injektiran nosač (sterilnom PBS, i.p.) ili rmIFNγ (1 ug /dan, i.p.) 7 i 21 dana. Miševi su primili injekciju od 200 ul označavanje BrdU dionica reagens (5-bromo-2-deoksi uridinom i Detection Kit II, Roche Diagnostics, ip) 24 sata prije analize, a dijelovi želuca fiksirani u 4% formaldehidom, parafin uklopljenih i 3 uM sekcije pripremili za imunohistokemijski i analize imunofluorescencija. Cijeli koštana srž također je izolirana iz femuri istog miša PBS ispiranje. Crvene krvne stanice su lizirane korištenjem lizu crvenih krvnih zrnaca pufera (4,14 g NH _{4Cl, 0,5 g KHCO 3, 0,5 M EDTA u 500 ml, pH 7.2-7,4). Približno 11 × 10 6 stanice su fiksirane i natopljeni koristeći Caltag Laboratories protočna citometrija Kit, prema uputama proizvođača (Invitrogen, PLIN-004) i obojeni pomoću anti-RFP FITC-konjugirana protutijela (1:100, Abcam, ab34764 ), a zatim obojeni pomoću Vybrant DyeCycle Ruby mrlja (Invitrogen) prema uputama proizvođača. Fluorescencija je analiziran pomoću BD LSRII protočnom citometru sustava. Analizirati specifično RFP-MSC, gating korišten je za analizu staničnog ciklusa od samo FITC pozitivnih stanica. Masa fluorescencija je analiziran ModFitLT software za određivanje postotka populacije u svakoj fazi staničnog ciklusa. Pregled}}

Tekuća citometrija i Cell Cycle analiza pregled

Stanice su serum izgladnjele 16 sati prije analize , Stanice su fiksirane s ledeno hladnim 70% etanolom /PBS tijekom 15 minuta na -20 ° C, isprane, a zatim bojaju s propidij jodidom kroz 45 minuta. Izmjerene vrijednosti vršne fluorescencije po ukupnom broju stanica dobiveni su korištenjem programa CellQuest Pro (Becton Dickson). Postotak stanica iz populacije u svakoj fazi staničnog ciklusa je izračunat iz mjerenja fluorescencije masa kroz analizu s ModFit LT softverom. Protočna citometrija pomoću FACSCalibur ™ sustav (Becton Dickson) je izvedena na svim prenosio stanica pomoću miša multipotentnih mczcnhimnog matičnih stanica Marker protutijela ploča prema proizvođačima protokola (R &D Systems, SC018).

imunoprecipitaciji i zapadnim blot analiza pregled

Stanični lizati pripremljeni su korištenjem M po ekstrakciju proteina reagens za sisavce (Thermo Scientific, IL), uz dodatak inhibitora proteaze (Roche) prema uputama proizvođača. Uzorci medija iz stanice koncentriraju pomoću 15 ml amicon Ultra centrifugalne Uređaji za filtriranje (Millipore). Stanični lizati (100 ug ukupnog proteina) i medij je imunoprecipitiran pomoću anti-Shh 5E1 antitijelo (2 ug) pri 4 ° C tijekom 16 sati. Protein A /G zrnca agaroze doda se (20 ml, Santa Cruz Biotechnology, CA) i uzorci inkubirani na 4 ° C tijekom 16 sati. Nakon 16 sata inkubacije, Imunoprecipitati su isprane 3 puta koristeći PBS i resuspendirane u 40 ul Laemmli puferu za punjenje koji sadrži beta-merkaptoetanola (Bio-Rad Laboratories, CA) prije stavljanja na 4-20% tris-glicin gradijentom gelovi. Gelovi su na 80 V, 3.5 sati, protein prenesu na nitrocelulozne membrane u 105 V, 1-2 sata, i zatim su blokirane 1 sat na sobnoj temperaturi uz KPL detektor blok (Kirkegaard &Perry Laboratories, Inc.). Membrane su inkubirane preko noći na 4 ° C s 1:200 razrjeđenje shh antitijela (N-19, Santa Cruz), i zatim se inkubira 1 sat s 1:100 razrjeđenje AlexaFluor anti-kozjim 680 (Invitrogen). Mrlje su snimljene pomoću skeniranja denzitometra uz softver za analizu (Odyssey Infrared Imaging Software System). Pregled

