PLOS ONE: Sonic Hedgehog médie la prolifération et le recrutement des Transformé cellules souches mésenchymateuses aux Stomach

Résumé

Les études utilisant souris infectées par des Helicobacter montrent que la moelle osseuse dérivées des cellules souches mésenchymateuses ( MSCs) peut repeupler l'épithélium gastrique et favoriser la progression du cancer gastrique. Dans le microenvironnement de la tumeur de l'estomac, une cytokine pro-inflammatoire interféron-gamma (IFN) et Sonic hedgehog (Shh) sont élevés. IFNy est impliquée dans la prolifération tumorale via l'activation de la voie de signalisation de Shh dans divers tissus, mais si un mécanisme similaire existe dans l'estomac est inconnue. Nous avons testé l'hypothèse selon laquelle l'IFNy conduit MSC prolifération et le recrutement, une réponse médiée par signalisation de Shh. L'étude actuelle utilise la transplantation d'un in vitro
lignée de cellules souches mésenchymateuses transformé (stMSC ^{vect) en, qui exprime sur la signalisation hedgehog, par rapport aux cellules souches mésenchymateuses non transformées de type sauvage (wtMSCs), wtMSCs transfectées pour surexprimer Shh (wtMSC Shh) et stMSCs transduites avec des constructions lentiviraux contenant shRNA ciblant le gène Shh (stMSC ShhKO). L'effet de l'IFNy sur le MSC prolifération a été évaluée par l'analyse du cycle cellulaire in vitro
utilisant des cellules traitées avec la protéine recombinante IFNy (rmIFNγ) seul ou en combinaison avec un anticorps anti Shh anticorps 5E1 et in vivo
en utilisant des souris transplantées avec des cellules souches mésenchymateuses traitées avec PBS ou rmIFNγ. In vitro
, IFNy augmenté de manière significative la prolifération MSC, une réponse médiée par Shh qui a été bloqué par l'anticorps 5E1. La population MSC recueillies depuis la moelle osseuse de souris ou PBS IFNy traités a montré que l'IFNy a augmenté de façon significative le pourcentage de toutes les lignées cellulaires MSC en phase S, à l'exception de l'stMSCs Les cellules ShhKO. Tandis que les lignées de cellules MSC à l'expression de Shh intactes ont été recrutés pour la muqueuse gastrique en réponse à l'IFNy, stMSCs ShhKO étaient pas. signalisation Hedgehog est nécessaire pour MSC prolifération et le recrutement à l'estomac en réponse à IFNy}

Citation:. Donnelly JM, Chawla A, Houghton J, Zavros Y (2013) Sonic Hedgehog médie la prolifération et le recrutement de souches mésenchymateuses Transformé les cellules à l'estomac. PLoS ONE 8 (9): e75225. doi: 10.1371 /journal.pone.0075225

Editeur: Jorge Sans Burns, l'hôpital universitaire de Modène et Reggio Emilia, Italie

Reçu: Janvier 24, 2013; Accepté le 14 Août 2013; Publié: Septembre 19, 2013 |

Droit d'auteur: © 2013 Donnelly et al. Ceci est un article en accès libre distribué sous les termes de la licence Creative Commons Attribution, qui permet une utilisation sans restriction, la distribution et la reproduction sur tout support, à condition que l'auteur et la source originelle sont crédités

Financement:. Ce travail a été soutenue par l'American Cancer Society Research Scholar Award 119072-RSG-10-167-01-MPC (Y. Zavros), Albert J. Ryan Foundation Fellowship (J. Donnelly) et en partie par Santé médicale du Centre de santé digestive Cincinnati Children Center (DHC: bench to bedside Research in Pediatric digestive Disease) CHTF /SUB DK078392. Les auteurs tiennent à souligner l'aide du gestionnaire Monica DeLay du flux de recherche cytométrie de base dans la division de rhumatologie à l'hôpital Medical Center de Cincinnati Children, financé en partie par les Instituts nationaux de la santé (NIH) AR-47363. Tous les flux de données cytométrie ont été acquises en utilisant un équipement géré par le flux de recherche cytométrie de base dans la division de rhumatologie à l'hôpital Medical Center de Cincinnati Children, financé en partie par le NIH AR-47363. Les bailleurs de fonds ont joué aucun rôle dans la conception de l'étude, la collecte et l'analyse des données, la décision de publier, ou de la préparation du manuscrit

Intérêts concurrents:.. Les auteurs ont déclaré aucun conflit d'intérêts existent

