Ploche ONE: Sonic Hedgehog sprostredkováva proliferáciu a nábor transformovaných mezenchymálnych kmeňových buniek do žalúdka

abstraktné

Štúdie využívajúce Helicobacter
-infected myšiach ukázali, že kostnej drene odvodené z mezenchýme kmeňové bunky (MSCS) môžu osídliť žalúdočné epitel a podporovať žalúdočné progresiu rakoviny. V mikroprostredie nádoru žalúdka, pre-zápalový cytokín interferón-gama (IFNy) a Sonic hedgehog (Pst) sú zvýšené. IFNy sa podieľa na proliferáciu nádoru prostredníctvom aktivácie Psst signálne dráhy v rôznych tkanivách, ale či sa jedná o podobný mechanizmus v žalúdku, je známy. Testovali sme hypotézu, že IFNy riadi proliferáciu a náboru MSC, je odpoveď sprostredkovanú SHH signalizáciou. Táto štúdia využíva transplantáciu in vitro
transformovaná mezenchymálnych kmeňových buniek línie (stMSC ^{VECT), ktoré by presahovali vyjadruje ježko signalizácie, v porovnaní s MSC netransformovaných divokého typu (wtMSCs), wtMSCs transfekovány na viac ako-express SHH (wtMSC SHH) a stMSCs transdukovány lentivirových konštrukty, ktoré obsahujú zhrnie mieriť na SHH gén (stMSC ShhKO). Účinok IFNT na MSC proliferácia bola hodnotená pomocou analýzy bunkového cyklu in vitro
použitie buniek ošetrených rekombinantným IFNT (rmIFNγ) samostatne, alebo v kombinácii s anti-SHH 5E1 protilátka, a in vivo
pomocou myši s transplantovanými MSC liečených PBS alebo rmIFNγ. In vitro
, IFNy významne zvýšil MSC proliferácie, odozva sprostredkovaná SHH, ktorá bola zablokovaná 5E1 protilátkou. Populácia MSC zhromaždené z kostnej drene PBS- alebo IFNy-ošetrených myší ukázala, že IFNy významne zvýšilo percento všetkých bunkových línií MSC v S-fáze, s výnimkou stMSCs ShhKO buniek. Kým bunkové línie MSC s neporušeným Psst expresiou boli prijatí do žalúdočnej sliznice v reakcii na IFNy, stMSCs ShhKO neboli. Hedgehog signalizácia je pre proliferáciu MSC a nábor do žalúdka v reakcii na IFNr potrebná}

Citácia :. Donnelly JM, Chawla A, J Houghton, Zavros Y (2013) Sonic Hedgehog sprostredkováva proliferáciu a nábor transformovaného mezenchymálnych Stem bunky do žalúdka. PLoS ONE 8 (9): e75225. doi: 10,1371 /journal.pone.0075225

Strih: Jorge Sans Burns, Fakultnej nemocnice v Modene a Reggio Emilia, Taliansko

prijatá: 24. januára 2013; Prijaté: 14 augusta 2013; Uverejnené: 19.Septembra 2013

Copyright: © 2013 Donnelly et al. Toto je článok o otvorený prístup distribuovaný pod podmienkami Creative Commons Attribution licencie, ktorá umožňuje neobmedzené použitie, distribúciu a reprodukciu v nejakom médiu, za predpokladu, že pôvodný autor a zdroj sú pripísané

Financovanie :. Toto dielo bol podporený American Cancer Society Research Scholar Award 119072-RSG-10-167-01-MPC (Y. Zavros), Albert J. Ryan Foundation Fellowship (J. Donnelly) a čiastočne zažívacím zdravotné centrum Cincinnati Detské zdravotnícke zdravotníctva Center (DHC: Lavička na Bedside Research in detské choroby tráviacej) CHTF /SUB DK078392. Autori by radi poďakovali pomoc Monica odkladu manažér pre výskum prietokovej cytometrie jadra v divízii reumatológie v Cincinnati detská nemocnica Medical Center, podporovaný z časti National Institutes of Health (NIH) AR-47363. Všetky prietokovej cytometrie údaje boli získané za použitia zariadenia vedeného Research prietokovej cytometrie jadrom v divízii reumatológie v Cincinnati detská nemocnica Medical Center, podporovaný z časti NIH AR-47363. Platcovia mal žiadnu úlohu v dizajne štúdie, zber a analýzu dát, rozhodnutie publikovať, alebo prípravu rukopisu