RNA i RT-PCR pregled

Ukupna RNA je izolirana iz želuca tkiva pomoću Trizol reagensa prema proizvođači protokol (TriReagent Molecular Research Center, Inc.). Visoki kapacitet cDNA reverznom transkripcijom Kit (Applied Biosystems) se koristi za sintezu cDNA iz RNA slijedećem preporučenom protokolu. Za svaki uzorak, 60 ng RNA je reverzibilno prepisana, čime se dobije približno 2 ug ukupne cDNA koja se potom koristi za RT-PCR. RFP nizovi primera korištene su kako slijedi: NAPRIJED -5 'CCC CGT AAT OKS GAA GAA GA 3', UNAZAD -5 'CTT GGC CAT GTA GGT GGT CT 3'. PCR amplifikacije provedene su u ukupnom volumenu od 20 ul, koji sadrži pufer, 20 mM napredne i reverzne početnice, Taq polimeraze RNaza-slobodne vode i cDNA predloška. Svaki PCR amplifikacija je provedena u duplikatu u GeneAmp PCR sustavu 9700 termocikleru (Applied Biosystems), upotrebom sljedećih uvjeta: 94 ° C 3 min, 94 ° C 30 sekundi, 60 ° C 1 minutu i 72 ° C 1 minuta na 35 ciklusi. PCR produkti su vizualizirani s 1,5% agaroza TAE gelu. Pregled

Imunohistokemija pregled

Miševi su injektirani sa 200 ul označavanje BrdU dionicama reagensom (5-brom-2'-deoksi-uridin označavanje i otkrivanje kit II, Roche Diagnostics) 24 sata prije analize. Želučani tkiva su fiksirani s Carnoy je fiksativa (60 ml etanola, 30 ml kloroforma, 10 ml octene kiseline) 16 sati, uklopljeno u parafin, te su pripravljeni Sekcije od 4 um. Nakon deparaffinization, dohvat antigen je provedena zagrijavanjem slajdove za 10 minuta na 100 ° C u 0.01 M puferu natrijevog citrata (antigen razotkriva Solution, Vector Laboratories, Burlingame, CA). Aktivnost endogene peroksidaze je zatim blokirana inkubacijom preparata u 3% vodikovog peroksida /etanol dodatnih 20 minuta. Sekcije su zatim blokirane sa 5% BSA /Tris puferirana slana otopina /0,1% Tween 80 (TBS-T) i inkubirane sa 1:20 razrjeđenja anti-BrdU antitijelima (5-brom-2'-deoksi-uridin označavanje i detekcije Kit II, Roche Diagnostics), na 37 ° C tijekom 30 minuta. BrdU Razvoj boje se izvesti prema protokolu proizvođača. Sekcije su zatim blokirane s 20% normalnom kozjem serumu tijekom 20 minuta i potom inkubiraene sa 1:400 razrjeđenje biotin-konjugiranom anti-RFP protutijela (Abcam, ab34771) tijekom 16 sati na 4 ° C, nakon čega slijedi 1:500 razrjeđenja anti zečji IgG tijekom 30 minuta i tada vizualizirati s avidin-biotin kompleksa pomoću Vectastain Elite ABC Kit, uz primjenu diaminobenzidin (DAB) kao supstrata (Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA). Stakalca su montirani pomoću pokrovnim staklom. Pregled