Introduction

Il y a un rôle clairement établi pour Sonic Hedgehog (Shh) de signalisation dans le développement du cancer [1], [2], [3]. La croissance cellulaire dans les tumeurs de l'appareil digestif qui incluent l'œsophage, de l'estomac, des voies biliaires et du pancréas sont réglementés par l'expression endogène de ligands Hedgehog tels que Shh [1]. La liaison du ligand à son récepteur Hedgehog, Patched (Ptch), se traduit par la suppression de l'inhibition de Ptch sur Smoothened (Smo). Cette suppression de l'inhibition sur Smo entraîne l'activation de la famille Gli Hedgehog de facteurs de transcription et de croissance par la suite de la tumeur qui peut être bloquée par un anticorps neutralisant Hedgehog [1]. Bien que l'association entre le cancer gastrique et Shh est clair, le rôle fonctionnel de Shh dans le développement et la progression du cancer gastrique est largement inconnue. En outre, le mécanisme qui régule la production de Shh dans le microenvironnement de la tumeur n'a pas encore été déterminée.

Helicobacter pylori (H. pylori)
colonisation bactérienne provoque une inflammation chronique qui est toujours associée à la progression vers le cancer gastrique [4]. La réponse immunitaire la plus courante et préjudiciable implique les cytokines pro-inflammatoires Th1, pour la plupart en évidence l'IFNy par les cellules T et l'IL-1β et TNF à partir du tissu ou des macrophages envahissants [5], [6], [7], [8], [ ,,,0],9]. En effet, une cytokine pro-inflammatoire IFNy a été montré pour contribuer à la pathogenèse et le développement de la métaplasie gastrique [5], [9], [10] et le cancer [10]. Dans les cancers induits par l'inflammation, la voie de signalisation Hedgehog médiatise IFNy induite par une tumeur au développement [11], [12], [13]. En particulier, Shh est un gène cible IFNy et Hedgehog signalisation d'un médiateur de la prolifération IFNy induite [12].

Au cours de Helicobacter de l'infection, l'inflammation chronique coïncide avec le recrutement de la moelle osseuse dérivés les cellules souches mésenchymateuses (CSM BM) [14], [15]. Dans l'estomac chronique enflammée BM-MSCs sont recrutés à partir de la moelle osseuse à l'estomac et se différencier en fibroblastes associés au cancer (CEFA) qui jouent un rôle dans la direction de développement du cancer [14]. Bien que clairement impliquée dans le développement du cancer gastrique, le mécanisme de régulation de la prolifération et recrutement de malignement transformé BM-MSC vers l'estomac pendant une inflammation chronique est en grande partie inconnue. Il est intéressant de Shh est rapporté à induire la prolifération et la différenciation des cellules souches mésenchymateuses BM [16]. Shh a également été reconnu comme un chimiotactique potentiel pour les cellules de la moelle osseuse provenant d'os quand upregulated en réponse à une inflammation chronique [17], [18].

Basé sur l'association entre IFNy et Shh, nous émettons l'hypothèse que l'IFNy induit Shh signalisation dans les cellules souches mésenchymateuses facilitant la migration des cellules à l'estomac. Pour tester cette hypothèse, l'étude actuelle compare in vivo
BM-MSC recrutement à la muqueuse gastrique en réponse à l'IFNy en utilisant une lignée de cellules souches mésenchymateuses spontanément transformé (stMSC) par rapport aux non transformée BM-MSCs. Dans la culture, BM-MSCs sont sujettes à une mutation avec le vieillissement et présentent des mutations cliniquement pertinentes dans le gène p53 [19]. Avec la culture à long terme BM-MSCs «transformer spontanément» (stMSCs), peut être propagé in vitro pendant des périodes prolongées et présentent un phénotype favorisant le cancer [19]. L'étude actuelle utilise les deux stMSCs et non transformées BM-MSC (wtMSCs) qui exprime sur la signalisation Hedgehog. En utilisant les lignées cellulaires wtMSC et stMSC fois in vivo
et in vitro
, nous démontrons que l'IFNy induite par la prolifération et le recrutement de MSC lignées cellulaires à l'estomac est une réponse qui est médiée par Shh la sécrétion et la signalisation.

Matériel et méthodes

Animaux

C57BL /6 (souche�664) et IRG (souche705) souris utilisées pour ces études ont été achetés chez Jackson Laboratoires. Toutes les études de souris ont été approuvées par l'Université de Cincinnati Institutional Animal Care et utilisation Commission (IACUC) qui maintient une association américaine de l'évaluation et l'accréditation des laboratoires de protection des animaux (AAALAC) de l'installation.

dérivées de moelle osseuse mésenchymateuses Spontanément Transformé cellules souches (stMSC) et non transformé BM-MSCs (wtMSC) Culture et traitements

