Proteom analyse av menneskelig mage Cardia adenokarsinom med laser capture mikrodisseksjon

Proteom analyse av menneskelig mage Cardia adenokarsinom med laser capture mikrodisseksjon
Abstract
Bakgrunn
forekomsten av mage hjerte adenokarsinom (GCA) har vært økende de siste to tiår i Kina, men de molekylære endringer knyttet til kreftutvikling har ikke vært godt karakterisert.
Metoder
i denne studien brukte vi en komparativ proteomikk tilnærming til å analysere det ødeleggende og ikke-ondartede mage Cardia epitelceller isolert etter navigert laser capture mikrodisseksjon (LCM) fra sammenkoblede kirurgiske eksemplarer av menneske GCA.
Resultater
Twenty-syv plasser som tilsvarer 23 proteinene ble konsekvent ulikt regulert. Femten proteiner ble vist å være oppregulert, mens åtte proteiner ble vist å være nedregulert i maligne celler sammenlignet med ikke-ondartede søyle epitelceller. De identifiserte proteiner som så ut til å være involvert i metabolisme, anstand, antioksydasjon, signaltransduksjon, apoptose, celleproliferasjon og differensiering. I tillegg ble det uttrykk for HSP27, 60, og prx-2 i prøvene GCA ytterligere bekreftet ved immunohistokjemisk og Western blot-analyser.
Konklusjon
Disse data indikerer at kombinasjonen av navigert LCM med 2-DE gir en effektiv strategi for å oppdage proteiner som er forskjellig uttrykt i GCA. Slike proteiner kan bidra i å belyse de molekylære mekanismene for GCA kreftutvikling. Videre gir kombinasjonen potensielle kliniske biomarkører som kan benyttes til tidlig oppdagelse og gi potensielle terapeutiske mål.
Bakgrunn
Ulike analyser av kreftforekomst data hentet fra vestlige land har avslørt raskt stigende priser av adenokarsinom i spiserøret og mage Cardia i de siste tiårene, sammenlignet med stabile og fallende priser for esophageal plateepitelkarsinom (SCC) og distal adenokarsinom i ventrikkel (DGA) [1-3]. Dette fenomenet er også tydelig i Kina, med unntak av at den økende forekomsten av mage cardia adenokarsinom (GCA) vises særlig høyere enn forekomsten av spiserørskreft. Mye tyder på at GCA er et tydelig klinisk enhet som sin patogenese og risikofaktorer er ganske forskjellig fra DGA. Derfor er GCA langt mer utbredt, med en høyere forekomst av lymfeknutemetastase og dårligere prognose enn DGA [4]. Den årlige Forekomsten av GCA er 50 /100.000, og kan til og med være så høy som 190/100 000 i flere regioner i Kina [5]. Den relativt asymptomatisk natur i de tidlige stadier av sykdommen og mangelen på tilstrekkelig screeningtester har resultert i et flertall av GCA pasienter diagnostisert til å være på en allerede avansert stadium av sykdommen. Det er således nødvendig å forstå den molekylære mekanisme av karsinogenese og for å identifisere biomarkører for tidlig diagnose og effektiv behandling av human GCA.
Nylig har proteomet dukket opp som en komplementkomponent av genomet. Antakelsen er at det kan drastisk hjelpe i å rakne de biokjemiske og fysiologiske mekanismer av komplekse multivariate sykdommer på den funksjonelle molekylært nivå. Selv om genetisk mutasjon og /eller villfaren genekspresjon kan ligge til grunn for en sykdom, er de biokjemiske grunnlag for de fleste sykdommer forårsaket av protein defekter. Derfor kan en analyse av global protein overflod i humane tumorer, kalt kreft proteomikk, byr på mange muligheter og utfordringer i å identifisere nye kreftmarkører og terapeutiske mål så vel som å forstå svulst patogenesen. For tiden er to-dimensjonal gelelektroforese (2-DE) og massespektrometri (MS) er de mest anvendte verktøy for separering og identifisering av proteiner. Men det er heterogenitet alltid en bekymring i studier av menneskelig svulstvev. Selv om cellekultur er en tilnærming til å overvinne dette problemet, kan det ikke nøyaktig representerer de molekylære hendelser som finner sted i selve vevet som de ble hentet [6]. En sammenligning mellom humane prostatacellelinjer og tumorceller fra de samme pasienter viste at 20% av proteinprofilene ble forandret [7]. Laser fange mikrodisseksjon (LCM) er en nylig utvikling som kan brukes for å skaffe sterkt representative subpopulasjon av celler fra komplekse heterogene vevsprøver [8]. Denne teknologien har blitt brukt med stor suksess i et variert utvalg av studier med nedstrøms analyse på DNA og RNA-nivåer, inkludert global genekspresjon profilering [9] og analyser av proteomet av prostata [7], tykktarm [10], hepatocellulær [11 ], bryst [12], og pankreatiske tumorer [13]. Imidlertid har kombinasjonen av to-DE og MS aldri blitt brukt til studiet av menneskelig GCA.