Za indukciju adipocita, stMSCs se tretira sa Hyclone DMEM containing10 ^{8 M deksametazon (Sigma, D4902) i 5 ug /ml inzulina (Sigma, I6634). Sve stanice su fiksirane pomoću 4% -tni formaldehid 20 minuta na sobnoj temperaturi. Detektirati diferencijaciju, Oil Red O bojenje provedeno je dodatkom 3,75% -tne otopine Oil Red O, inkubiranjem 5 minuta na sobnoj temperaturi, zatim isprana vodom prije postavljanja na predmetna stakalca korištenjem Vectashield HardSet montažne medij. Slike su pregledani i zarobljeni pod svjetlosnim mikroskopom korištenjem Olympus BX60 s Dijagnostički instrumenti "spot" kamere. Pregled}

Imunofluorescencija pregled

stMSC ^{vect i stMSC ShhKO stanice su uzgajane na pokrovnim do 70-80% pokrivenosti, fiksirane s 4% paraformaldehidom tijekom 30 minuta na sobnoj temperaturi, permeabilizirane u PBS koji sadrži 0,5% TritonX-100 i blokirane sa 2% seruma magaraca 1 sat na sobnoj temperaturi. Stanice su zatim inkubirane s bilo 1:50 razrjeđenja anti-CD44 (Abcam ab65829) ili 1:100 razrjeđenja anti-CD45 (Abcam ab10558) antitijelima preko noći pri 4 ° C. Alexa Fluor magareći anti-zečji 488 je korišten kao sekundarno antitijelo na 1:1000 razrjeđenju 1 sat na sobnoj temperaturi. Stanice su zatim bile prebrojane s 1:2000 razrjeđenje nuklearne mrlja TO-PRO 3-jodid (Invitrogen, T3605), tijekom 20 minuta na sobnoj temperaturi prije montaže pomoću Vectashield HardSet Montaža medij. Zečji IgG je korišten u 1:25 razrjeđenje je kao negativna kontrola, pod istim uvjetima. Pregled}

želuca sekcije prikupljeni PBS IFNy tretiranih miševa su blokirane s 20% normalnom kozjem serumu i inkubirane s anti-1:400 RFP antitijela (Abcam, ab34771) tijekom 16 sati na 4 ° C, nakon čega slijedi 1:100 antizečjeg Alexa Fluor 488 (Invitrogen) sekundarnim protutijelom još 1 sat. Stakalca su potom prebrojane koristeći anti-E-kadherin (BD Transduction Labs, 610181), antitijela na 1:200 razrjeđenje 1 sat pri sobnoj temperaturi i zatim 1:100 anti-mišjim Alexa Fluor 633 (Invitrogen) drugog antitijela. Svi uzorci su montirani pomoću Vectashield Hardset Montaža mediju (VectaLabs). Slike su dobiveni upotrebom Zeiss LSM510 META konfokalnog mikroskopa. Pregled

kemotaksije Test pregled

Test kemotaksije je provedeno na temelju utvrđenih protokola [22]. Transduced stMSCs su stavljene u 24 i transjažična pločama koje sadrže PET membrane sa 8 um porama (BD Falcon). 2,5 x 10 ^{4 stanice su posađene u apikalnom (gornje) komore u DMEM mediju koji sadrži 0.1% BSA. SDF-1α (rmSDF-1α, R &D Systems) doda se bazolateralne (niži) komore u koncentracijama od 0 do 150 ng /ml. Stanice su inkubirane 6 sati na 37 ° C. Nakon migracije, stanice su fiksirane u 4% paraformaldehidu tokom 30 minuta, zatim su obojene tijekom 10 minuta pomoću Wright-Giemsa mrlju. Stanice su se zadržale na vrhu membrane su skinute s aplikatorom pamučni vrhom i Preostale stanice su prebrojane u 5 polja na 40 × povećanjem. Broj migracije stanica izračunat je dijeljenjem prosječan broj migraciju stanica u svakoj dobro s prosječnim brojem migraciju stanica u kontroli dobro. Pregled}

Statistička analiza pregled

Rezultati su analizirani pomoću bilo studenta pojedinačna t-test ili analiza varijance pomoću komercijalno dostupnog softvera (GraphPad Prism, GraphPad Software, San Diego, CA). P pregled vrijednost < 0.05 je smatrana značajnom pregled