Les lignées cellulaires wtMSC ont été établies à partir de toute la moelle osseuse de souris IRG et cultivées au passage 5 avant la transfection avec l'entretien ultérieur à basse numéro de passage (< P10) avant utilisation expérimentale. Le total de la moelle osseuse a été balayé du fémur et du tibia de souris pour la culture et le passage de la population de MSC adhérente plastique [20] suivante. Spontanément cellules transformées osseuses dérivées de la moelle souches mésenchymateuses (stMSCs) transfectées avec un plasmide pDsRed-Hyg-C1 exprimant la protéine fluorescente rouge ont été utilisés [21]. Toutes les cellules ont été cultivées à l'aide HyClone DMEM milieu de culture supplémenté avec 10 à 15% de sérum de veau foetal et 1% de pénicilline-streptomycine dans des conditions normales. CSM cultivées pendant le traitement ont été étalées dans des plaques à 6 puits et on les laisse croître jusqu'à 70-80% de confluence dans des milieux normaux, puis privées de sérum pendant une nuit. Après l'expansion de la culture, la cellule de souris multipotentes mésenchymateuses stromales Marker Panel d'anticorps a été utilisé pour marquer des lignées de cellules MSC pour Sca-1, CD106, CD105, CD73, CD29, CD44 et les marqueurs hématopoïétiques CD45 et CD11b (R &D Systems, SC018). Les cellules ont été mises en suspension à une concentration de 1 x 10 ^{6 cellules /ml et colorées selon le protocole du fabricant. Les cellules ont été ensuite mises en incubation avec AlexaFluor 488 à une dilution 1:100 pendant 30 minutes à 4 ° C. La fixation a été effectuée pendant 15 minutes à la température ambiante en utilisant un réactif disponible dans le commerce (Invitrogen GAS001S5). L'intensité de fluorescence a été mesurée par cytométrie en flux à l'aide du logiciel FACSCalibur et BD CellQuestPro. wtMSCs et stMSCs ont été traitées avec le véhicule, l'interféron gamma recombiné de souris (rmIFNγ, 100 nM, R & D Systems) ou anti-Shh anticorps 5E1 (pré-traités pendant 6 heures), plus rmIFNγ pendant 24 heures. Les cellules traitées ont ensuite été analysés pour des changements dans le cycle cellulaire par cytométrie en flux.}

Sonic Hedgehog (Shh) Knockdown par Lentivirus médiée court Hairpin ARN (shRNA) en utilisant

Les stMSCs RFP-tagged de stMSCs étaient transduite avec cinq clones MISSION lentiviral transduction de particules différentes contenant différentes séquences de shRNA pour Shh et une résistance à la puromycine composant pLKO.1-puro conférant (Sigma Aldrich). stMSCs DP-marqués ont été incubées avec des particules lentivirales avec des billes magnétiques ExpressMag (Sigma Aldrich) sur un aimant (Oz Biosciences Plaque super magnétique, MF10000) pendant 15 minutes, les cellules ont été retirées de l'aimant, mis à incuber pendant encore 16 heures, puis placé sous la sélection à la puromycine (Milieux de culture DMEM contenant 10% de sérum de veau foetal, 1% de pénicilline /streptomycine, 10 pg /ml de puromycine) pendant 7 à 10 jours. La dose efficace puromycine nécessaire pour éliminer les cellules non transduites a été déterminée auparavant par le biais d'une courbe de destruction puromycine qui a testé les concentrations de 0 à 50 pg /ml (données non représentées). Les cellules transduites ont été désignés par un numéro d'identification unique clone avec des lignées cellulaires transduites par shRNA pour Shh (stMSC ^{ShhKO) numérotées 59-63. Une lignée de cellules DP-MSC vecteur pLKO.1-puro transduction (stMSC vect) a servi de contrôle pour le niveau endogène de l'expression du gène Shh. analyse par Western blot a été utilisée pour confirmer Shh knockdown et d'expression de la DP.}

Transfection de wtMSCs Over-express Shh

Le plasmide (Origène CW101340) a été combiné avec le réactif Origène Turbofectin à des rapports de 0 :1, 01:01, 02:01, 03:01 et 04:01 et on incube pendant 15 minutes à température ambiante. Le réactif de transfection a été ensuite ajouté goutte à goutte à wtMSCs à 70% de confluence et on laisse incuber pendant 24 heures avant que les cellules ont été placées sous sélection dans des milieux normaux avec la puromycine. La dose efficace puromycine nécessaire pour éliminer les cellules non transfectées a été déterminée auparavant par le biais d'une puromycine tuer des concentrations d'essai de la courbe de 0 à 10 pg /ml (données non représentées). La plus faible concentration qui a tué toutes les cellules non transfectées au post-traitement 3-4 jours a été établi comme 2 pg /ml.