Denne studien tar sikte på å skissere kreftutvikling av GCA, og for å identifisere GCA-spesifikke sykdomsassosierte proteiner som potensielle kliniske biomarkører for tidlig deteksjon og nye terapeutiske mål. Vi utførte navigert LCM å berike både ondartede og ikke-ondartede mage hjerte epitel celler fra sammenkoblede kirurgiske eksemplarer av menneske GCA. Proteinene ekstrahert fra disse celler ble separert ved to-DE. Differensial protein flekker ble identifisert ved peptid masse fingeravtrykk (PMF) basert på matrise-assistert laser desorpsjon /ionisering time-of-flight massespektrometri (MALDI-TOF MS) og databasesøk. Gyldigheten av disse funnene ble bekreftet ved immunhistokjemisk og western-blot analyser.
Metoder
Materialer
IPG strimler (pH 3-10-lineær) og IPG bufferløsninger (pH 3-10-lineær) ble kjøpt fra Amersham Pharmacia Biotech (APB, Sverige). DTT, urea, tiourea, Tris base, TX-100, CHAPS, glysin, akrylamid, metylenbisakrylamid, SDS, TEMED, ammoniumpersulfat, sølvnitrat, Trypsin (sekvense klasse), ACN, og TFA ble kjøpt fra Sigma (St. Louis, MO, USA). Til slutt, den fullstendige proteasehemmer cocktail var fra Roche (Lewes, UK). Milli-Q grade vann ble brukt for alle løsningene.
GCA prøver
Ni par av menneskelige mage Cardia adenokarsinom og deres tilstøtende nontumourous Cardia vev ble oppnådd i løpet av 30 minutter etter et kirurgisk reseksjon på andre tilknyttet sykehuset i Xi ' en Jiaotong University i 2005 (tabell 1). For å unngå åpenbare områder av sår eller nekrose, ble prøvene anskaffet fra kantene av tumorer. De ble umiddelbart frosset i flytende nitrogen og lagret ved -80 ° C inntil bruk. Informert samtykke ble innhentet fra alle pasienter. I mellomtiden, to erfarne patologer evaluert svulsten gradering av en mikroskopisk undersøkelse av samples.Table 1 Kliniske og histologiske data fra pasienttumorprøver
Case

Age

Gender

Locationa)

Size(cm)

Grade

1
58
M
Within 2 cm av GEJ
1,5 × 2
Moderat differensiert
2
63
M
Innen 2 cm av GEJ
5 × 6
Moderat differensiert
3
46
M
Innen 2 cm av GEJ
4 × 5
Moderat differensiert
4
60
M
Innen 2 cm av GEJ
2 × 2,5
Vel differensiert
5
73
M
Innen 2 cm av GEJ
3 × 1
Vel differensiert
6
70
M
Innen 2 cm av GEJ
2 × 1
Vel differensiert
7
55
M
Innen 2 cm av GEJ
2 × 3
Dårlig differensiert
8
51
M
Innen 2 cm av GEJ
4 × 6
Dårlig differensiert
9
63
M
Innen 2 cm av GEJ
3 × 2,5
Dårlig differensiert
a) Sted: episenter svulstvev
prøveopparbeidelse for LCM
§§ (8 um tykk) ble kuttet på lysbilder (forvasket med fettløsende oppvaskmiddel vasket med deionisert vann og dyppet i etanol) ved hjelp av et Leica kryostat CM 1900 (kammertemperatur -28 ° C). Seksjonene ble enten lagret ved -80 ° C eller holdt i kryostaten kammeret før LCM. Hematoksylin-farging ble utført bare for overvåkning av vevssnitt og ble ikke brukt i forbindelse med LCM. Snittene ble fiksert (70% etanol i 1 min), haematoxylin farget og dehydrert (70% etanol i 45 s, 95% etanol i 45s, 2 x 100% etanol i 30-årene, og etterfulgt av xylen 2 x i 5 min). I mellomtiden ble ufargede seksjoner brukes til LCM. De ble fiksert (70% etanol i 30 s), vasket i deionisert vann til 10s, og dehydrert (70% etanol i 15s, 95% etanol i 15s, 2 x 100% etanol i 15s, og etterfulgt av xylen 2 x i 1 min ). Komplett proteasehemmer cocktail tabletter ble
navigert LCM
