Proteomanalys av mänsklig gastric cardia adenocarcinom med laser capture microdissection

Proteomanalys av mänsklig gastric cardia adenocarcinom med laser capture microdissection Bild Sammanfattning
Bakgrund
Förekomsten av mag hjärt adenokarcinom (GCA) har ökat under de senaste två decennierna i Kina, men de molekylära förändringar som rör cancer har inte väl karakteriserade.
metoder
I denna studie använde vi en jämförande proteomik metod för att analysera de maligna och icke-maligna gastric cardia epitelceller isolerade genom navigeras laser capture microdissection (LCM) från parade kirurgiska exemplar av mänsklig GCA.
Resultat
Tjugosju fläckar motsvarande 23 proteiner genomgående differentiellt regleras. Femton proteiner visat sig vara uppreglerat, medan åtta proteiner visade sig vara nedregleras i maligna celler jämfört med icke-maligna kolumnära epitelceller. De identifierade proteinerna verkade vara involverade i metabolismen, chaperone, antioxidationsmedel, signaltransduktion, apoptos, celltillväxt och differentiering. Dessutom har uttryck av Hsp27, 60, och Prx-2 i GCA prover bekräftas ytterligare av immunhistokemisk och western blöt analyser.
Slutsats
Dessa data visar att kombinationen av navigeras LCM med 2-DE ger en effektiv strategi för att upptäcka proteiner som är differentiellt uttryckta i GCA. Sådana proteiner kan bidra att belysa de molekylära mekanismerna för GCA karcinogenes. Dessutom ger kombinationen potentiella kliniska biomarkörer som stöd i tidig upptäckt och ge potentiella terapeutiska mål.
Bakgrund
Olika analyser av cancerincidensdata gallrats från västländer har visat snabbt stigande andelen adenocarcinom i matstrupen och magsäcken magmunnen i de senaste årtiondena, jämfört med de stabila och sjunkande priser för esofagus skivepitelcancer (SCC) och distal gastrisk adenokarcinom (DGA) [1-3]. Detta fenomen är också tydligt i Kina, förutom att den ökande förekomsten av gastric cardia adenocarcinom (GCA) visas betydligt högre än förekomsten av matstrupscancer. Tyder på att GCA är en tydlig klinisk enhet som dess patogenes och riskfaktorer är helt annorlunda från DGA. Därför är GCA mycket vanligare, med en högre förekomst av lymfkörtelmetastaser och en sämre prognos än DGA [4]. Den årliga incidensen av GCA är 50 /100.000 och kan även vara så hög som 190 /100.000 i flera regioner i Kina [5]. Den relativt symptomfria naturen i de tidiga stadierna av sjukdomen och bristen på lämpliga screeningtest har resulterat i en majoritet av GCA patienter med diagnosen att vara på ett redan långt framskridet stadium av sjukdomen. Således är det nödvändigt att förstå den molekylära mekanismen av cancer och för att identifiera biomarkörer för tidig diagnos och effektiv behandling av mänsklig GCA.
Nyligen har proteomet vuxit fram som ett komplement komponent i genomet. Antagandet är att det drastiskt skulle kunna bidra till att reda ut de biokemiska och fysiologiska mekanismer för komplexa multivariata sjukdomar på funktions molekylär nivå. Även genetisk mutation och /eller vandrande genuttryck kan ligga bakom en sjukdom, är de biokemiska grunden för de flesta sjukdomar som orsakas av proteinskador. Därför skulle en analys av den globala protein överflöd i humana tumörer, som kallas cancer proteomik, erbjuder många möjligheter och utmaningar för att identifiera nya tumörmarkörer och terapeutiska mål samt förstå tumör patogenes. Närvarande, två-dimensionell gelelektrofores (2-DE) och masspektrometri (MS) är de mest allmänt använda verktyg för separering och identifiering av proteiner. Dock är heterogenitet alltid ett problem i studier av human tumörvävnad. Även cellkultur är en metod för att lösa detta problem kan det inte korrekt representerar de molekylära händelser som äger rum i själva vävnad från vilken de härrör [6]. En jämförelse mellan humant prostatacellinjer och tumörceller från samma patienter visade att 20% av proteinprofiler var förändrade [7]. Laser capture microdissection (LCM) är en utveckling nyligen som kan användas för att skaffa mycket representativt subpopulation av celler från komplexa heterogena vävnadsprover [8]. Denna teknik har använts med stor framgång i en mångfald av studier med nedströms analys på DNA och RNA-nivåer, inklusive global profilering av genuttryck [9] och analyser av proteomet av prostata [7], kolon [10], hepatocellulär [11 ], bröst [12], och pankreastumörer [13]. Emellertid har kombinationen av två-DE och MS aldrig använts för studier av den mänskliga GCA.