Konkurenčné záujmy: .. Autori vyhlásili, že žiadne konkurenčné záujmy neexistujú

Úvod

je tu jasne stanovená úloha Sonic ježko (SHH) signalizácia v rozvoju rakoviny [1], [2], [3]. Rast buniek v nádoru tráviaceho traktu, ktoré zahŕňajú pažeráka, žalúdka, žlčových ciest a pankreasu sú regulované endogénnej expresie Hedgehog ligandov, ako SHH [1]. Väzba ježko ligandu na jeho receptor, záplatovaný (PTCH), má za následok odstránenie inhibícia PTCH na vyhladené (SMO). Toto odstránenie inhibícia na Smo má za následok aktiváciu Gli-rodiny transkripčných faktorov Hedgehog a následne rast nádorov, ktoré môžu byť blokované Hedgehog neutralizačných protilátok [1]. Pričom spojenie medzi Psst a rakovinou žalúdka, je jasné, funkčné role SHH v rozvoji a progresii rakoviny žalúdka, je do značnej miery neznámy. Okrem toho je mechanizmus, ktorý reguluje produkciu SHH v mikroprostredie nádoru je potrebné ešte určiť.

Helicobacter pylori (H. pylori)
bakteriálnej kolonizácie spôsobuje chronický zápal, ktorý je trvalo spojená s progresie do karcinómu žalúdka [4]. Najbežnejšie a poškodzuje imunitnú odpoveď zahŕňa Th1 pre-zápalové cytokíny, najvýznamnejšie IFNy z T-buniek, a IL-1 a TNFa z tkaniva alebo napadajúce makrofágy [5], [6], [7], [8], [ ,,,0],9]. V skutočnosti, pre-zápalový cytokín IFNy bolo preukázané, že prispieva k patogenéze a vývoji žalúdočných metaplázia [5], [9], [10] a rakoviny [10]. V rakovín zápalom indukované, the Hedgehog signálna dráha sprostredkováva [12], [13] IFNy indukovanú nádorom rozvoja [11]. Najmä Pst je cieľový gén IFNy a ježko signalizácia mediátor IFNy-indukovanej proliferácie [12].

V Helicobacter
infekcie, chronické zápaly zhoduje s náborom kostnej drene odvodené mezenchýmových kmeňové bunky (BM-MSC) [14], [15]. V chronicky zápal žalúdka BM-MSC sa regrutujú z kostnej drene do žalúdka a diferencovať do rakovinou asociovaných fibroblastov (CAFS), slúžiaci na riadenie vývoja rakoviny [14]. Aj keď zrejme podieľa na rozvoji rakoviny žalúdka, mechanizmus regulácie proliferácie a nábor zhubne transformovanej BM-MSC do žalúdka v priebehu chronického zápalu, je do značnej miery neznámy. Je zaujímavé, že Pst je hlásená indukcia proliferácie a diferenciácie BM-MSC [16]. Pst tiež bol uznaný ako potenciálny chemoatraktant pre bunky kostnej drene odvodené pri up-regulované v reakcii na chronický zápal [17], [18].

o pridružení medzi IFNy a SHH, sme hypotézu, že IFNy indukuje Psst signalizácia v MSC, ktoré uľahčujú migráciu buniek do žalúdka. Pre testovanie tejto hypotézy, súčasná štúdia porovnáva in vivo
BM-MSC náboru žalúdočnej sliznice v reakcii na IFNy pomocou spontánne transformovanú mezenchymálnych kmeňových buniek línie (stMSC) v porovnaní s netransformované BM-MSC. V oblasti kultúry, BM-MSC sú náchylné k mutácii so starnutím a vykazujú klinicky relevantných mutácií v géne p53 [19]. Vďaka dlhodobej kultúry BM-MSC "spontánne transformáciu" (stMSCs), môžu byť propagované in vitro po dlhú dobu a vykazujú fenotyp rakovinu-podporovať [19]. Súčasná štúdia používa ako stMSCs a netransformovaných BM-MSCS (wtMSCs), ktoré nadmerne exprimuje Ježek signalizáciu. Použitie bunkových línií wtMSC a stMSC obaja in vivo stroje a in vitro
sme ukazujú, že IFNy indukovanú proliferáciu a nábor MSC bunkových línií do žalúdka je odpoveď, ktorá je sprostredkovaná SHH sekrécie a signalizácia.

materiály a metódy

Zvieratá

C57BL /6 (kmeň�664) a IRG (kmeň705) myší používaných na tieto štúdie boli zakúpené z Jackson laboratória. Všetky štúdie myší boli schválené na University of Cincinnati ústavnej zvierat starostlivosť a používanie výboru (IACUC), ktorá udržuje Americkej asociácie pre posudzovanie a akreditáciu laboratórnych zvierat starostlivosť (AAALAC) zariadenia.