Etter festing og dehydrering, ufargede seksjonene ble lufttørket og microdissected hjelp av Arcturus PixCellα system (Arcturus, Mountain View, CA, USA). LCM mikroskop avbildes en haematoxylin farget seksjon ved siden av en av interesse. Dette bildet ble vist på LCM dataskjermen ved hjelp av LCM bildeanalyse programvare (Arcturus, USA) og ble brukt som et kart for å avgrense området for disseksjon på en tilstøtende unstained delen. Seksjonene ble deretter tatt med et 15 um diameter laserstråle normalt ved 50-80 mV makt med pulsvarighet på 3-10 ms i maskingevær modus og med en laser avfyringsfrekvens på 1 skudd per 500 ms. I gjennomsnitt ble mellom 10,000-12,000 tar bilder per cap, og ca 25000-30000 celler ble oppnådd per cap. Hver hette ble tatt i løpet av en time. Basert på en nøye gjennomgang av de histologiske snitt ble hver disseksjon anslått å inneholde ≥ 95% av de ønskede cellene.
Mikrodisseksjon caps ble innført i 0,5 ml mikrosentrifugerør som inneholdt 50 pl av en lyseringsbuffer (7 M urea, 2 M tiourea, 4% vekt /volum CHAPS, 65 mM DTT, 0,5% v /VTX-100, 40 mMTris-base, og fullstendig protease inhibitor cocktail). Deretter ble cellene oppløst ved inversjon av rør etterfulgt av vortex-blanding i 1 min og kort puls-sentrifugering ved 12 000 x g. Etterpå ble vev fra flere hetter (ca. 800 000 ~ million celler) ble ekstrahert inn i den samme lyseringsbuffer inntil tilstrekkelig materiale var blitt oppsamlet. Prøvene ble sentrifugert ved 40000 x g i 1 time ved 4 ° C. Der det er nødvendig, ble supernatantene lagret ved -80 ° C inntil videre anvendelse. Proteinkonsentrasjonen ble bestemt ved Bradford-metoden.
2-DE
første-dimensjonale isoelektrisk fokusering (IEF) ble utført på Pharmacia Immobiline IPG DryStrip system (Uppsala, Sverige). For den første dimensjonen av elektroforese ble prøver inneholdende 60 ug protein for analyse geler fortynnet til 250 pl med en rehydrering løsning (7 M urea, 2% vekt /volum CHAPS, 50 mM DTT, 0,5% volum /volum IPG-buffer (pH 3-10-lineær), og spor bromfenolblått) før du legger på 13 cm IPG strimler (pH3-10 lineære). IEF ble deretter utført ved anvendelse av IPGphor elektroforese enheten i henhold til produsentens instruksjoner. Deretter ble strimlene ekvilibrert med en oppløsning (6 M urea, 30% volum /volum glycerol, 2% vekt /volum SDS, og 50 mM Tris-HCl, pH 8,8), redusert med 1% vekt /volum DTT i 15 min , og alkylert med 2,5% vekt /volum jodacetamid i 15 min. Strimler ble deretter skylt i elektroforese buffer (25 mM Tris-base, 192 mM glycin, og 0,1% vekt /volum SDS), påført på 11% akrylamidgeler og forseglet med smeltet agarose (0,5% w /v agarose i elektroforese buffer inneholdende en spor av bromfenolblått). SDS-PAGE ble utført ved anvendelse av Hoefer SE 600 fallkammer og en Tris-glycin-buffer (25 mM tris og 192 mM glycin) inneholdende 0,1% w /v SDS, med første separering ved en konstant 10 mA /gel i 30 minutter, fulgt av 20 mA /gel. Den andre-dimensjonal SDS-PAGE ble utviklet inntil bromfenol blått fargestoff markør hadde nådd bunnen av gelen. Den totale kjøretid var vanligvis 4 til 4,5 timer. Gelene ble fiksert i 10% volum /volum eddiksyre, 40% volum /volum etanol før sensibilisering i 30 minutter i en buffer inneholdende 30% volum /volum etanol, 0,2% vekt /volum natrium-tiosulfat, og 0,83 M natriumacetat. Dette ble etterfulgt av tre vaskinger i 15 min avionisert vann. Proteinene ble deretter beiset med 0,1% vekt /volum sølvnitrat i 20 min, vasket to ganger i avionisert vann i 1 min, og utviklet i 2,5% vekt /volum natriumkarbonat inneholdende 0,04% volum /volum formaldehyd (37% oppløsning). Utviklingen ble stoppet med 1% volum /volum eddiksyre, og gelene ble vasket tre ganger i vann.