Denna studie syftar till att beskriva karcinogenes av GCA och identifiera GCA-specifika sjukdomsassocierade proteiner som potentiella kliniska biomarkörer för tidig upptäckt och nya terapeutiska mål. Vi genomförde Navigerad LCM att berika både maligna och icke-maligna gastric hjärt epitel celler från parade kirurgiska exemplar av mänsklig GCA. De proteiner extraherade från dessa celler separerades med 2-DE. Differentialproteinfläckar identifierades genom peptidmassa fingeravtryck (PMF) baserat på matrisassisterad laserdesorption /jonisering time-of-flight-masspektrometri (MALDI-TOF MS) och databassökning. Giltighetstiden för dessa fynd bekräftades genom immunhistokemisk och western-blot-analyser Metoder
.
Material
IPG remsor (pH 3-10 olinjära) och IPG buffertlösningar (pH 3-10 olinjära) köptes från Amersham Pharmacia Biotech (APB, Sverige). DTT, urea, tiourea, Tris-bas, TX-100, CHAPS, glycin, akrylamid, metylenbisakrylamid, SDS, TEMED, ammoniumpersulfat, silvernitrat, Trypsin (sekvense kvalitet), ACN, och TFA köptes från Sigma (St. Louis, MO, USA). Slutligen det kompletta proteasinhibitor cocktail var från Roche (Lewes, UK). Milli-Q-kvalitet vatten användes för alla lösningar.
GCA prover
Nio par av human gastrisk magmunnen adenokarcinom och deras intilliggande nontumourous Cardias vävnader erhölls inom 30 minuter efter en kirurgisk resektion vid den andra Anslutna sjukhuset i Xi " en Jiaotong University 2005 (tabell 1). För att undvika uppenbara områden av ulcus eller nekros ades proverna anskaffas från kanterna av tumörerna. De frystes omedelbart i flytande kväve och lagrades vid -80 ° C fram till användning. Informerade medgivanden erhölls från alla patienter. Samtidigt två erfarna patologer utvärderade tumör klassificering av en mikroskopisk undersökning av samples.Table 1 Kliniska och histologiska data för patienttumörprover
Case

Age

Gender

Locationa)

Size(cm)

Grade

1
58
M
Within 2 cm GEJ
1,5 × 2 Review Måttligt differentierat 2
63
M
Inom 2 cm GEJ
5 × 6
Måttligt differentierade
3
46
M
Inom 2 cm GEJ
4 × 5
Måttligt differentierade 4
60
M
Inom 2 cm GEJ
2 × 2,5
Väl differentierad
5
73
M
Inom 2 cm GEJ
3 × 1
Väl differentierad
6
70
M
Inom 2 cm GEJ
2 × 1
Väl differentierad
7
55
M
Inom 2 cm GEJ
2 × 3
Dåligt differentierade
8
51
M
Inom 2 cm GEJ
4 x 6
Dåligt differentierad
9
63
M
Inom 2 cm av GEJ
3 × 2,5
Dåligt differentierad
a) Plats: epicentrum tumörvävnad
Provberedning för LCM
avsnitten (8 um tjocka) skars på objektglas (förrenade med tvättmedel, tvättades med avjoniserat vatten, och doppades i etanol) med användning av en Leica CM 1900 kryostat (kammartemperatur -28 ° C). Snitten lagrades antingen vid -80 ° C eller hålls i kryostaten kammaren före LCM. Hematoxylin färgning genomfördes endast för övervakning av vävnadssnitt och inte används i samband med LCM. Sektioner fixerades (70% etanol under 1 min), hematoxylin färgade och dehydrerades (70% etanol under 45 s, 95% etanol under 45s, 2 x 100% etanol under 30-talet, och följt av xylen 2 × för 5 min). Samtidigt har ofärgade sektioner som används för LCM. De fixerades (70% etanol i 30 s), tvättades i avjoniserat vatten för 10s, och dehydrerades (70% etanol under 15 s, 95% etanol under 15 s, 2 x 100% etanol under 15s, och följt av xylen 2 x 1 min ). Komplett proteashämmare cocktail tabletter
navigeras LCM