In vivo stMSC recrutement et la prolifération

C57BL /6 ont été transplantées avec 1 × 10 ^{6 wtMSCs, wtMSCs Chut, stMSCs vect ou stMSCs ShhKO par injection veine de la queue. Trois jours après la transplantation, les souris ont reçu une injection de véhicule (PBS stérile, i.p.) ou rmIFNγ (1 pg /jour, i.p.) pendant 7 ou 21 jours. Les souris ont été injectés avec (Labeling 5-bromo-2'-désoxy-uridine et détection Kit II, Roche Diagnostics, ip) 200 ul de réactif BrdU étiquetage disponible 24 heures avant l'analyse, et des sections d'estomac fixées dans 4% de paraformaldehyde, intégré paraffine et 3 uM sections préparées pour des analyses immunohistochimiques et immunofluorescence. Le total de la moelle osseuse a également été isolé à partir des fémurs de la même souris avec du PBS rinçage. Les globules rouges ont été lysés en utilisant le rouge sang du tampon de lyse cellulaire (4,14 g de NH _{4Cl, 0,5 g de bicarbonate de potassium 3, 0,5 M d'EDTA dans 500 ml, pH 7.2-7,4). Environ 11 × 10 6 cellules ont été fixées et perméabilisées en utilisant le kit Caltag Laboratories cytométrie en flux, selon le protocole du fabricant (Invitrogen, GAS-004) et colorées en utilisant un anticorps anti-DP conjugué au FITC (1:100, Abcam, ab34764 ) puis colorées à l'aide Vybrant DyeCycle Ruby tache (Invitrogen) selon le protocole du fabricant. Fluorescence a été analysé à l'aide du système BD LSRII cytomètre de flux. Afin d'analyser plus particulièrement la DP-MSCs, ouverture de porte a été utilisé pour analyser le cycle cellulaire des seules cellules positives au FITC. fluorescence de pointe a été analysé par le logiciel ModFitLT pour déterminer le pourcentage de la population dans chaque phase du cycle cellulaire.}}

cytométrie de flux et cycle cellulaire Analyse

Les cellules ont été privées de sérum 16 heures avant l'analyse . Les cellules ont été fixées avec de la glace froide éthanol à 70% /PBS pendant 15 minutes à -20 ° C, lavées puis colorées avec de l'iodure de propidium pendant 45 minutes. Les valeurs mesurées du pic de fluorescence par rapport au nombre total de cellules ont été obtenues à l'aide du programme CellQuest Pro (Becton Dickson). Le pourcentage de cellules provenant de la population dans chaque phase du cycle cellulaire a été calculée à partir des mesures pic de fluorescence grâce à une analyse avec un logiciel Modfit LT. Cytométrie de flux en utilisant le système FACSCalibur ™ (Becton Dickson) a été effectuée sur toutes les cellules transduites à l'aide de la souris multipotentes cellules souches mésenchymateuses Marker Panel Anticorps selon le protocole du fabricant (R & D Systems, SC018).

Immunoprécipitation et Western Analyse de buvardage

les lysats cellulaires ont été préparés à l'aide de M-PER mammifère réactif d'extraction de protéine (Thermo Scientific, IL) additionné d'inhibiteurs de protéase (Roche) selon le protocole du fabricant. Des échantillons de médias à partir de cellules ont été concentrées en utilisant 15 Amicon ml Ultra centrifuges Filter Devices (Millipore). Les lysats cellulaires (100 ug de protéine totale) et les milieux ont été immunoprécipitées en utilisant l'anticorps anti-Shh 5E1 (2 ug) à 4 ° C pendant 16 heures. /G billes d'agarose protéine A (20 ul, Santa Cruz Biotechnology, CA) ont été ajoutés et les échantillons mis à incuber à 4 ° C pendant 16 heures. Après la 16 heures d'incubation, les immunoprécipités ont été lavés 3 fois avec du PBS et remises en suspension dans 40 ul de tampon de charge de Laemmli contenant du β-mercaptoéthanol (Bio-Rad Laboratories, CA) avant le chargement sur 4-20% de Tris-Glycine à gradient Gels. Les gels ont été effectués à 80 V, à 3,5 heures, les protéines transférées sur des membranes de nitrocellulose à 105 V, 1-2 heures, puis bloquées pendant 1 heure à température ambiante à l'aide du détecteur KPL Block (Kirkegaard & Perry Laboratories, Inc.). Les membranes ont été incubées pendant une nuit à 4 ° C avec une dilution d'anticorps 1:200 Shh (N-19, Santa Cruz), suivie d'une incubation pendant 1 heure avec une dilution de 1:100 AlexaFluor anti-chèvre 680 (Invitrogen). Les blots ont été imagées en utilisant un densitomètre à balayage avec un logiciel d'analyse (Odyssey infrarouge Software System Imaging).