Bildeanalyse og statistisk analyse
Umax ImageScanner (Amersham Biosciences) ble anvendt for å skanne gelene, mens bilde Master ™ 2D Platinum Version 5.0-programvaren (Amersham Biosciences) ble brukt for spot deteksjon, kvantifisering, og matching. Intensiteten av hvert punkt ble kvantifisert ved volum%. Data ble deretter analysert ved hjelp av SPSS for Windows 11,5 og Excel. Student t
-test ble brukt til å analysere forskjeller i proteinnivåer mellom GCA og ikke-tumorprøver, med et konfidensintervall på 95%.
MALDI-TOF-MS og database søk
Jevnt og signifikant forskjellig flekker valgt ut for analyse ved MALDI-TOF MS. Protein flekker av interesse ble skåret ut og hakket opp i små biter, etterfulgt av avfarging og vasking med avionisert vann i flere ganger inntil den gule fargen forsvant. Gelbitene ble deretter skylt med 25 mM ammoniumbikarbonat, dehydrert med ACN og tørket i en vakuumsentrifuge. Etterpå ble proteiner i-gel spaltet med 0,02 ug /ul trypsin over natten ved 37 ° C. Tryptiske peptider ble deretter på nytt oppløst i en oppløsning inneholdende 50% volum /volum ACN og 0,2% volum /volum TFA. En 2 pl prøve ble flekket på en prøveplate med 4 pl av matriseoppløsning CHCA (a-cyano-4-hydroxcinnamic syre, 10 mg /ml i 50% volum /volum ACN, 0,2% volum /volum TFA) og fikk luft tørke. De tørkede flekker ble deretter analysert i et Voyager DE MALDI-TOF MS (Framingham, MA, USA). Dette ble fulgt ved å kjøre spektrometeret i en positiv ion-modus og i reflektor-modus med følgende innstillinger: akselererende spenning, 20 kV; gitterspenning, 94%; lede trådspenning, 0,01%; og en forsinkelse på 200 ns. Spectra ble kjøpt manuelt med laser intensitet satt til 3200 med 80 bilder per spektrum. Deretter massen serien ble satt mellom m Twitter /z
500 og m Twitter /z
5000. Intern kalibrering ble brukt ved hjelp av angiotensin II og insulin B-kjeden topper på 912,08 Da og 3495,95 Da hhv.
proteiner ble identifisert ved peptid masse fingerprinting bruke søkeprogrammet Aldente [14] med følgende søkeparametere brukt: SWISS-PROT og TrEMBL ble brukt som proteinsekvensen databaser; en masse toleranse på 100 ppm og en ufullstendig spaltning ble tillatt; carboxyamidomethylation, oksiderte metionin, og fosforylering ble vurdert som mulige modifikasjoner; minimum antall matchet-peptider var 4; og peptidet ion var [M + H] +.