Efter fixering och dehydrering, var ofärgade sektioner lufttorkas och microdissected hjälp av Arcturus PixCellα systemet (Arcturus, Mountain View, CA, USA). LCM mikroskop avbildas en hematoxylin färgas avsnitt intill en av intresse. Denna bild visades på LCM datorskärmen med hjälp av LCM bildanalysprogram (Arcturus, USA) och användes som en karta för att avgränsa området för dissekering på en intilliggande ofärgade sektion. Sektionerna sedan tagits med en 15 um laser diameter trålen typiskt vid 50-80 mV ström med pulslängd av 3-10 ms i kulspruta läge och med en laseravfyrningsfrekvens av ett skott per 500 ms. I genomsnitt var mellan 10,000-12,000 skott tas per lock, och cirka 25000-30000 celler erhölls per cap. Varje lock fångades inom en timme. Baserat på en noggrann genomgång av de histologiska sektioner, var varje dissekering uppskattas innehålla ≥ 95% av de önskade cellerna.
Microdissection caps infördes i 0,5 ml mikrocentrifugrör innehållande 50 ul av en lysisbuffert (7 M urea, 2 M tiourea, 4% vikt /volym CHAPS, 65 mM DTT, 0,5% v /VTX-100, 40 mMTris-Base, och fullständig proteasinhibitor cocktail). Varefter cellerna solubiliserades genom inversion av rör följt av vortex-blandning under 1 min och kort puls-centrifugering vid 12, 000 x g. Efteråt var vävnader från flera lock (cirka 800.000 ~ miljon celler) utvinns i samma lysisbuffert tills tillräckligt material hade samlats. Proverna centrifugerades vid 40.000 x g under 1 timme vid 4 ° C. Om det är nödvändigt, var supernatanter vid -80 ° C tills vidare användning. Proteinkoncentrationen bestämdes genom Bradford-metoden.
2-DE
första dimensionella isoelektrisk fokusering (lEF) utfördes på Pharmacia Immobiline IPG DryStrip systemet (Uppsala, Sverige). För den första dimensionen av elektrofores överfördes proven innehållande 60 ug protein för analys geler utspäddes till 250 uL med en vätskeersättning (7 M urea, 2% vikt /volym CHAPS, 50 mM DTT, 0,5% v /v IPG-buffert (pH 3-10 olinjära), och spår bromofenolblått) innan du lägger på 13 cm IPG remsor (pH3-10 olinjära). LEF genomfördes därefter med användning IPGphor elektroforesenhet i enlighet med tillverkarens instruktioner. Därefter tillsattes remsorna ekvilibrerad med en lösning (6 M urea, 30% vol /vol glycerol, 2% vikt /volym SDS och 50 mM Tris-HCl, pH 8,8), reducerades med 1% vikt /volym DTT under 15 min och alkyleras med 2,5% vikt /volym jodacetamid i 15 min. Remsorna sköljdes sedan i elektroforesbuffert (25 mM Tris-bas, 192 mM glycin och 0,1% vikt /volym SDS), appliceras på 11% akrylamidgeler, och förseglas med smält agaros (0,5% vikt /volym agaros i elektroforesbuffert innehållande en spår av bromfenolblått). SDS-PAGE utfördes med användning av Hoefer SE 600 vertikal kammare och en Tris-glycinbuffert (25 mM Tris och 192 mM glycin) innehållande 0,1% vikt /volym SDS, med initial separation vid en konstant 10 mA /gel i 30 min följt av 20 mA /gel. Den andra dimensionella SDS-PAGE utvecklades tills bromfenolblått färgämnet markör hade nått botten av gelén. Den totala körtiden var typiskt 4 till 4,5 timmar. Gelerna fixerades i 10% volym /volym ättiksyra, 40% vol /vol etanol före sensibilisering under 30 min i en buffert innehållande 30% volym /volym etanol, 0,2% vikt /volym natriumtiosulfat, och 0,83 M natriumacetat. Detta följdes av tre 15 min tvättar i avjonat vatten. Proteinerna färgades sedan med 0,1% vikt /volym silvernitrat under 20 minuter, tvättades två gånger i avjoniserat vatten i 1 min, och framkallades i 2,5% vikt /vol natriumkarbonat innehållande 0,04% volym /volym formaldehyd (37% lösning). Den Utvecklingen stoppades med 1% volym /volym ättiksyra, och gelerna tvättades tre gånger i vatten.
