Proteom analiza ljudskog želuca cardia adenokarcinoma lasersko snimanje microdissection

ofProteome analizu ljudskog želuca cardia adenokarcinom laserom hvatanje mikrodisekcijom
apstraktne pregled pozadine
učestalosti želučane srčanog adenokarcinoma (OKS) je u porastu u posljednja dva desetljeća u Kini, ali su molekularne promjene koje se odnose na karcinogeneze nisu dobro karakteriziran.
Metode
u ovom istraživanju koristili smo usporedni proteomic pristup za analizu malignih i nemalignih želučane kardija epitelne stanice izolirane za upravljanje lasersko snimanje mikrodisekcijom ( LCM) od uparenih kirurških uzoraka ljudske OKS. pregled Rezultati
dvadeset sedam točaka koje odgovaraju 23 proteina dosljedno su diferencijalno regulirani. Petnaest proteini su pokazala da se regulira prema gore, dok je osam proteini su se pokazala podregulirani u malignim stanicama u usporedbi s nemaligno stupčastih epitelnim stanicama. Identificirani protein koji se javlja da je uključena u metabolizam, chaperone, Antioksidacija, prijenos signala, apoptozu, staničnu proliferaciju i diferencijaciju. Pored toga, izraz Hsp27, 60 i PRX-2 u uzorcima OKS su dalje potvrđeni imunohistokemijskom i Western blot analize. Pregled Zaključak
Ovi podaci pokazuju da je kombinacija za upravljanje LCM s 2-DE daje učinkovitu strategiju za otkriće proteina koji su različito izraženi u OKS. Takvi proteini mogu doprinijeti rasvjetljavanju molekularnih mehanizama OKS karcinogeneze. Osim toga, kombinacija pruža potencijalne kliničke biomarkera koji pomažu u ranom otkrivanju i pružiti potencijalne terapijske ciljeve.
Pozadina
različitih analiza incidencije raka podataka uništile iz zapadnih zemalja otkrila je brzo rastuće stope adenokarcinoma jednjaka i želuca kardija u posljednjih nekoliko desetljeća, u usporedbi sa stabilnim i padom cijene za jednjaka karcinoma pločastih stanica (SCC) i distalni želučanog adenokarcinoma (DGA) [1-3]. Ova pojava je očito u Kini, osim što je povećanje incidencije želučane cardia adenokarcinoma (OKS) pojavljuje znatno veća od učestalosti raka jednjaka. Dokazi pokazuju da OKS je različit klinički entitet kao patogeneze i faktori rizika su sasvim drugačiji od DGA. Dakle, OKS je daleko više prevladava, s većom učestalošću limfnih čvorova metastaza i lošijom prognozom nego DGA [4]. Godišnja incidencija OKS je 50 /100.000, a može čak biti kao visok kao 190 /100.000 u nekoliko regija Kine [5]. Relativno asimptomatska prirode u ranim fazama bolesti i nedostatka adekvatnih screening testovi su rezultirali u većini OKS pacijente da se na već uznapredovalom stadiju bolesti. Dakle, potrebno je razumjeti molekularni mehanizam karcinogeneze i identificirati biomarkera za rano dijagnosticiranje i učinkovito liječenje ljudskog OKS. Pregled Nedavno je Proteom je nastao kao dopuna dijela genoma. Pretpostavka je da se drastično može pomoći u unraveling biokemijske i fiziološke mehanizme složenim multivarijatne bolesti na funkcionalnoj molekularnoj razini. Iako je genetska mutacija i /ili lutajući gena može biti temelj bolesti, biokemijski baze za većinu bolesti uzrokovane nedostataka proteina. Dakle, analiza globalne proteina izobilju u ljudskim tumorima, zove proteomika raka, mogao ponuditi brojne mogućnosti i izazove u identificiranju novih tumorskih biljega i terapeutske ciljeve, kao iu razumijevanju tumora patogeneze. Trenutno, dvodimenzionalna gel elektroforeze (2-DE) i masene spektrometrije (MS) su najčešće zaposlene