Immunhistokjemisk og western blot analyse
For å validere uttrykk mønstre av tre proteiner i GCA vev, immunohistokjemi ble utført ved anvendelse av formalinfiksert og parafin-innleiret vev eksemplarer som samsvarte med 2-DE prøver. Avvokset 5 um tykke seksjoner ble behandlet med en 0,3% hydrogenperoksidase i 3 min og med en blokkerende antistoff i 30 min. Etter varme-mediert antigen gjenfinning ble snittene inkubert med primært antistoff ved 4 ° C over natten som følger: HSP27 (Sigma, St. Louis, MO, USA), 1: 500; Hsp60 (Santa Cruz, Amerika), 1: 300; og PRX-2 (Santa Cruz, Amerika), 1: 150. Seksjonene ble deretter inkubert med et peroksidase-merket antistoff (1: 500)., Utviklet med diaminobenzine, og motfarget med hematoksylin
For western blot-analyse ble proteinprøver (30 ug) som brukes i 2-DE kjørt på 12% SDS-PAGE, overført på PVDF-membraner, og deretter blokkert med PBS /5% skummet melk /0,01% Tween i 2-4 timer ved romtemperatur. Primært antistoff ble fortynnet i blokkeringsbuffer, og ble tilsatt som følger: HSP27, 1: 200; Hsp60, 1: 300; og PRX-2, 1: 200. Deretter ble det inkubert med et pepperrot peroksidase (HRP) -konjugert sekundært antistoff og et HRP-konjugert anti-GAPDH /β-actin-antistoff for å bekrefte lik protein lasting i hvert kjørefelt i 1-2 timer ved 37 ° C eller romtemperatur. Prøvene ble vasket og oppdaget med forbedret chemiluminescence i 30-60 s (Minipore).
Resultater
Profil forskjeller mellom navigert LCM prøver og hele undissected Kryostat vev
å evaluere effektene av navigert LCM på profilene vev protein, utførte vi 2-DE proteinprofiler av hele undissected Kryostat vev og LCM-prøver av GCA. Figur 1 viser et eksempel på det navigeres LCM prosessen. Flertallet av stedene avdekket i de dissekerte ikke-tumor og tumorvev kunne observeres i hele undissected Kryostat vev, med unntak for flere steder. Imidlertid er det fortsatt noen flekker som finnes i hele undissected kryostaten vev som ikke kunne observeres i begge LCM prøver. Således, denne teknologien kan ikke bare berike ikke-tumor og tumor-epitelceller, men kan også minske forurensning i vev, for eksempel hemoglobin [10, 11]. Videre kan navigeres LCM prosessen eliminere effektene av flekker for proteinseparasjon av 2-DE [15]. Således våre data støtter behovet for å utføre navigert LCM i proteomic studier av GCA vev. Figur 1 navigert laser capture mikrodisseksjon av svulstvev. (A) haematoxylin-farget mage Cardia adenokarsinom; (B) Ufarget GCA vev; (C) Tumor vev etter mikrodisseksjon; (D) Captured kreftceller på LCM film.
Profil forskjeller i proteinuttrykk mellom GCA vev og omkringliggende ikke-tumorvev
Vi utførte en navigert LCM og 2-DE for matchet par av tumorvev og det omkringliggende ikke- tumorvev fra GCA pasienter. Omtrent 800-1000 protein flekker ble oppdaget av sølvfarging. For å måle reproduserbarhet, hver prøve gikk forsøket tre ganger. Det var 905 ± 74 og 867 ± 51 protein flekker i kartet over GCA og ikke-tumor mage hjertevevet, henholdsvis. De samsvarende flekker var 799 ± 29 og 727 ± 34 hver for seg, og de respektive gjennomsnittlig matchende rente var 88,2% og 83,8%. I tillegg er den gjennomsnittlige posisjonsavvik av matchet flekker var 1,031 ± 0,205 mm og 1,44 ± 0,11 mm i IEF og SDS-PAGE retning, henholdsvis. Selv om bildeanalyse viste at disse 2-DE kart var reproduserbare, det var små forskjeller i intensiteten og antallet flekker. Ikke desto mindre, en analyse av gelene viste 27 protein flekker som har intensiteter varieres vesentlig og gjennomgående mellom ikke-tumor og tumor-vev (fig. 2). Forholdet mellom normaliserte stikk intensiteter av kreft i vev paraneoplasis for hvert av proteinene av interesse ble beregnet. Spots viser en todelt forskjell og med statistisk signifikans (p < 0,05) ble valgt. Tre av de to-DE resultatene ble bekreftet ved immunohistokjemisk og western blot analyser. Figur 2 2-DE kartet ondartede og nonmalignant mage Cardia vev. Alle kartene viste fremstilles fra den samme pasient. (A) 2-DE kart over hele undissected Kryostat vev; (B) 2-DE kart av ikke-tumorvev etter LCM; (C) 2-DE kartet GCA vev etter LCM.