kostnej drene odvodené od Spontánne Transformované mezenchymálnych kmeňové bunky (stMSC) a Non-transformovanej BM-MSC (wtMSC) Kultúra a Ošetrenie

bunkové línie wtMSC boli založené z celého kostnej drene IRG myšou a kultivované do priechodu 5 pred transfekcia s následnú údržbu pri nízkych číslo priechod (< P10) pred experimentálnym využitie. Celá kostná dreň bola vyprázdnená z stehennej a holennej kosti myší pre následné kultúry a priechodu plastového priľnavého MSC populácie [20]. Spontánne transformovanej kostnej drene odvodené mezenchýme kmeňové bunky (stMSCs) transfekované s pDsRed-hyg-C1 plazmidom exprimujúcim červený fluorescenčný proteín, boli použité [21]. Všetky bunky boli kultivované za použitia HyClone DMEM kultivačného média doplneného 10 až 15% fetálne teľacie sérum a 1% penicilín-streptomycín za normálnych podmienok. MSC kultivovaných na liečbu boli nanesené na 6-jamkové doštičky a nechali sa rásť na 70 až 80% zhlukovania v normálnom médiu a potom cez noc v bezsérovém. Po expanzii kultúry, myš multipotentní mezenchýme stromálne bunky Marker protilátka Panel bol použitý na označenie bunkových línií MSC pre Sca-1, CD106, CD105, CD73, CD29, CD44 a hematopoetických markerov CD45 a CD11b (R &D Systems, SC018). Bunky boli suspendované v koncentrácii 1 x 10 ^{6 buniek /ml a lakované podľa protokolu výrobcu. Bunky potom boli inkubované s AlexaFluor 488 v 1: 100 zriedenie po dobu 30 minút pri teplote 4 ° C. Fixácia sa vykonáva po dobu 15 minút pri teplote miestnosti s použitím komerčne dostupného reakčného činidla (Invitrogen GAS001S5). Intenzita fluorescencie bola meraná prietokovou cytometriou pomocou softvéru BD FACSCalibur a CellQuestPro. wtMSCs a stMSCs vehikulum, rekombinantný myší interferón gama (rmIFNγ, 100 nM, R &D Systems), alebo anti-Pst protilátka 5E1 (vopred ošetrené po dobu 6 hodín) a rmIFNγ po dobu 24 hodín. Ošetrené bunky potom boli analyzované na zmeny v bunkového cyklu pomocou prietokovej cytometrie.}

Sonic ježko (Pst) Knockdown podľa lentivirus sprostredkovanú Short vlásenka RNA (zhrnieme) pomocou stMSCs

RFP značené stMSCs boli transdukovaných s piatimi rôznymi klony Misia lentivirovým transdukcia častí obsahujúcich rôzne sekvencie zhrnieme pre SHH a pLKO.1-puro zložka udeľuje rezistenciu na puromycin (Sigma Aldrich). RFP-označených stMSCs boli inkubované s lentivirovými častíc s ExpressMag magnetických guľôčok (Sigma Aldrich) na magnet (Oz Biosciences Super magnetické dosky, MF10000) po dobu 15 minút, bunky sa odstráni z magnetu, inkubuje po dobu ďalších 16 hodín a potom sa umiestni do Voľba puromycin (DMEM kultivačné médium s obsahom 10% fetálneho teľacieho séra, 1% penicilín /streptomycín, 10 ug /ml puromycinu) počas 7 až 10 dní. Účinná puromycin dávka potrebná na odstránenie non-transdukovaných buniek bola stanovená vopred pomocou puromycin kill krivky, ktorá testovaných koncentráciách od 0 do 50 ug /ml (údaje nie sú uvedené). Transdukované bunky boli označené jedinečným identifikačným číslom klon s bunkových línií transdukovaných zhrnieme pre SHH (stMSC ^{ShhKO) očíslované 59-63. PLKO.1-Puro vektor transdukované bunkové línie RFP-MSC (stMSC Vect) slúžila ako kontrola pre endogénne úrovni génovej expresie SHH. Western blot analýza bola použitá na potvrdenie Psst vyraďujúce a RFP výraz.}

transfekcia wtMSCs so zvýšenou expresiou Pst

Plazmid (Origen CW101340) sa zmieša s činidlom v pomere 0 ORIGEN Turbofectin : 1, 01:01, 02:01, 03:01 a 04:01 a inkubované počas 15 minút pri teplote miestnosti. Transfekční činidlo sa potom pridá po kvapkách do wtMSCs pri 70% zhlukovania a nechá sa inkubovať po dobu 24 hodín predtým, ako boli bunky dané pod výberu v normálnom médiu s puromycinem. Účinná puromycin dávka potrebná na odstránenie non-transfekciou buniek stanovený vopred prostredníctvom koncentrácií testovacích krivka a puromycin dezaktivačných od 0 do 10 ug /ml (údaje nie sú uvedené). Najnižšia koncentrácia, ktorá zabila všetky netransfekované bunky pri 3-4 dní po ošetrení bola stanovená ako 2 ng /ml.