Bildanalys och statistisk analys
Umax ImageScanner (Amersham Biosciences) användes för att scanna de geler, medan Bild Master ™ 2D Platinum Version 5.0 programvara (Amersham Biosciences) användes för punktdetektering, kvantifiering och matchning. Intensiteten för varje fläck kvantifierades genom% volym. Data analyserades sedan med användning av SPSS för Windows 11,5 och Excel. Students t
-test användes för att analysera skillnaderna i proteinnivåer mellan GCA och icke-tumörprover, med en konfidensnivå på 95%.
MALDI-TOF-MS och databassökning Review konsekvent och signifikant annorlunda fläckar ut för analys av MALDI-TOF MS. Protein fläckar av intresse skars ut och malet i små bitar, följt av avfärgning och tvättning med avjoniserat vatten flera gånger tills den gula färgen försvann. Gelstycken sköljdes sedan med 25 mM ammoniumbikarbonat, dehydratiserades med ACN, och torkades i en vakuumcentrifug. Efteråt gjordes proteiner i-gel spjälkades med 0,02 ug /uL trypsin över natten vid 37 ° C. Tryptiska peptiderna sedan åter upp i en lösning innehållande 50% volym /volym ACN och 0,2% volym /volym TFA. En 2 uL alikvot fläckades på en provplatta med 4 ul av matrislösningen CHCA (a-cyano-4-hydroxcinnamic syra, 10 mg /ml i 50% volym /volym ACN, 0,2% volym /volym TFA) och fick luft torr. De torkade fläckar analyserades sedan i en Voyager DE MALDI-TOF MS (Framingham, MA, USA). Detta följdes genom att köra spektrometern i en positiv jon-läge och i reflektor läge med följande inställningar: accelerationsspänning, 20 kV; Gride spänning, 94%; styrtråd spänning, 0,01%; och en fördröjning på 200 ns. Spectra förvärvades manuellt med laserintensiteten satt till 3200 med 80 bilder per spektrum. Därefter massområde inställdes mellan m
/z och m
/z
500
5000. Intern kalibrerings applicerades med användning av angiotensin II och insulin B-kedjan toppar vid 912,08 Da och 3495,95 Da.
Proteiner identifierades genom peptidmassa-fingeravtryckstagning med användning av sökprogrammet Aldente [14] med följande sökparametrar tillämpas: SWISS-PROT och Trembl användes som proteinsekvensdatabaser; en massa tolerans av 100 ppm och en ofullständig klyvning fick; carboxyamidomethylation, oxiderade metionin, och fosforylering ansågs eventuella ändringar; det minsta antalet matchade-peptider var 4; och peptiden jonen var [M + H] +.
Immunohistokemisk och Western blot-analys
För att validera av uttrycksmönstret för tre proteiner i GCA vävnader, var immunohistokemi utfördes med användning av formalinfixerade och paraffininbäddade vävnads exemplar som matchas med 2-DE prover. Avvaxade 5 um tjocka sektioner behandlades med en 0,3% väteperoxidas i 3 min och med ett blockerande antikroppen under 30 minuter. Efter värmeförmedlad antigenåtervinning, var sektioner inkuberades med primär antikropp vid 4 ° C över natten enligt följande: Hsp27 (Sigma, St. Louis, MO, USA), 1: 500; HSP60 (Santa Cruz, USA), 1: 300; och (Santa Cruz, USA), en Prx-2: 150. Sektioner inkuberades sedan med ett peroxidas-märkt antikropp (1: 500)., Framkallad med diaminobenzine, och motfärgades med hematoxylin
För western blot-analys, var de proteinprover (30 ^ g) som används i 2-DE kördes på 12% SDS-PAGE, överfördes till PVDF-membran, och blockerades sedan med PBS /5% skummjölk /0,01% Tween under 2-4 timmar vid rumstemperatur. Primär antikropp späddes ut i blockeringsbuffert och tillsattes enligt följande: Hsp27, 1: 200; HSP60, 1: 300; och Prx-2, 1: 200. Efteråt visade det inkuberades med en pepparrotsperoxidas (HRP) -konjugerad sekundär antikropp och en HRP-konjugerad anti-GAPDH /β-aktin-antikropp för att bekräfta lika proteinladdning i varje spår i 1-2 timmar vid 37 ° C eller rumstemperatur. Proverna tvättades och detekteras med förstärkt kemiluminescens för 30-60 s (Minipore).