Rezultati

IFNy izazvanu stMSC proliferacije posredovan je SHH i lučenje Signalizacija pregled

ulogu. hedgehog signaliziranje medijator IFNy induciranog stMSC i wtMSC proliferacije identificiran pomoću protočne citometrije i napredovanja staničnog ciklusa. Nakon tretmana, stanice su obojene s propidij jodidom i staničnog ciklusa analizirane protočnom citometrijom na odabranom populacije stanica jednu (Slika S1A). Slika 1 prikazuje srednje vrijednosti za distribuciju ćelija postotka u različitim fazama staničnog ciklusa u tretiranim skupinama prikazanim na slikama S1B-E. Slike S1B-E predstavljaju krivulje koje prikazuju promjene u fazama staničnog ciklusa. Srednje vrijednosti i statistička značajnost u odgovoru na sve tretmane sumarno prikazane na slici S1F i G. Analiza podataka iz sirove fluorescencije pokazali povećani udio stMSCs u S fazu i G _{2 /M fazi, a smanjeni postotak stanica u G 0 /G 1 faza, kao odgovor na rmIFNγ usporedbi sa stanicama na koje su tretirane nosačem (Slika 1A). Identificirati ulogu u izlučevinama shh medijator IFNy induciranog stMSC proliferacije koristili smo anti-Hedgehog neutralizaciju 5E1 monoklonsko antitijelo koje se veže na Pst liganda i ometa protein vezanja na receptor PTCH [1]. Proliferacijski odgovor stMSCs do rmIFNγ bila značajno inhibirana s obradom 5E1 protutijela (Slika 1A). U odnosu na stMSCs, non-transformirane wtMSCs odgovorio na sličan način kao odgovor na IFNy sugerirajući uočeni porast proliferacije nije bio rezultat transformacije na miru. IFNy značajno inducira postotak wtMSCs u S fazi, odgovor je bio blokiran od strane anti-SHH antitijela (Slika 1B). Kolektivno, Slika 1 pokazuje da IFNy potiče proliferaciju oba netransformiranim i spontano transformiraju MSC, odgovor koji je posredovano sa izlučevinama Ššš. Pregled}

Ušutkavanje SHH gena unutar dobiveni iz koštane srži stMSCs

Za potpunije proučavanje uloge jež signalizacija u proliferaciji BM-MSC i zapošljavanje in vivo pregled, wtMSCs su transfektirane na preko-express Psst dok stMSCs su transduced s lentiviralnih shRNAs protiv Ššš. Korištena je pLKO.1-puro baza lentivirusni vektor izražavanja kratkom ukosnica slijed protiv transkript gena Ššš. Kontrola MSC stanične linije su postavljene pomoću wtMSC s endogenim izrazom SHH i transfekcijom stMSCs s pLKO.1-puro baza lentivirusnim vektor (stMSC ^{vect). Pet lentivirasni klonovi, svaki klon izražavanja drugačiji kratki ukosnica slijed, analizirani su (stMSC ShhKO59-stMSC ShhKO63). Obaranje Tiho je potvrđeno Western blot analizom koja je pokazala 100% obaranje SHH ekspresiju proteina u svim klonova u odnosu na untransduced stanice (wtMSCs) i SHH pretjerano izražavanje stanične linije (wtMSC Tiho i stMSC vect) ( Slika S2A). Klon stMSC ShhKO59 je korišten za daljnje eksperimente, te će biti upućeni kao stMSC ShhKO. Izražavanje pDsRed-Hyg-C1 plazmida koji izražava crveni fluorescentni protein (RFP) potvrdila je imunoblot koristeći stanični lizat prikupljene od prenosio stMSCs (Slika S2A). Važno je, wtMSCs stabilno prenesen je u više-express Tiho proteina, izražena SHH na razinu sličnu onoj u stMSCs (Slika S2A). Pregled}