Protein identifikasjon
Begge hele undissected Kryostat prøver og LCM-prøver ble brukt for protein identifikasjon. Tjuesyv ulike protein flekker mellom GCA vev og omkringliggende ikke-tumorvev ble skåret ut. Imidlertid ble bare 23 proteiner identifisert ved MALDI-TOF-MS (Tabell 2). Dette fenomenet skyldes sannsynligvis posttranslasjonelle modifikasjoner som peroxiredoxin 1 (PRX-1), som var til stede i to tilstøtende flekker (fig. 2, stikk 11). Disse proteinene ble klassifisert i noen av følgende: celleproliferasjon og differensiering (ANXA2, ANXA4, hnRNPA2 /B1), apoptose (PRX-en, PRX-2, GSTP, VDAC, ETFB), metabolisme (ADH1C, AKR1C3, CA2, GATM ), protease relatert (CTSD, PACSIN1), cystoskeleton (Actin 1, Keratin 8), anstand (HSP27, 60, 70, PDIA3), og RNA bindende og transkripsjon (hnRNPH3, PCBP1, ENO1). Figur 3 viser PMF kart HSP60.Table 2 Proteiner med differensial uttrykk mellom GCA tumorvev og tilstøtende sammenkoblede røyk tumorvev ble identifisert av MALDI-TOF MS
Up-regulering proteiner
Spot No.
Protein
Tiltredelse No.a)
Mr /PiB)
Match
Cov (%) c)
T-test
rasjon (tumor /non-tumor) Midler ± SD
1 Heat-shock protein beta-1 (HSP27) *
P04792
23 /6,0
9
54
0,0040
3,4279 ± 2,0727
2
Heat shock 70 kDa protein 5 (HSP70)
P11021
70 /5.0
22
42
0,0030
3,2597 ± 1,5314
3
60 kDa heat shock protein (hsp60) *
P10809
58 /5.2
12
37
0,0001
2,8308 ± 1,1426
4
Protein disulfid isomerase A3 (PDIA3) *
P30101
54 /5,6
13
41
0,0280
4,2105 ± 2,7294
5
Annexin A4 (ANXA4)
P09525
36 /5.8
10
34
0,0140
4,7153 ± 7,3434
6
Annexin A2 (ANXA2)
P07335
38 /7.5
7
26
0,0150
6,0722 ± 5,5431
7
Heterogene atom ribonucleoproteins A2 /B1 (hnRNP A2 /B1 ) *
P22626
37 /9,0
16
43
0,0050
10,7775 ± 9,5547
8
Cathepsin D tung kjede (CTSD)
P07339
27 /5.6
12
61
0,0012
4,3552 ± 3,7703
9
protein kinase C og kasein kinase substrat i nevroner protein 1 (PACSIN1)
Q9BY11
51 /5,1
5
24
0,0028
2,6026 ± 1,2147
10
glutation S-transferase P (GSTP) *
P09211
23 /5.4
5
44
0,0026
3,8757 ± 2,2198
11
Peroxiredoxin-en (PRX-1) *
Q06830
22 /8.3
8
59
0,0140
4,2744 ± 4,1568
12
Poly (rC) -binding protein1 (PCBP1) *
Q15360
37 /6.7
12
63
0,0070
2,7401 ± 0,5321
13
Aldo-keto reduktase familie 1member C3 (AKR1C3)
P42330
37 /8.1
7
25
0,0040
2,7762 ± 1,1820
14
Glycineamidinotransferase (GATM)
P50440
44 /6.4
8
23
0,0390
2,7839 ± 0,4680
15
Keratin, type II cytoskeletal 8 (Keratin 8) *
P05787
54 /5.5
9
25
0,0020
3,5063 ± 0,6423
nedregule proteiner
16
Actin , cytoplasmatiske 1 (Actin 1) *
P60709
42 /5.3
6
30
0,0160
0,2603 ± 0,1539
17
Heterogene atom ribonucleoproteins H3 (hnRNPH3)
P31942
37 /6.4
5
28
0,0015
0,6028 ± 0,6229
18
Peroxiredoxin-2 (PRX-2) *
P32119
22 /5.7
6
24
0,0250
0,2376 ± 0,1202
19
Karbondioksid anhydrase2 (CA2) *
P00918
29 /6.8
6
33
0,0130
0,3675 ± 0,1270
20
Alpha-enolase (ENO1)
P06733
47 /7.0
16
42
0,0030
0,2898 ± 0,1340
21
alkohol dehydrogenase 1C (ADH1C)
P00326
40 /8.6
7
49
0,0280
0,2287 ± 0,1680
22
Electron transfer flavoprotein subenheten b (ETFB)
P38117
28 /8.3
6
26
0,0240
0,2655 ± 0,1415
23
spenningsavhengig anion selektiv kanal (VDAC) *
P21796
31 /8.6
7
39
0,0120
0,4474 ± ​​0,0297
a) Swiss-Prot tiltredelse no.