Isolement de l'ARN et RT-PCR

ARN total a été isolé à partir de tissu de l'estomac en utilisant le réactif Trizol selon l' fabricants protocole (TriReagent, Molecular Research Center, Inc.). Le haut Reverse Transcription Kit ADNc (Applied Biosystems) La capacité a été utilisée pour la synthèse d'ADNc à partir d'ARN en suivant le protocole recommandé. Pour chaque échantillon, 60 ng d'ARN a été transcrit de manière inverse pour donner environ 2 pg d'ADNc totale qui a été ensuite utilisé pour la RT-PCR. séquences d'amorces DP utilisées sont les suivantes: AVANT -5 'CCC CGT AAT GCA GAA GAA GA 3', REVERSE -5 'CTT GGC CAT GTA GGT GGT CT 3'. Les amplifications PCR ont été réalisées dans un volume total de 20 ul contenant du tampon, 20 mM d'amorces directe et inverse, la Taq polymérase, l'eau exempte de RNase et de matrice d'ADNc. Chaque amplification par PCR a été réalisée dans des puits en double dans un GeneAmp PCR système 9700 thermocycleur (Applied Biosystems), en utilisant les conditions suivantes: 94 ° C 3 minutes 94 ° C 30 secondes, 60 ° C 1 minute et 72 ° C, 1 minute à 35 cycles. Les produits de PCR ont été visualisés sur un gel d'agarose TAE à 1,5%.

immunohistochimie

Les souris ont été injectés avec 200 pi de BrdU étiquetage Stock réactif (étiquetage 5-bromo-2'-désoxy-uridine et de détection Kit II, Roche Diagnostics) 24 heures avant l'analyse. tissus gastriques ont été fixées avec le fixateur de Carnoy (60 ml d'éthanol, 30 ml de chloroforme, 10 ml d'acide acétique) pendant 16 heures, inclus dans la paraffine et des sections de 4 pm ont été préparées. Après déparaffinage, l'extraction de l'antigène a été effectuée en chauffant les lames pendant 10 minutes à 100 ° C dans 0,01 M de citrate de sodium, un tampon (solution de démasquage antigénique, Vector Laboratories, Burlingame, CA). une activité de peroxydase endogène a été ensuite bloqué en incubant les lames dans 3% de peroxyde d'hydrogène /éthanol pendant 20 minutes supplémentaires. Les sections ont été ensuite bloquées en utilisant 5% de BSA /Tampon Tris /0,1% de Tween 80 (TBS-T) et incubées avec une dilution 1:20 d'anticorps anti-BrdU (marquage 5-bromo-2'-désoxy-uridine et de Detection Kit II, Roche Diagnostics) à 37 ° C pendant 30 minutes. développement de la couleur de la BrdU a été effectuée selon le protocole du fabricant. Les sections ont été ensuite bloquées avec 20% de sérum de chèvre normal pendant 20 minutes et incubées avec une dilution 1:400 d'anticorps anti-DP conjugué à la biotine (Abcam, ab34771) pendant 16 heures à 4 ° C, suivie par une dilution d'anticorps anti- 1:500 IgG de lapin pendant 30 minutes, puis visualisées avec des complexes avidine-biotine en utilisant le kit Vectastain Elite ABC en utilisant de la diaminobenzidine (DAB) comme substrat (Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA). Les lames ont été montées en utilisant Permount.

Pour adipocyte induction, stMSCs ont été traités avec HyClone DMEM contenant10 ^{-8 M dexaméthasone (Sigma, D4902) et 5 ug /ml d'insuline (Sigma, I6634). Toutes les cellules ont été fixées en utilisant 4% de paraformaldehyde pendant 20 minutes à la température ambiante. Pour détecter la différenciation, l'huile rouge O coloration a été réalisée en ajoutant une solution de 3,75% Oil Red O, l'incubation de 5 minutes à la température ambiante, puis lavage à l'eau avant de monter sur des lames en utilisant Vectashield HardSet milieu de montage. Les images ont été consultés et capturés dans la microscopie optique en utilisant un BX60 Olympus avec un appareil de diagnostic Instruments "Spot".}

immunofluorescence

stMSC ^{vect et stMSC cellules ShhKO ont été cultivées sur des lamelles jusqu'à 70-80% de confluence, fixées avec du paraformaldehyde à 4% pendant 30 minutes à la température ambiante, perméabilisées avec du PBS contenant 0,5% de Triton X-100 et bloquées avec du sérum d'âne à 2% pendant 1 heure à température ambiante. Les cellules ont ensuite été incubées avec soit une dilution au 1:50 d'anticorps anti-CD44 (Abcam ab65829) ou une dilution d'anticorps anti-CD45 (Abcam de ab10558) d'anticorps 1:100 pendant une nuit à 4 ° C. Alexa Fluor âne anti-lapin 488 a été utilisé comme anticorps secondaire à une dilution 1:1000 pendant 1 heure à température ambiante. Les cellules ont ensuite été de contraste avec une dilution 1:2000 de la tache nucléaire TO-PRO 3-iodure (Invitrogen, T3605) pendant 20 minutes à température ambiante avant de monter en utilisant Vectashield HardSet milieu de montage. IgG de lapin a été utilisé à une dilution de 1:25 comme témoin négatif dans les mêmes conditions.}