In vivo stMSC Nábor a proliferation

C57BL /6 myši boli transplantované s 1 × 10 ^{6 wtMSCs, wtMSCs Pst, stMSCs Vect alebo stMSCs ShhKO injekčne chvostovej žily. Tri dni po transplantácii boli myši injekčne nosič (sterilným PBS, i.p.) alebo rmIFNγ (1 ug /deň, i.p.) po dobu 7 a 21 dní. Myši boli injekčne 200 ul BrdU značenie stock činidlo (5-Bróm-2 -deoxy-uridín etiketovanie a Detection Kit II, Roche Diagnostics, ip) 24 hodín pred analýzou, a žalúdočné rezy fixované v 4% paraformaldehydu, parafínový zaliate a 3 uM sekcie pripravená pre imunohistochemické a imunofluorescencia analýzy. Celá kostnej drene bol tiež izolovaný z stehnovej kosti rovnakej myší s PBS splachovanie. Červené krvinky sa lyžovali za použitia lyzi červených krviniek vyrovnávacej pamäte (4,14 g NH _{4cl, 0,5 g hydrogenuhličitanu draselného 3, 0,5 M EDTA vo 500 ml, pH 7.2-7,4). Približne 11 x 10 6 boli bunky fixované a permeabilizovány pomocou Caltag Laboratories prietoková cytometria Kit, podľa protokolu výrobcu (Invitrogen, GAS-004) a zafarbené za použitia anti-RFP FITC-konjugovanou protilátkou (1: 100, abca, ab34764 ), a potom zafarbené za použitia Vybrant DyeCycle Ruby škvrnu (Invitrogen) podľa protokolu výrobcu. Fluorescencie bola analyzovaná s použitím systému BD LSRII prietokový cytometer. Analyzovať konkrétne RFP-MSCS, hradlovanie bol použitý na analýzu bunkového cyklu iba z pozitívnych buniek FITC. Vrchol fluorescencie bola analyzovaná pomocou softvéru ModFitLT určiť percento populácie v každej fáze bunkového cyklu.}}

prietokovej cytometrie a bunkový cyklus analýza

Bunky boli sérové ​​hladovanie na 16 hodín pred analýzou , Bunky boli fixované ľadového 70% etanolu /PBS počas 15 minút pri teplote -20 ° C, premyje sa a potom zafarbené propidiumjodidom po dobu 45 minút. Namerané hodnoty píku fluorescencie na celkový počet buniek boli získané za použitia programu CellQuest Pro (Becton Dickson). Percento buniek z populácie v každej fáze bunkového cyklu bola vypočítaná z meraní fluorescencie vrchol prostredníctvom analýzy so softvérom ModFit LT. Prietoková cytometria s použitím systému FACSCalibur ™ (Becton Dickson) bola vykonaná na všetkých transdukovaných buniek pomocou myši multipotentní mezenchýme kmeňové bunky Marker protilátok panel podľa protokolu výrobcu (R &D Systems, SC018).

Imunoprecipitácia a Western blot Analysis

Bunkové lyzáty boli pripravené za použitia M-per cicavčie proteín extrakcie činidlo (Thermo Scientific, IL) doplnený inhibítory proteázy (Roche) podľa protokolu výrobcu. Vzorky media z buniek boli koncentrované za použitia 15 ml Amicon Ultraodstředivé filtračné zariadenia (Millipore). Fragmenty buniek (100 ug celkového proteínu) a médiá boli imunoprecipitovány s použitím anti-Pst 5E1 protilátka (2 ug), pri teplote 4 ° C počas 16 hodín. /G agarosových guličiek Protein A bol pridaný (20 ul, Santa Cruz Biotechnology, CA) a vzorky inkubované pri 4 ° C počas 16 hodín. Po 16 hodine inkubácie, imunoprecipitáty boli 3krát premyté pomocou PBS a resuspendované v 40 ul Laemmli pufor obsahujúci beta-mercaptoetanolu (Bio-Rad Laboratories, CA) pred nanesením na 4 až 20% Tris-glycín géloch s gradientom. Gély boli prevádzané na 80 V, 3,5 hodiny, proteín prenesený na nitrocelulózové membrány pri 105 V, 1-2 hodiny, a potom blokované po dobu 1 hodiny pri teplote miestnosti za použitia detektora KPL Block (Kirkegaard &Perry Laboratories, Inc.). Membrány boli inkubované cez noc pri 4 ° C s 1: 200 riedenie Psst protilátky (N-19, Santa Cruz) a následne 1 hodinu inkubácie s 1: 100 riedením AlexaFluor anti-kozia 680 (Invitrogen). Škvrny boli zobrazené pomocou skenovacieho denzitometrom spolu so softvérom pre analýzu (Odyssey Infrared Imaging System Software).