Resultat
Profil skillnader mellan navigerat LCM prover och hela undissected kryostat vävnader
att utvärdera effekterna av navigerat LCM på profiler vävnadsprotein, utförde vi 2-DE-proteinprofiler av hela undissected kryostat vävnader och LCM-prover av GCA. Figur 1 visar ett exempel på den navigeras LCM processen. Majoriteten av fläckarna som detekteras i de dissekerade icke-tumör och tumörvävnad kunde observeras i hela undissected kryostat vävnader, med undantag för flera platser. Det finns emellertid fortfarande vissa fläckar som finns i hela undissected kryostat vävnad som inte kunde observeras i båda LCM proven. Således kan denna teknik inte bara berika icke-tumör och tumör epitelceller men kan också minska föroreningen i vävnader såsom hemoglobin [10, 11]. Dessutom skulle navigeras LCM processen eliminera effekterna av färgning på proteinseparation med 2-DE [15]. Således, våra data stöder behovet att utföra Navigerad LCM i proteomik studier av GCA vävnader. Figur 1 Navigerad laser capture microdissection av tumörvävnad. (A) Haematoxylin-färgade gastric cardia adenocarcinom; (B) Obehandlat GCA vävnad; (C) Tumör vävnad efter microdissection; (D) fångades tumörceller på LCM film.
Profil skillnader i proteinuttryck mellan GCA vävnader och omgivande icke-tumörvävnader
Vi gjorde en navigeras LCM och 2-DE för matchade par av tumörvävnad och omgivande icke- tumörvävnad från GCA patienter. Cirka 800-1000 proteinfläckar detekterades genom silverfärgning. För att mäta reproducerbarhet, varje prov genomgick försöket tre gånger. Det fanns 905 ± 74 och 867 ± 51 proteinfläckar på kartan över GCA och icke-tumör i magsäcken hjärtvävnad, respektive. De matchade fläckar var 799 ± 29 och 727 ± 34 separat, och respektive genomsnittliga träffresultat var 88,2% och 83,8%. Dessutom den genomsnittliga positionen avvikelsen för matchade fläckar var 1,031 ± 0,205 mm och 1,44 ± 0,11 mm i IEF och SDS-PAGE-riktningen, respektive. Även bildanalysen visade att dessa två-DE kartor var reproducerbar, fanns små skillnader i intensitet och antalet platser. Trots en analys av gelerna visade 27 proteinfläckar vars intensiteter varierade kraftigt och konsekvent mellan icke-tumör och tumörvävnad (Fig. 2). Förhållandena av normaliserade fläckintensiteterna för cancer till paraneoplasis vävnader för var och en av de proteiner av intresse beräknades. Ställen som visar en två-faldig skillnad och med statistisk signifikans (p < 0,05) valdes. Tre av de två-DE resultat bekräftades genom immunhistokemisk och western blot-analyser. Figur 2 2-DE karta över maligna och icke-malign gastric cardia vävnad. Alla kartor som visas framställs från samma patient. (A) 2-DE-karta över hela undissected kryostat vävnader; (B) 2-DE-karta av icke-tumörvävnad efter LCM; (C) 2-DE karta över GCA vävnad efter LCM.