coupes gastriques recueillies dans du PBS ou de souris traitées avec IFNy ont été bloquées avec 20% de sérum normal de chèvre et mises en incubation avec des anti 1:400 anticorps DP (Abcam, ab34771) pendant 16 heures à 4 ° C, puis 1:100 anti-lapin Alexa Fluor 488 (Invitrogen) un anticorps secondaire pendant 1 heure. Les lames ont été ensuite contre-colorées utilisant des anticorps anti-E-cadhérine (BD Transduction Labs, 610,181) l'anticorps à une dilution 1:200 pendant 1 heure à la température ambiante, suivie d'une 1:100 anti-souris Alexa Fluor 633 (Invitrogen) un anticorps secondaire. Tous les échantillons ont été montés à l'aide Vectashield Hardset Montage Moyen (VectaLabs). Les images ont été obtenues à l'aide d'un microscope confocal Zeiss LSM510 META.

chimiotactisme Assay

L'essai de chimiotaxie a été effectuée sur la base des protocoles établis [22]. stMSCs transduites ont été étalées dans des plaques à 24 puits contenant Transwell membranes PET avec 8 pm pores (BD Falcon). 2,5 x 10 ^{4 cellules ont été ensemencées dans la chambre apicale (supérieure) dans des milieux DMEM contenant 0,1% de BSA. SDF-1α (rmSDF-1α, R & D Systems) ont été ajoutés au (inférieur) chambre basolatérale à des concentrations de 0 à 150 ng /ml. Les cellules ont été mises en incubation pendant 6 heures à 37 ° C. Après migration, les cellules ont été fixées dans du paraformaldehyde à 4% pendant 30 minutes, puis colorées pendant 10 minutes en utilisant une coloration de Wright-Giemsa. Les cellules restant sur la partie supérieure de la membrane ont été enlevées avec un coton-tige et les cellules restantes ont été comptées dans 5 champs à un grossissement de 40X. Le nombre de cellules en migration a été calculé en divisant le nombre moyen de cellules de migrer dans chaque puits par le nombre moyen de cellules de migrer dans le puits témoin.}

Analyse statistique

Les résultats ont été analysés soit par un apparié test t ou ANOVA de l'étudiant en utilisant un logiciel disponible dans le commerce (GraphPad Prism, GraphPad Software, San Diego, CA). A P
valeur < 0,05 a été considérée comme significative

Résultats

IFNy induite stMSC La prolifération est médiée par Shh Sécrétion et signalisation

Le rôle de. la signalisation hedgehog en tant que médiateur de l'IFNy induite par stMSC et wtMSC prolifération a été identifié par cytométrie en flux et la progression du cycle cellulaire. Après le traitement, les cellules ont été colorées avec de l'iodure de propidium et le cycle cellulaire analysé par cytométrie de flux sur une seule population cellulaire sélectionnée (Figure S1A). La figure 1 représente les valeurs moyennes de pourcentage de répartition des cellules dans les différentes phases du cycle cellulaire dans les groupes de traitement représentés sur les figures S1B-E. Les figures S1B-E représentent des graphiques représentant les variations des phases du cycle cellulaire. Les valeurs moyennes et la signification statistique en réponse à tous les traitements sont résumées sur la figure S1F et G. L'analyse des données de fluorescence brutes ont montré une augmentation du pourcentage stMSCs en phase S et G _{2 /M phases, et un pourcentage réduit de cellules G 0 /G 1 phase en réponse à rmIFNγ par rapport aux cellules traitées avec le véhicule (figure 1A). Afin d'identifier le rôle de Shh sécrété en tant que médiateur de la prolifération induite par l'IFNy de stMSC, nous avons utilisé l'anti-Hedgehog neutralisant l'anticorps monoclonal 5E1, qui se lie à un ligand Shh et perturbe la liaison au récepteur Ptch protéine [1]. La réponse proliférative des stMSCs à rmIFNγ était significativement inhibée par le traitement par anticorps 5E1 (figure 1A). Par rapport aux stMSCs, wtMSCs non transformées ont répondu de manière similaire en réponse à IFNy suggérant l'augmentation observée dans la prolifération n'a pas été le résultat de la transformation seule. IFNy a induit significativement le pourcentage de wtMSCs en phase S, une réponse qui a été bloqué par les anti-Shh anticorps (figure 1B). Collectivement, la figure 1 montre que l'IFNy induit la prolifération des deux MSCs non transformées et spontanément transformées, une réponse qui est médiée par sécrétée Shh.}