Izolácia RNA a RT-PCR

Celková RNA bola izolovaná od žalúdka tkaniva pomocou TRIzolu činidla v závislosti na výrobcovia protokol (TriReagent, Molecular Research Center, Inc.). High Capacity cDNA reverznej transkripciou Kit (Applied Biosystems) bol použitý pre syntézu cDNA z RNA po odporúčaného protokolu. Pre každú vzorku, 60 ng RNA bola reverzne transkribovaných za zisku približne 2 ug celkovej cDNA, ktorá bola potom použitá pre RT-PCR. RFP sekvencie primérov boli nasledovné: FORWARD-5 'CCC AAT CGT GAA GCA GAA GA 3', reverzné -5 'CTT GGC GGT GGT CAT GTA CT 3'. PCR amplifikácie bola vykonávaná v celkovom objeme 20 ul, ktorý obsahuje pufer, 20 mM dopredu a reverzných primérov, polymerázy Taq, prosté RNázy vody a cDNA šablóny. Každý PCR amplifikácie bola vykonaná v duplicitných jamkách v GeneAmp PCR System 9700 termocykléra (Applied Biosystems), za nasledujúcich podmienok: 94 ° C po 3 minúty, 94 ° C počas 30 sekúnd, 60 ° C 1 minúta a 72 ° C 1 minúta na 35 cykly. PCR produkty boli vizualizované na 1,5% agarózovom géle TAE.

Imunohistochémia

Myšiam podali 200 ul BrdU značenie populácie činidlá (5-bróm-2'-deoxy-uridín značenie a detekcie kit II, Roche Diagnostics), 24 hodín pred analýzou. Žalúdočné tkanivá boli fixované Carnoy fixačnej tekutiny (60 ml etanolu, 30 ml chloroformu a 10 ml kyseliny octovej) po dobu 16 hodín, parafínu vložené a 4 um rezy boli pripravené. Po Deparafinizace, sprístupnenie antigénu bola vykonaná zahrievaním sklíčka po dobu 10 minút pri teplote 100 ° C v 0,01 M citrát sodný (Antigen odmaskovaniu riešenie, Vector Laboratories, Burlingame, CA). Endogénnej peroxidázy aktivita bola potom blokovaná inkubáciou sklíčok do 3% peroxidu vodíka /etanol po dobu ďalších 20 minút. Rezy potom boli blokované s použitím 5% BSA /fyziologickom roztoku pufrovanom Tris /0,1% Tween 80 (TBS-T) a inkubované s 1:20 riedením anti-BrdU protilátkou (5-bróm-2'-deoxy-uridín značenie a detekčné súpravy II, Roche Diagnostics) pri teplote 37 ° C počas 30 minút. Vývoj farby BrdU bola vykonaná podľa protokolu výrobcu. Rezy potom boli blokované s 20% normálnym kozím sére po dobu 20 minút a inkubované s 1: 400 riedenie biotínom konjugovaný anti-RFP protilátky (abca, ab34771) po dobu 16 hodín pri teplote 4 ° C a následne po 1: 500 riedenie anti králičie IgG po dobu 30 minút a potom vizualizované s avidín-biotín komplexov za použitia Vectastain ABC Kit Elitná pomocou Diaminobenzidine (DAB) ako substrátu (Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA). Sklíčka bola namontovaná pomocou Permount.

adipocytov indukciu stMSCs boli liečení Hyclone DMEM containing10 ^{-8 M dexametazónu (Sigma, D4902) a 5 ug /ml inzulínu (Sigma, I6634). Všetky bunky boli fixované 4% paraformaldehydom po dobu 20 minút pri teplote miestnosti. Pre detekciu diferenciácie, Oil Red O farbenia bolo vykonané pridaním 3,75% roztoku Oil Red O, inkubáciou 5 minút pri teplote miestnosti, potom sa praním vo vode pred montážou na sklíčka s použitím Vectashield HardSet zalievacie médium. Snímky boli videné a zachytil pod svetelným mikroskopom pomocou Olympus BX60 s kamerou diagnostických prístrojov "spot".}

Imunofluorescenčný

stMSC ^{Vect a stMSC ShhKO bunky boli pestované na krycie sklíčko až do 70-80% zhlukovania, fixované 4% paraformaldehydom po dobu 30 minút pri teplote miestnosti, permeabilizovaných s PBS obsahujúcim 0,5% TritonX-100 a blokované 2% somárov sérum po dobu 1 hodiny pri teplote miestnosti. Bunky potom boli inkubované buď s 1:50 riedením anti-CD44 (abca ab65829) alebo 1: 100 riedenie anti-CD45 (abca ab10558) protilátky cez noc pri 4 ° C. Alexa Fluór oslie anti-králičie 488 bola použitá ako sekundárna protilátka v 1: 1000 zriedenie po dobu 1 hodiny pri teplote miestnosti. Bunky potom boli kontrastne s 1: 2000 zriedenie nukleárnej škvrna TO-PRO 3-jodid (Invitrogen, T3605) počas 20 minút pri teplote miestnosti pred montážou pomocou Vectashield HardSet montovacího médiá. Králičie IgG bola použitá v riedení 1:25 ako negatívna kontrola za rovnakých podmienok.}