b ) Teoretisk verdi
c) Sekvens dekning% product: * proteinene er funnet i magekreft tidligere.
Figur 3 MALDI-TOF MS identifisering av sted tre i GCA.
Immunhistokjemisk og western blot analyse for HSP 27, 60, og prx-2 i GCA
for ytterligere å undersøke hvorvidt HSP27, 60, og prx-2 er uttrykt i vev, og for å bestemme hvilke celler som uttrykker disse proteinene, ble immunhistokjemisk analyse utført ved anvendelse av formalinfiksert og parafin- vevsprøver som samsvarte med 2-DE prøver. Ekspresjonen av HSP27 og 60 kan sees i alle cytoplasms av karcinomceller, samtidig som det kan ses i noen av de søyleformede cytoplasms av epitel (Fig. 4A-D) i ikke-tumorvev. I motsetning til dette, prx-2 ble nesten ikke funnet å bli uttrykt i karcinomceller, men heller i noen av de cytoplasms av søyle epitelceller (fig. 4E, F). For å undersøke disse protein ekspresjonsnivåer, ble western blot analyser også utført under anvendelse av de samme vev (Fig. 5). Som forventet, ble HSP27 og 60 funnet å være konsekvent høyt uttrykt i tumorvevet, mens prx-2 ble undertrykket. Figur 4 Immunhistokjemisk analyse for HSP27, 60, og prx-2 i human normal gastrisk cardia og GCA. Uttrykk for HSP27 (A), 60 (C), og prx-2 (E) var i cytoplasma av tumorceller; Uttrykk for HSP27 (B), 60 (D) og prx-2 (F) ble funnet i cytoplasma i normale søyle epitelceller; Forstørrelse: A-F x 40, motfarget med hematoksylin
Figur 5 Western blot-analyse for å validere den økte ekspresjon av HSP27, 60, og redusert ekspresjon av prx-2 i GCA vev.. . GAPDH og β-actin ble brukt som referanser
Diskusjon
Cardia er anatomisk grenseland mellom spiserøret og magesekken; dermed er det konstant uenighet om forholdet deres i form av epidemiologi, kliniske funksjoner, og klassifisering blant esophageal adenokarsinom (EA), GCA, og DGA. For å sammenligne sine proteinprofiler, vi søkte litteraturen for å finne disse proteinene. Tretten av 23 proteiner har blitt funnet i DGA tidligere (tabell 2). Blant dem, HSP27, 60, 70, PDIA3, og CA2 har samme uttrykksmønster i GCA og DGA. I motsetning til dette ble et lavt nivå ekspresjon av HSP27 funnet i EA [16-20]. Derfor er tumorgenesen av GCA forskjellig fra EA og DGA, og dermed GCA bør være en tydelig patologisk enhet.
Cellular heterogenitet har vært en betydelig barriere for molekylær analyse av normale og syke vev. Først beskrevet av Emmert-Buck et al. i 1996, er laser fange mikrodisseksjon en kraftig og nøyaktig teknikk som brukes til å studere protein endringer i en bestemt undergruppe av celler i et lite vedlikehold system som er lett å betjene [8]. Som vanlig er forskjellige histokjemiske flekker av vevet seksjon som brukes for å lede disseksjon prosessen. Imidlertid har flere tilfeller vist moderat til dramatiske effekter av flekker på protein separasjon ved 2-DE [21, 22]. For å eliminere flekker som en potensiell skadelig effekt, har navigert LCM nylig blitt utviklet. Den bruker en farget delen for å veilede disseksjon av de ufargede tilstøtende prøven [23]. Denne teknikken har blitt brukt med hell i studiet av hjerneprøver [15]. I tillegg, på grunn av de typiske morfologiske egenskapene til den gastriske hjerte overfladiske søyle celle og den kardiale kjertel, de er lett å identifisere på en dehydratisert seksjon uten farging. Derfor ble navigert LCM en optisk strategi i vår proteomikk tilnærming. I denne forskningen, antall LCM-avledet ikke-ondartede og ondartede celler variert betydelig og var ofte små sammenlignet med hele undissected Kryostat vev, til tross for de profilene som var svært lik mellom LCM prøvene og undissected seg. Dette indikerte at det navigeres LCM kan være en mulig tilnærming for å studere gastriske hjertevev, og at det er kompatibelt med 2-DE og MALDI-TOF-MS.