Silencing le Shh Gene au sein de la moelle osseuse dérivée stMSCs

Pour globalement étudier le rôle de la signalisation Hedgehog dans BM-MSC prolifération et le recrutement in vivo
, wtMSCs ont été transfectées à plus-express Shh tout stMSCs ont été transduites avec des shRNA lentiviraux contre Shh. Un vecteur lentiviral de base pLKO.1-puro exprimant une séquence en épingle à cheveux court contre la transcription du gène Shh a été utilisé. des lignées de cellules de contrôle MSC ont été établies en utilisant wtMSC avec l'expression endogène de Shh et la transfection de stMSCs avec le vecteur lentiviral de base pLKO.1-puro (stMSC ^{vect). Cinq clones lentiviraux, chaque clone exprimant une séquence en épingle à cheveux courte différente, ont été analysées (stMSC ShhKO59-stMSC ShhKO63). Knockdown de Shh a été confirmée par une analyse par transfert de Western qui montre 100% knockdown de Shh expression de la protéine dans tous les clones par rapport aux cellules non transduites (wtMSCs) et Shh surexprimant des lignées cellulaires (wtMSC Shh et stMSC vect) ( La figure S2A). Clone stMSC ShhKO59 a été utilisé pour des expériences ultérieures et sera appelé stMSC ShhKO. Expression de pDsRed-Hyg-C1 plasmide exprimant la protéine fluorescente rouge (RFP) a été confirmée par immunoblot en utilisant lysat cellulaire recueillies auprès de stMSCs transduites (Figure S2A). Surtout, wtMSCs transfectées de façon stable à surexpriment la protéine Shh, exprimé Shh à un niveau similaire aux stMSCs (Figure S2A).}

Pour vérifier knockdown de Shh dans MSCs sans altérer la différenciation des cellules, un motif d'expression pour les marqueurs de CD classiques (CD29, CD106, CD105, CD44 et CD73) et Sca-1 en utilisant la cytométrie de flux a été réalisée en utilisant stMSC culture ^{vect (Figure S2B) et stMSC cellules ShhKO (Figure S2C). Les deux stMSC vect et stMSC cellules ShhKO étaient négatives pour CD45 (Figure S3). En outre, les deux lignées cellulaires stMSC ont été capables de se différencier en un phénotype adipocytaire positif basé sur la coloration rouge d'huile O de gouttelettes lipidiques produites (figure S3). Collectivement, ces données suggèrent que knockdown de la protéine Shh dans stMSCs n'a pas changé la différenciation de ces cellules.}

IFNy Induit prolifération des wtMSCs et stMSCs dans la moelle osseuse

Pour déterminer l'effet de l'IFNy sur wtMSC et stMSC prolifération in vivo
, les souris ont été transplantées avec DP-tagged wtMSC, wtMCS ^{Chut, stMSC vect ou stMSC ShhKO cellules et traité avec rmIFNγ pendant 21 jours. Après traitement IFNy, la moelle osseuse a été récoltée et analysée pour les changements dans le cycle cellulaire et le nombre de cellules positives de la DP par cytométrie de flux. IFNy a induit une augmentation significative du nombre de cellules positives de la DP dans la moelle osseuse de tous les groupes expérimentaux à l'exception de ces animaux transplantés avec stMSC ShhKO cellules (figure 2A, B). Immunofluorescence de la moelle osseuse a révélé qu'il y avait une augmentation significative du nombre spécifique de la prolifération des cellules positives pour la DP en réponse à l'IFNy en tant que co-localisés par immunocoloration BrdU (figure 2C, D). Ceci a été soutenu par la figure S4A, B et C qui montre l'analyse représentative lumière diffusée révélant une population de stMSCs positifs pour DP et représentaient environ 0,1% de l'ensemble de la population de cellules de moelle osseuse. cellules DP-positives ont été bloqués pour la seule population cellulaire (Figure S4C) et cycle cellulaire analysé. Les cellules recueillies à partir de la moelle osseuse des souris greffées avec stMSC vect cellules traitées avec rmIFNγ avaient un pourcentage significativement plus élevé de cellules dans la phase S (55,5 ± 2,82%) par rapport aux souris traitées avec du PBS (32,9 ± 5,14%, P
< 0,05 par rapport à stMSC vect souris transplantées traitées avec du PBS) (Figure s4f). Le pourcentage de cellules en phase S ont été recueillies à partir de la moelle osseuse des souris greffées avec stMSC ShhKO traité avec rmIFNγ ne sont pas significativement différentes (32,9 ± 2,64%) par rapport aux souris traitées avec du PBS (38,4 ± 1,47%, P
> 0,05 par rapport à des souris stMSC ShhKO transplantés traités avec du PBS) (Figure S4i). Les figures S4D, E, G et H représentent des graphiques représentant les variations des phases du cycle cellulaire. Ainsi, l'IFNy induit la prolifération des deux wtMSCs et stMSCs in vivo
dans la moelle osseuse, une réponse qui semble être médiée par la signalisation Shh.}