Žalúdočné profily získané z PBS alebo IFNy myší ošetrených boli blokované 20% normálneho kozieho séra a inkubované s anti-1: 400 RFP protilátky (abca, ab34771) po dobu 16 hodín pri teplote 4 ° C, a potom 1: 100 anti-králičie Alexa Fluór 488 (Invitrogen) sekundárnej protilátky po dobu ďalšej 1 hodiny. Sklíčka bola kontrastne potom za použitia anti-E-cadherin (BD transduction Labs, 610181) protilátky v riedení 1: 200 po dobu 1 hodiny pri teplote miestnosti a následne 1: 100 anti-myšou Alexa Fluór 633 (Invitrogen) sekundárnou protilátkou. Všetky vzorky boli namontované pomocou Vectashield Hardset Montážne médium (VectaLabs). Snímky boli získané s použitím Zeiss LSM510 META konfokálního mikroskopu.

Test chemotaxie

Test chemotaxie bola vykonaná na základe zavedených protokolov [22]. Transdukované stMSCs boli umiestnené do 24-jamkových doštičiek obsahujúcich transwell PET membrány s pórmi 8 um (BD Falcon). 2,5 x 10 ^{4 bunky boli nasadené na apikálnej (hornej) komory v médiu DMEM obsahujúcom 0,1% BSA. SDF-1α (rmSDF-1α, R &D Systems) bol pridaný k bazolaterální (nižšej) komory v koncentrácii 0 až 150 ng /ml. Bunky boli inkubované po dobu 6 hodín pri teplote 37 ° C. Po migrácii, bunky boli fixované v 4% paraformaldehydu po dobu 30 minút a potom sa farbí 10 minút za použitia farbenia Wright-Giemsa. Bunky, ktoré zostali na hornej strane membrány sa odstránia s aplikátorom s bavlnenou špičkou a zvyšné bunky boli počítané v 5 poliach pri 40 x zväčšení. Počet migrujúcich buniek, bola vypočítaná tak, že sa priemerný počet migrujúcich buniek v každej jamke by priemerný počet migrujúcich buniek v kontrolnej jamky.}

Štatistická analýza

Výsledky boli analyzované buď nepárový t testu alebo ANOVA študenta pomocou komerčne dostupného softvéru (GraphPad Prism, GraphPad Software, San Diego, CA). A P
hodnota menšia ako 0,05 bola považovaná za významnú

Výsledky

IFNT indukovaná stMSC proliferation je sprostredkovaný SHH sekrécia a signalizačné

rolu. hedgehog signalizácie ako mediátor IFNy-indukovanej stMSC a wtMSC proliferácie bola identifikovaná pomocou prietokovej cytometrie a progresie bunkového cyklu. Po ošetrení boli bunky zafarbené propidiumjodidom a bunkového cyklu analyzované prietokovou cytometriou na zvolenej bunkovej populácie jedného (obr S1A). Obrázok 1 predstavuje stredné hodnoty distribúcie buniek v percentách v jednotlivých fázach bunkového cyklu v liečebných skupinách uvedenými na obr S1B-E. Obrázky S1B-E predstavujú grafy, ktoré ukazujú zmeny v niekoľkých fázach bunkového cyklu. Priemerné hodnoty a štatistická významnosť v reakcii na všetky procedúry sú zhrnuté na obrázku S1F a G. Analýza dát surových fluorescencie preukázala zvýšené percento stMSCs v S-fáze a G _{2 /M fázy, a znížené percento buniek G 0 /G 1 fáza v reakcii na rmIFNγ v porovnaní s bunkami ošetrenými vehikulom (obrázok 1A). Identifikovať úlohu secernovaného SHH ako mediátor IFNy-indukovanej proliferácie stMSC sme použili anti-ježko neutralizačných 5E1 monoklonálnu protilátku, ktorá sa viaže k ligandu, a Psst porušuje naviazanie na receptor PTCH proteín [1]. Proliferačnej odozva stMSCs až rmIFNγ bola významne inhibovaná s liečbou protilátkou 5E1 (obrázok 1A). V porovnaní s stMSCs, non-transformovanej wtMSCs reagoval podobne ako reakcia na IFNy čo naznačuje, že pozorované zvýšenie proliferácie nebola výsledok transformácie sám. IFNy významne indukuje percento wtMSCs v S-fáze, odpoveď, ktorá blokovaného anti-SHH protilátky (obrázok 1B). Dohromady Obrázok 1 ukazuje, že IFNT indukuje proliferáciu oboch netransformovaných a spontánne transformovaných MSC, odpoveď, ktorá je sprostredkovaný vylučovaného SHH.}