Protein identifiering
Båda hela undissected kryostat prover och LCM-prover användes för proteinidentifiering. Tjugosju olika proteinfläckar mellan GCA vävnader och omgivande icke-tumörvävnader skars. Emellertid var endast 23-proteiner identifieras genom MALDI-TOF-MS (Tabell 2). Detta fenomen beror sannolikt på posttranslationella modifieringar såsom peroxiredoxin 1 (Prx-1), som var närvarande i två intilliggande fläckar (fig. 2, spot 11). Dessa proteiner klassificerades i något av följande: celltillväxt och differentiering (ANXA2, ANXA4, hnRNPA2 /B1), apoptos (Prx-1, Prx-2, GSTP, VDAC, ETFB), metabolism (ADH1C, AKR1C3, CA2, GATM ), proteas relaterade (CTSD, PACSIN1), cystoskeleton (Actin 1, Keratin 8), chaperoner (Hsp27, 60, 70, PDIA3), och RNA-bindande och transkription (hnRNPH3, PCBP1, ENO1). Figur 3 visar kartorna PMF av HSP60.Table 2 Proteiner med differentiell expression mellan GCA tumörvävnader och angränsande parade icke-tumörvävnader identifierades genom MALDI-TOF MS
Uppreglering proteiner
Spot no
protein
anslutnings No.a) Review Mr /PIB) Review Match
Cov (%) c) Review T-test
Ration (tumör /icke-tumör) Medel ± SD 1
Heat-shock protein beta-1 (Hsp27) *
P04792
23 /6,0
9
54
0,0040
3,4279 ± 2,0727 2
Värmechock chock~~POS=HEADCOMP 70 kDa protein 5 (HSP70) Review P11021
70 /5,0
22
42
0,0030
3,2597 ± 1,5314
3
60 kDa värmechockproteinet (HSP60) *
P10809
58 /5,2
12
37
0,0001
2,8308 ± 1,1426 4
proteindisulfidisomeras A3 (PDIA3) *
P30101
54 /5,6
13
41
0,0280
4,2105 ± 2,7294
5
Annexin A4 (ANXA4) katalog P09525
36 /5,8
10
34
0,0140
4,7153 ± 7,3434
6
Annexin A2 (ANXA2) katalog P07335
38 /7,5
7
26
0,0150
6,0722 ± 5,5431
7
Heterogena kärn ribonukleoproteiner A2 /B1 (hnRNP A2 /B1 ) *
P22626
37 /9,0
16
43
0,0050
10,7775 ± 9,5547
8
Cathepsin D tung kedja (CTSD) Review P07339
27 /5,6
12
61 0,0012
4,3552 ± 3,7703
9
protein~~POS=TRUNC kinas~~POS=HEADCOMP C och kasein kinas substrat i nervceller protein 1 (PACSIN1) Review Q9BY11
51 /5,1
5
24
0,0028
2,6026 ± 1,2147
10
Glutation S-transferas P (GSTP) *
P09211
23 /5,4

5
44
0,0026
3,8757 ± 2,2198
11
peroxiredoxin-1 (Prx-1) *
Q06830 22 /8,3
8
59
0,0140
4,2744 ± 4,1568
12
Poly (rC) -bindande protein1 (PCBP1) *
Q15360
37 /6,7
12
63
0,0070
2,7401 ± 0,5321
13
Aldo-keto-reduktas familj 1member C3 (AKR1C3) katalog P42330
37 /8,1
7
25
0,0040
2,7762 ± 1,1820
14
Glycineamidinotransferase (GATM) Review P50440
44 /6,4
8
23
0,0390
2,7839 ± 0,4680
15
Keratin, typ II cytoskelett 8 (Keratin 8) *
P05787
54 /5,5
9
25
0,0020
3,5063 ± 0,6423
nedreglering proteiner
16
aktin , cytoplasmiska en (aktin 1) *
P60709
42 /5,3
6
30
0,0160
0,2603 ± 0,1539
17
Heterogena kärn ribonukleoproteiner H3 (hnRNPH3)
P31942
37 /6,4
5
28
0,0015
0,6028 ± 0,6229
18
peroxiredoxin-2 (Prx-2) *
P32119
22 /5,7
6
24 0,0250
0,2376 ± 0,1202
19
Carbonic anhydrase2 (CA2) *
P00918
29 /6,8
6
33
0,0130
0,3675 ± 0,1270
20
Alpha-enolas * (ENO1) katalog P06733
47 /7,0
16
42
0,0030
0,2898 ± 0,1340
21
Alkohol dehydrogenas 1C (ADH1C) katalog P00326
40 /8,6
7
49
0,0280 0,2287 ± 0,1680
22
Elektronöverföring överföring~~POS=HEADCOMP flavoprotein subenhet B (ETFB) katalog P38117
28 /8,3
6
26
0,0240
0,2655 ± 0,1415
23
Spänningsberoende beroende~~POS=HEADCOMP anjon -selektiv kanal (VDAC) *
P21796
31 /8,6
7
39
0,0120
0,4474 ± ​​0,0297
a) Swiss-Prot accessionsnummer.
b ) Teoretiskt värde
c) Sekvens täckning%
* proteinerna har återfunnits i magcancer tidigare.