In vivo
recrutement de wtMSCs et stMSCs à la muqueuse gastrique en réponse à IFNy

pour identifier le rôle de la signalisation Hedgehog en tant que médiateur du recrutement de stMSC IFNy induite à l'épithélium gastrique, souris transplantées avec stMSC ^{vect et stMSC ShhKO cellules ont été traitées avec du PBS ou de l'IFNy pendant 21 jours. Estomacs ont ensuite été recueillies et le recrutement de DP-tagged stMSC vect et cellules stMSC ShhKO analysés par immunohistochimie (Figure 3). stMSC vect cellules ont été recrutés pour la muqueuse gastrique des souris injectées avec de l'IFNy (figure 3C, D) par rapport à l'absence de DP-tagged stMSC vect cellules dans l'estomac de souris PBS-injectées (Figure 3A, B ). stMSC cellules ShhKO transplantées dans des souris injectées avec de l'IFNy n'a pas été recruté à la muqueuse gastrique (Figure 3E, F). L'expression de la DP-tagged stMSC vect traitement des cellules avec l'IFNy a été confirmée par RT-PCR (figure 3G). Pour déterminer si le recrutement des cellules souches mésenchymateuses à la muqueuse gastrique en réponse à l'IFNy était unique aux stMSCs, l'expérience a été répétée en utilisant soit wtMSCs ou wtMSCs sur-exprimant Shh (wtMSC Shh). Bien que les deux cellules Shh wtMSC et wtMSC ont été détectés dans l'estomac de souris IFNy traités, il y avait un nombre significativement plus élevé de wtMSC Shh et stMSC vect cellules au sein de la muqueuse gastrique par rapport à la cellule wtMSC transplanté groupe (Figure 3H). Collectivement, ces données suggèrent que la signalisation de Shh est susceptible de médier le recrutement de cellules souches mésenchymateuses à la muqueuse gastrique en réponse à l'IFNy.}

Il y avait une augmentation significative du nombre de cellules qui prolifèrent à l'intérieur de la muqueuse gastrique en réponse à l'IFNy -Traité wtMSC ^{Shh et stMSC vect souris transplantées par rapport aux souris PBS-injectées (Figure 4A-D, Figure S5A-F). Cependant, les CSM ont été BrdU négative (figure 4B, C et Figure S5A-D). Bien que stMSC cellules ShhKO transplantées dans des souris injectées avec de l'IFNy ont pas été recrutés pour la muqueuse gastrique, il n'y avait pas de différence dans la prolifération épithéliale entre les traitements PBS et IFNy dans ce groupe expérimental, ce qui suggère une augmentation MSC dérivée Shh peut être nécessaire pour soutenir cette prolifération accrue (figure 4D). En outre, bien wtMSCs ont été recrutés pour la muqueuse gastrique en réponse à l'IFNy, il n'y avait pas de différence dans la prolifération epitheliale entre les traitements PBS et IFN-y (figure 4D). Ces données suggèrent que la signalisation de Shh à l'intérieur wtMSCs Shh et stMSCs en réponse à l'IFN-y induit une prolifération au sein de l'épithélium gastrique. IFNy seul, en l'absence de stMSCs, ne provoque pas de prolifération dans la muqueuse gastrique confirmant cet effet ne soit pas liée à l'inflammation seul.}

Afin de déterminer si une diminution stMSC la prolifération, après le recrutement, a été associée à l'adhésion cellulaire au sein de la épithélium gastrique, les estomacs ont ensuite été co-tachée E-cadhérine et RFP (Figure 4G-I). les souris qui ont été transplantés avec DP-tagged stMSC ^{vect cellules ont montré aucun recrutement de cellules à la muqueuse gastrique (figure 4G) PBS-traitée. Conformément à la figure 3, les souris qui ont été transplantés avec DP-tagged stMSC vect cellules ont montré le recrutement marqué des cellules à la muqueuse gastrique (Figure 4H) IFNy injecté. RFP-taggés cellules stMSC Vect co-localisée avec la E-cadhérine (Figure 4G, I) soutenant que les cellules recrutées avaient greffé au sein de l'épithélium gastrique.}

Hedgehog Signaling médie l'expression de Focal Adhesion Protein en réponse à SDF-1α chimiokine

Nous avons choisi d'enquêter sur l'axe SDF-1α /signalisation CXCR4 comme il a été établi que cette voie de signalisation favorise MSC recrutement [23], [24].

• PLOS ONE: Headless Unexpected et Tailless poisson dans le contenu de l'estomac du requin-taupe bleu Isurus oxyrinchus
• PLOS ONE: Les chauves-souris insectivores Digest chitine dans l'estomac en utilisant Acidic Mammalian Chitinase