umlčanie SHH gén vnútri kostnej drene odvodené od stMSCs

Ak chcete komplexne študovať úlohu ježko signalizácia proliferácie BM-MSC a náboru in vivo
, wtMSCs boli transfekovány k nadmernému express Pst zatiaľ čo stMSCs boli transdukovány lentivirových shRNAs proti SHH. Bol použitý pLKO.1-puro báza lentivirovým vektorom exprimujúcich krátku vlásenky sekvenciu proti prepisu génu SHH. bunkové línie Control MSC boli vytvorené pomocou wtMSC s endogénne expresie SHH a transfekcia stMSCs s pLKO.1-puro základňa lentivirovým vektorom (stMSC ^{VECT). Päť lentivirové klonov, z ktorých každý klon exprimujúci iné krátke vlásenky sekvencie boli analyzované (stMSC ShhKO59-stMSC ShhKO63). Vyradenie SHH bola potvrdená metódou Western blot analýzou, ktorá ukázala 100% vyraďujúce expresie SHH proteínov vo všetkých klonov v porovnaní s untransduced buniek (wtMSCs) a SHH s nadmernou expresiou bunkových línií (wtMSC Pst a stMSC Vect) ( obrázok S2A). Clone stMSC ShhKO59 bola použitá pre ďalšie experimenty a bude označovaná ako stMSC ShhKO. Expresie pDsRed-hyg-C1 plazmidom exprimujúcim červeno fluoreskujúce proteín (RFP) bola potvrdená metódou imunoblotu za použitia bunkového lyzátu zhromaždené z transdukovaných stMSCs (obr S2A). Dôležité je, že wtMSCs stabilne transfekované na viac ako-express SHH proteínu, vyjadrené SHH na podobnej úrovni, na stMSCs (obr S2A).}

Ak chcete overiť vyraďujúce SHH v MSC bez toho aby sa zmenila diferenciáciu buniek, čo je výraz vzor pre klasické CD markerov (CD29, CD106, CD105, CD44 a CD73) a SCA-1 pomocou prietokovej cytometrie bola vykonaná pomocou kultivovanú stMSC ^{Vect (obr S2B) a stMSC bunky ShhKO (obr S2C). Oba stMSC Vect a stMSC ShhKO bunky boli negatívne pre CD45 (obr S3). Ďalej, obe bunkové línie stMSC boli schopné diferencovať do adipocytov fenotypu na základe pozitívneho Oil Red O farbenia lipidových kvapôčok produkovaných (obr S3). Kolektívne, tieto údaje naznačujú, že porazený z SHH bielkovín v stMSCs nezmenil diferenciáciu týchto buniek.}

IFNr indukuje proliferáciu a wtMSCs a stMSCs v kostnej dreni

Ak chcete zistiť vplyv na IFNr wtMSC a stMSC proliferácie in vivo
myšiam boli transplantované s RFP značený wtMSC, wtMCS ^{SHH, stMSC VECT alebo stMSC ShhKO bunky a pridá sa k rmIFNγ po dobu 21 dní. Po ošetrení IFNT, kostná dreň bola zozbieraná a analyzované na zmeny v bunkovom cykle a počtu RFP-pozitívnych buniek pomocou prietokovej cytometrie. IFNy indukuje významné zvýšenie počtu RFP pozitívnych buniek v kostnej dreni všetkých experimentálnych skupín s výnimkou tých zvierat, s transplantovanými stMSC ShhKO bunky (obrázok 2A, B). Imunofluorescenčné kostnej drene bolo zistené, že došlo k výraznému zvýšeniu najmä v množstve proliferujúcich RFP pozitívnych buniek v reakcii na IFNy ako ko-lokalizovaný BrdU imunobarvením (obrázok 2C, D). Toto bolo ďalej podporované obr S4A, B a C, ktoré ukazuje reprezentatívnu analýzu svetla rozptýlený odhaľujúce populáciu stMSCs, ktoré boli pozitívne na RFP a tvorili približne 0,1% z celej populácii buniek kostnej drene. RFP-pozitívne bunky boli bránou pre bunkové populácie jedného (obr S4C) a bunkového cyklu analyzované. Bunky získané z kostnej drene myší s transplantovanými stMSC Vect bunky ošetrené rmIFNγ mali významne väčšie percento buniek v S-fáze (55,5 ± 2,82%) v porovnaní s myšou ošetrených PBS (32,9 ± 5,14%, P Hotel &0,05 v porovnaní s stMSC VECT transplantovaných myší ošetrených PBS) (obr S4F). Percento buniek v S-fáze zhromaždené z kostnej drene myší s transplantovanými stMSC ShhKO liečených rmIFNγ neboli významne odlišné (32,9 ± 2,64%) v porovnaní s myšou ošetrených PBS (38,4 ± 1,47%, P Hotel &0,05 v porovnaní s stMSC ShhKO transplantovaných myší ošetrených PBS) (obr S4i). Čísla S4D, E, G a H predstavujú grafy, ktoré ukazujú zmeny v niekoľkých fázach bunkového cyklu. Tak, IFNT indukuje proliferáciu oboch wtMSCs a stMSCs in vivo
v kostnej dreni, odpoveď, ktorá sa zdá byť sprostredkovaný SHH signalizáciou.}