Figur 3 MALDI-TOF MS identifiering av plats 3 i GCA.
Immunohistokemisk och western blot-analys för HSP 27, 60, och Prx-2 i GCA
för att ytterligare undersöka huruvida Hsp27, 60, och Prx-2 är uttryckta i vävnader och för att bestämma vilka celler uttrycker dessa proteiner, har immunohistokemisk analys utfördes med användning av formalinfixerade och paraffin- inbäddade vävnadsprover som matchas med 2-DE prover. Uttrycket av Hsp27 och 60 kunde ses i alla cytoplasmor av cancerceller, medan det kunde ses i några av de cytoplasmor av columnar epitel (Fig. 4A-D) i icke-tumörvävnader. Däremot var Prx-2 nästan inte visat sig uttryckas i cancerceller, utan i vissa cytoplasmor av kolonn epitelceller (Fig. 4E, F). För att undersöka dessa proteinexpressionsnivåer, utfördes Western blot-analys också med användning av samma vävnader (Fig. 5). Som väntat var Hsp27 och 60 visade sig vara konsekvent högt uttryckt i tumörvävnad, medan Prx-2 undertrycktes. Figur 4 Immunhistokemisk analys för Hsp27, 60, och Prx-2 i humant normalt gastric cardia och GCA. Uttryck av Hsp27 (A), 60 (C), och Prx-2 (E) var i cytoplasman av tumörceller; Uttryck av Hsp27 (B), 60 (D) och Prx-2 (F) hittades i cytoplasman hos normala kolumnära epitelceller; Förstoringar: A-F × 40, motfärgades med hematoxylin
Figur 5 Western blot-analys för validering av den ökad expression av Hsp27, 60, och minskad expression av Prx-2 i GCA vävnader.. . GAPDH och β-aktin användes som referenser
Diskussion
Cardia är den anatomiska gränslandet mellan matstrupen och magsäcken; därmed finns det konstant kontroverser om deras förhållande när det gäller epidemiologi, kliniska funktioner och klassificering bland esofagusadenokarcinom (EA), GCA, och DGA. Att jämföra deras proteinprofiler, vi sökte litteraturen för att hitta dessa proteiner. Tretton av 23 proteiner har hittats i DGA tidigare (Tabell 2). Bland dem, Hsp27, 60, 70, PDIA3 och CA2 har samma uttrycksmönster i GCA och DGA. Däremot var en låg nivå uttryck av Hsp27 finns i EA [16-20]. Därför är tumörbildning av GCA skiljer sig från EA och DGA, och därmed GCA bör vara en tydlig patologisk enhet.
Cellular heterogenitet har varit ett betydande hinder för molekylär analys av normala och sjuka vävnader. Först beskrevs av Emmert-Buck et al. 1996, är laser capture microdissection en kraftfull och exakt teknik som används för att studera proteinförändringar i en viss delmängd av celler i en lättskött system som är lätt att använda [8]. Som vanligt är olika histokemiska fläckar av vävnadssnittet som används för att styra dissekering processen. Däremot har flera fall visat måttlig till dramatiska effekter av färgning på proteinseparation med 2-DE [21, 22]. För att eliminera missfärgning som en potentiell skadlig effekt har Navigerad LCM nyligen utvecklats. Den använder ett målat sektion för att styra dissektion av de ofärgade intilliggande provet [23]. Denna teknik har tillämpats med framgång i studiet av hjärnprover [15]. Dessutom, på grund av de typiska morfologiska egenskaperna hos mag hjärt ytliga kolonn cell och hjärtkörteln, de är lätta att identifiera på en uttorkad avsnitt utan färgning. Därför blev navigerat LCM en optisk strategi i vår proteomik strategi. I denna forskning, antalet LCM-derived icke-maligna och maligna celler varierade kraftigt och var ofta små jämfört med hela undissected kryostat vävnader, trots de profiler som var mycket lika mellan LCM proven och undissected sådana. Detta indikerade att den navigeras LCM kan vara ett möjligt tillvägagångssätt för studier av gastrisk hjärtvävnad och att det är kompatibelt med 2-DE och MALDI-TOF MS.