Vi erholdt proteinprofilen til GCA ved å sammenligne endringer i protein profiler av omkringliggende ikke-tumorvev. For å redusere individuelle forskjeller, ble vevsprøver hentet fra samme pasient, slik at vi kan studere differensial protein uttrykk under lignende genomisk bakgrunn. Så langt vi kjenner til, rapporterte vi den første proteomikk analyse av GCA. Av de 27 utvalgte protein flekker, ble 23 proteiner i molekylmasse området 15-75 kDa og med et isoelektrisk punkt mellom 3 og 10 identifisert ved to-DE og MALDI-TOF MS. De fleste av disse proteiner ble beskrevet tidligere som differensielt uttrykt enten på mRNA-nivå eller på proteinnivået i andre typer av kreft hos mennesker.
HSP er en gruppe av stressproteiner induseres av ulike typer miljø og patofysiologiske fornærmelser. I denne studien ble co-up-reguleringer av HSP27, 70, og 60 funnet i mage hjerte tumorvev. Som anstand, kunne HSP27 og HSP70 hemme apoptose ved å samhandle med apoptosome og caspase aktivering komplekse [24], underliggende sine roller i tumorprogresjon og motstand mot behandling [25]. Mange studier viser at HSP27 og HSP70 overexpressions signalisere en dårlig prognose og spår en dårlig respons på kjemoterapi. Hsp60 ser ut til å være en viktig endogene inflammatorisk megler og er antagelig utgitt av skadede celler. Dessuten, sammen med HSP70, har hsp60 en rolle i antigenpresentasjon i maligne sykdommer [26]. HSP er også overuttrykt i bryst, colorectal, mage, og prostata karsinom [10, 25]. Derfor kan overekspresjon av HSP27, 70, og 60 være nyttige biomarkører for karsinogenese i GCA og kan være forbundet med graden av differensiering og prognose av GCA.
Blant identifiserte proteiner, er to proteiner involvert i regulering av transkripsjon og ekspresjon av tumorassosierte gener. PCBP1, oppregulert i GCA, er en RNA anstand post-transcriptional regulator. Det har blitt demonstrert at PCBP1, sammen med PTB-1 og hnRNPK, styrer noen proto-onkogen gener og apoptose-relaterte gener uttrykk, slik som Bag-1, c-myc
, Apaf-1, XIAP, og DAP5, gjennom å stimulere aktiviteten av interne ribosom inngangssegment (IRES). PCBP1 er nødvendig for å åpne RNA i området som inneholder inngangs window ribosomet, mens PTB-1 kan være nødvendig for ribosom-rekruttering [27, 28]. Nylig, Pickering, B.M. et al. beskrevet at ved sukkerdeler PCBP1 kan være relatert til metastaserende evne og kan spille en rolle i leverkreft metastase [27]. Deretter opp-regulering av PCBP1 kan regulere cap-uavhengig mekanisme av translasjon initiering av hjertetumorassosierte gener i utviklingen av GCA. Som et tumor suppressor, kan alfa-enolase regulere c-myc promoter-aktivitet i form av et c-myc bindingsprotein (MBP-1). MBP-en kan så bindes til P2 element i c-myc-promoteren og konkurrere med TATA-boksen bindende protein (TBP) for å undertrykke transkripsjon av c-myc [29, 30]. På den annen side, nedregulering av alfa-enolase er i overensstemmelse med arbeidet til Chang YS et al.

• Klinisk betydning av palliativ gastrektomi på overlevelse av pasienter med uhelbredelig avansert magekreft: en systematisk oversikt og meta-analyse
• MikroRNA-645, oppregulert i menneskelig adencarcinoma av mage esophageal krysset, hemmer apoptose ved å målrette tumor suppressor IFIT2