Da biste provjerili obaranje SHH u MSC bez promjene diferencijaciju stanica, izraz uzorak za klasične CD markera (CD29, CD106, CD 105, CD44 i CD73) i Sca-1 pomoću tekućom citometrijom je izvedena pomoću kulturan stMSC ^{vect (Slika S2B) i stMSC ShhKO (Slika S2C) stanica. Oba stMSC vect i stMSC ShhKO stanice su negativni za CD45 (Slika S3). Dodatno tome, oba stMSC stanične linije su sposobne diferencirati se na adipocita fenotip na temelju pozitivne Oil Red O bojenje masnih kapljica proizvodi (Slika S3). Zajedno, ovi podaci ukazuju na to da obaranje SHH proteina u stMSCs nije promijenio diferencijacije ovih stanica. Pregled}

IFNy inducira proliferacije wtMSCs i stMSCs u koštanoj srži Netlogu

Da bi se odredio učinak IFNy na wtMSC i stMSC proliferacija in vivo pregled, miševi su transplantirani RFP-tagged wtMSC, wtMCS ^{SHH, stMSC vect ili stMSC ShhKO stanice i pomiješa se s rmIFNγ za 21 dana. Nakon IFNy tretmana, koštana srž je sakupljen i analiziran na promjene u stanični ciklus i broj RFP-pozitivne stanice protočnom citometrijom. IFNy izazvana značajan porast broja RFP pozitivnih stanica u koštanoj srži svih eksperimentalnih skupina, osim onih životinja transplantiranih s stMSC ShhKO stanice (slika 2a, b). Imunofluorescencija koštane srži pokazala je da postoji značajan porast posebno broja proliferirajućih RFP pozitivnih stanica u odgovoru na IFNy kao ko-lokalizira BrdU imunološkim (Slika 2C, D). To je dodatno podržano na slici S4A, B i C koji prikazuje reprezentativni svjetlo raspršiti analiza otkriva stanovnika stMSCs koji su bili pozitivni na RFP i čini otprilike 0,1% ukupnog stanovništva koštane srži stanica. RFP-pozitivne stanice su usmjernika za jednu populacije stanica (Slika S4C) i staničnog ciklusa analizira. Stanice se prikupljaju iz koštane srži miševa transplantiranih s stMSC vect stanice obrađene rmIFNγ imali značajno veći postotak stanica u S-fazi (55,5 ± 2,82%) u odnosu na one kod miševa tretiranih s PBS (32,9 ± 5,14%, P pregled < 0.05 u usporedbi sa stMSC vect transplantiranih miševa koji su tretirani s PBS-om) (Slika S4F). Postotak stanica u S-fazi prikupljeni iz koštane srži miševa transplantiranih s stMSC ShhKO tretirana s rmIFNγ nisu bile značajno različite (32,9 ± 2,64%) u odnosu na one kod miševa tretiranih s PBS (38,4 ± 1,47%, P pregled i 0,05 u odnosu na stMSC ShhKO transplantiranih miševa koji su tretirani s PBS-om) (Slika S4I). Slike S4D, E, G i H predstavljaju krivulje koje prikazuju promjene u fazama staničnog ciklusa. Dakle, IFNy potiče proliferaciju oba wtMSCs i stMSCs In vivo pregled u koštanoj srži, odgovor koji se pojavljuje da su posredovane Psst signalizaciju. Pregled}

In vivo pregled Zapošljavanje wtMSCs i stMSCs na želučane sluznice, kao odgovor na IFNy Netlogu