Vi erhållna proteinprofilen GCA genom att jämföra förändringar i proteinet profiler av omgivande icke-tumörvävnader. För att minska individuella skillnader, var vävnadsprover från samma patient, som gör det möjligt för oss att studera differentiell proteinuttryck i liknande genomisk bakgrund. Så vitt vi vet, rapporterade vi det första proteomik analys av GCA. Av de 27 utvalda proteinfläckar, var 23 proteiner i molekylmassa intervallet 15 till 75 kDa och med en isoelektrisk punkt mellan 3 och 10 identifieras med hjälp av två-DE och MALDI-TOF MS. De flesta av dessa proteiner har beskrivits tidigare som differentiellt uttryckt antingen på mRNA-nivån eller vid proteinnivån i andra typer av human cancer.
HSPs är en grupp av stressproteiner som induceras av olika typer av miljö och patofysiologiska förolämpningar. I denna studie var co-up-förordningar Hsp27, 70, och 60 återfinns i magsäckens hjärttumörvävnad. Som följeslagare, kan Hsp27 och HSP70 hämmar apoptos genom att interagera med apoptosome och kaspas aktiveringskomplex [24], underliggande sina roller i tumörprogression och resistens mot behandling [25]. Ett flertal studier visar att Hsp27 och Hsp70 overexpressions signalera en dålig prognos och förutsäga ett dåligt svar på kemoterapi. HSP60 tycks vara en viktig endogen inflammatorisk medlare och förmodligen släpptes av skadade celler. Dessutom tillsammans med HSP70 har HSP60 en roll i antigenpresentation i maligna sjukdomar [26]. HSP är också överuttryckt i bröst-, kolorektal-, ventrikel- och prostatakarcinom [10, 25]. Därför kan överuttryck av Hsp27, 70, och 60 vara användbara biomarkörer för cancer i GCA och kan associeras med graden av differentiering och prognosen för GCA.
Bland identifierade proteiner, är två proteiner involverade i regleringen av transkription och expression av tumörassocierade gener. PCBP1, uppreglerat i GCA, är ett RNA chaperon posttranskriptionell regulator. Det har visats att PCBP1, tillsammans med PTB-1 och hnRNPK, styr vissa proto-onkogen gener och apoptosrelaterade gener uttryck, såsom Bag-1, c-
myc, Apaf-1, XIAP, och DAP5, genom att stimulera aktiviteten av interna ribosomen inträde segment (IRES). PCBP1 krävs för att öppna RNA i den region som innehåller inmatningsfönstret ribosomen, medan PTB-1 kan krävas för ribosomen rekrytering [27, 28]. Nyligen Pickering, B.M. et al. beskrev att de glykan delar PCBP1 kan bero på metastaserande förmåga och kan spela en roll i hepatocellulär cancer metastaser [27]. Sedan uppreglering av PCBP1 får reglera mekanismen för translationsinitiering av hjärttumörassocierade gener i utvecklingen av GCA cap-oberoende. Som en tumörsuppressor, kan Alpha-enolas reglera c-myc-promotoraktivitet i form av en c-myc-bindningsprotein (MBP-1). MBP-1 kan sedan binda till P2-element i c-myc-promotom och konkurrera med TATA-box-bindande protein (TBP) för att undertrycka transkriptionen av c-myc [29, 30]. Å andra sidan, är nedreglering av Alfa-enolas i enlighet med arbetet av Chang YS et al.

• Kliniska betydelsen av palliativ gastrektomi på överlevnaden hos patienter med obotlig avancerad magsäckscancer: en systematisk genomgång och meta-analysis
• MicroRNA-645, uppreglerat i mänsklig adencarcinoma av mag esofagus korsning, hämmar apoptos genom att rikta tumörsuppressor IFIT2