In vivo
Nábor wtMSCs a stMSCs na žalúdočnú sliznicu v reakcii na IFNT

Ak chcete určiť úlohu ježko signalizácie ako mediátor IFNr indukované stMSC náboru do žalúdočného epitelu, myši transplantované s stMSC ^{Vect a stMSC ShhKO bunky boli ošetrené PBS alebo IFNT po dobu 21 dní. Žalúdky potom boli zhromaždené a nábor RFP značeného stMSC Vect a stMSC ShhKO bunky analyzované imunohistochemicky (obrázok 3). stMSC Vect bunky boli prijatí na žalúdočnú sliznicu myší injektovaných IFNT (obrázok 3C, D) v porovnaní s absenciou RFP značený stMSC Vect buniek v žalúdkoch PBS-injikovaných myší (obrázok 3A, B ). stMSC ShhKO bunky transplantované do myší injektovaných IFNT neboli prijatí do žalúdočnej sliznice (obrázok 3E, F). Expresia RFP značeného stMSC Vect bunky s liečbou IFNy bola potvrdená pomocou RT-PCR (obrázok 3G). Určiť, či nábor MSC do žalúdočnej sliznice v reakcii na IFNy bol unikátny pre stMSCs, experiment bol opakovaný s použitím buď wtMSCs alebo wtMSCs s nadmernou expresiou Psst (wtMSC SHH). Hoci obe wtMSC a wtMSC Psst bunky boli v žalúdkoch IFNy-ošetrených myší zistené, boli významne vyššie počty wtMSC Pst a stMSC Vect buniek v žalúdočnej sliznici v porovnaní s wtMSC bunky transplantované skupina (Obrázok 3 H). Súhrnne tieto dáta ukazujú, že je pravdepodobné, že signalizácia Pst sprostredkovať nábor MSC do žalúdočnej sliznice v reakcii na IFNT.}

došlo k významnému zvýšeniu počtu proliferujúcich buniek v žalúdočnej sliznici v reakcii na IFNy -treated wtMSC ^{Pst a stMSC Vect transplantované myši v porovnaní s PBS injekciou myšou na (obrázok 4A-D, obrázok S5A-F). Avšak, MSC boli BrdU negatívne (Obrázok 4B, C a Obrázok S5A-D). Aj keď stMSC ShhKO bunky transplantované do myší injektovaných IFNT neboli prijatí na žalúdočnú sliznicu, nebol žiadny rozdiel v epitelové proliferácie medzi PBS a IFN-y ošetrenie v tejto experimentálnej skupiny, čo naznačuje zvýšené MSC odvodené Psst môžu byť potrebné k podpore tejto čím ďalej väčšiemu rozšíreniu (obrázok 4D). Okrem toho, aj keď wtMSCs boli prijatí do žalúdočnej sliznice v reakcii na IFNy, nebol žiadny rozdiel v epitelové proliferácie medzi PBS a IFN-y ošetrenie (obrázok 4D). Tieto údaje naznačujú, že Pst signalizácia v wtMSCs SHH a stMSCs v reakcii na IFNy indukuje proliferáciu v žalúdočnej epitel. IFNy sám, v neprítomnosti stMSCs, neindukuje proliferáciu v žalúdočnej sliznici potvrdzujúce, tento účinok nie je v spojení s sám zápalu.}

Na určenie, či sa znížil stMSC proliferáciu, po prijímaní, bola spojená s bunkovou adhéziu v rámci žalúdočné epitel, žalúdky potom boli spoločne zafarbené pre E-cadherinu a RFP (obr 4G-i). PBS-liečených myší, ktoré boli transplantované RFP značený stMSC ^{Vect bunky nevykazovali získavanie buniek žalúdočnej sliznice (obr 4G). V súlade s obrázkom 3, IFNy vstrekovaním myši, ktoré boli transplantované s RFP značený stMSC Vect bunky vykazovali výrazný získavanie buniek na žalúdočnej sliznice (obr 4H). RFP značený stMSC VECT bunky ko-lokalizovaný s E-cadherinu (obr 4G, i) podpory, aby prijatí bunky sa zaštepiť do žalúdka epitelu.}

Hedgehog Signaling sprostredkováva expresiu Focal adhezívnej bielkoviny v reakcii na SDF-1α chemokiny

sme sa rozhodli preskúmať SDF-1α /CXCR4 signálne os, pretože sa zistilo, že táto signálna dráha podporuje MSC náboru [23] [24].

• Ploche ONE: Neočakávaná Bezhlavý a tailless Ryby v žalúdku Obsah žraloka mako Isurus oxyrinchus
• PLoS ONE: hmyzožravé Netopiere Digest chitínu v žalúdku Použitie kyslá cicavčie chitinázy