kako prepoznati ulogu jež signalizaciju kao posrednik IFNy-inducirane stMSC zapošljavanja na želučanu epitela, miševi transplantirani stMSC ^{vect i stMSC ShhKO stanice su tretirane s PBS ili IFNy za 21 dana. Želuci se skupi, zapošljavanje RFP-tagged stMSC vect i stMSC ShhKO stanice analizirani su imunohistokemijski (Slika 3). stMSC vect stanice su regrutirani za želučane sluznice miševa kojima je ubrizgan IFNy (Slika 3C, D) u odnosu na nepostojanje RFP-tagged stMSC vect stanica u želucima injiciran PBS miševa (Slika 3a, b ). stMSC ShhKO stanice transplantirane u miševa kojima je injektiran IFNy nisu regrutirani na želučanu sluznicu (Slika 3E, F). Izražavanje RFP-tagged stMSC vect stanice s IFNy liječenja je potvrđena pomoću RT-PCR (Slika 3G). Kako prepoznati da li zapošljavanje MSC na želučane sluznice kao odgovor na IFNy bila jedinstvena za stMSCs, eksperiment je ponovljen koristeći ili wtMSCs ili wtMSCs pretjerano izražavanje SHH (wtMSC Tiho). Iako su obje wtMSC i wtMSC SHH stanice detektirane su u želucima tretiranih IFNy-miševa, bilo je značajno veće brojeve wtMSC Tiho i stMSC vect stanica u sluznici želuca u odnosu na wtMSC stanice transplantirane skupina (Slika 3 H). Zajedno, ovi podaci ukazuju na to da Psst signalizacija je vjerojatno da posreduje zapošljavanje MSC na želučane sluznice kao odgovor na IFNy. Pregled}

Bilo je i značajan porast broja proliferacijom stanica u sluznici želuca, kao odgovor na IFNy tretiranih wtMSC ^{Shh i stMSC vect transplantiranih miševa u usporedbi s miševima kojima je injiciran PBS (Slika 4A-D, slika S5-F). Međutim, MSC su BrdU negativni (Slika 4B, C i Slika S5-D). Iako stMSC ShhKO stanice transplantirane u miševe kojima je ubrizgan IFNy nisu bili regrutirani na želučanu sluznicu, nije bilo razlika u epitelnim proliferacije između PBS i IFNy tretmana u ovoj eksperimentalnoj skupini, što upućuje na povećanu MSC-izvedenu SHH može biti potrebna kako bi podržao ovu povećana proliferacija (slika 4D). Nadalje, iako se wtMSCs regrutirani na želučanu sluznicu kao odgovor na IFNy, nije bilo razlike u epitelni proliferaciji između PBS i IFNy obrade (slika 4D). Ovi podaci ukazuju na to da Psst signalizacija unutar wtMSCs SHH i stMSCs odgovor na IFNy potiče proliferaciju unutar želuca epitela. IFNy sam, u nedostatku stMSCs, ne izazivaju proliferaciju u sluznici želuca potvrđuje taj efekt se ne odnose na same upale. Pregled}

Kako bi se utvrdilo je li smanjena stMSC proliferaciju, nakon zapošljavanja, bio je povezan s adhezijom stanica unutar želučani epitel, želuci su tada ko-bojane E-kadherina i RFP (Slika 4G-i). PBS-tretiranih miševa koje su transplantirane u RFP označeni stMSC ^{vect stanice nisu pokazivale regrutiranje stanica sluznice želuca (Slika 4G). Skladu sa slike 3, IFNy miševima kojima je injicirano koje su transplantirane u RFP označeni stMSC vect stanice pokazuju znatno regrutiranje stanica na želučanu sluznicu (Slika 4H). RFP-tagged stMSC Vect stanice lokalizirani sa E-kadherina (Slika 4G, ja) koji podržavaju da unovačeni stanice su presađenih unutar želuca epitela. Pregled}

Jež Signalizacija posredovanje u Iskazivanje Focal adhezija protein u odgovoru na SDF-1 a kemokin Netlogu

odlučili smo istražiti SDF-1α /CXCR4 os prijenosa signala, kao što je utvrđeno da je ovaj signalni put promovira MSC zapošljavanje [23], [24].

• PLoS ONE: Neočekivani Bezglavi i bezrep Riba u želucu od Shortfin Mako Isurus oxyrinchus
• PLoS ONE: bubojed Šišmiši Digest hitin u želucu upotrebom kiselih sisavaca Chitinase