alati za odvajanje i identifikaciju proteina. Međutim, heterogenost je uvijek briga u studijama ljudskog tkiva tumora. Iako je stanična kultura je jedan pristup riješiti ovaj problem, to možda neće točno predstavljati molekularnim događajima u stvarnom tkiva iz kojeg su dobiveni [6]. Usporedba između staničnih linija ljudske prostate i tumorskih stanica iz istih pacijenata pokazalo je da je 20% proteina profili su [7] mijenjati. Laser hvatanje Mikrodisek (LCM) je nedavni razvoj koji se može koristiti za nabavu vrlo reprezentativan subpopulacije stanica iz uzoraka složenih heterogenih tkiva [8]. Ova tehnologija je vrlo uspješno koristi u raznolik niz studija koje koriste nizvodno analizu na DNA i RNA, uključujući i izražavanja globalni profila genske [9] i analize proteome prostate [7], debelog crijeva [10], hepatocelularni [11 ], dojke [12], i gušterače [13]. Međutim, kombinacija 2-DE i MS nikada nije bio primijenjen na proučavanje ljudske OKS.
Ova studija ima za cilj ocrtati karcinogeneze OKS i identificirati OKS-specifične proteine ​​bolesti povezane kao potencijalne kliničke biomarkera za rano otkrivanje i nove terapijske mete. Izvršili smo plove LCM obogatiti obje maligne i nemaligni želučanog srčane epitela stanice od uparenih kirurških uzoraka ljudske OKS. Proteini izvađen iz ovih stanica su odvojeni 2-DE. Diferencijalni proteinske mrlje su identificirani peptid masovno otiska prsta (PMF) na temelju matrice uz pomoć laserske desorpcije /ionizacije vremenska masena spektroskopija (MALDI-TOF MS) i baze podataka pretraživanje. Valjanost ovih nalaza je potvrdio imunohistokemijske i zapadne-blot analize. Pregled metoda
Materijali pregled IPG trake (pH 3-10 nelinearna) i IPG pufer otopine (pH 3-10 nelinearna) kupljeni su od Amersham Pharmacia Biotech (APB, Švedska). DTT, urea, tiourea, Tris baza, TX-100, CHAPS, glicin, akrilamid, metilenbisakrilamid, SDS, TEMED, amonijev persulfat, srebreni nitrat, tripsina (čistoće za sekvenciranje), ACN i TFA nabavljeni su od tvrtke Sigma (St. Louis, MO, USA). Konačno, kompletni koktel inhibitora proteaze je od Roche (Lewes, UK). razred vode Milli-Q je korišten za sva rješenja.
OKS uzoraka
devet para ljudskog želuca cardia adenokarcinom i njihovih susjednih nontumourous kardija tkiva dobiveni su u roku od 30 minuta nakon kirurške resekcije u drugoj povezanih bolnici Xi ' sveučilišnu Jiaotong u 2005. godini (Tablica 1). Kako bi se izbjeglo očite područja čira ili nekroze, uzorci su nabavljeni od rubova tumora. Su odmah zamrznute u tekućem dušiku i pohranjeni na -80 ° C do upotrebe. Dali pristanak su od svih pacijenata. U međuvremenu, dvije iskusni patolozi ocijenili ocjenjivanje tumora pomoću mikroskopskog pregleda od samples.Table 1 kliničkih i histoloških podacima uzorcima bolesnika tumor pregled Case

Age

Gender

Locationa)

Size(cm)

Grade

1
58
M
Within 2 cm GEJ
1,5 × 2 pregled, umjereno diferencirani pregled 2 pregled, 63 pregled, M pregled u roku od 2 cm GEJ
5 × 6 pregled umjereno diferenciran pregled 3 pregled, 46 pregled, M pregled u roku od 2 cm od GEJ
4 × 5 pregled umjereno diferenciran pregled 4
60 pregled, M
roku od 2 cm GEJ Netlogu 2 × 2,5 pregled, dobro diferencirani pregled 5
73
M pregled u roku od 2 cm GEJ
3 × 1 pregled dobro diferencirani pregled 6
70 pregled M
roku 2 cm GEJ
2 × 1 pregled dobro diferencirani pregled 7
55
M pregled u roku od 2 cm od GEJ
2 × 3 pregled Loše diferencirani pregled 8
51
M pregled u roku od 2 cm od GEJ
4 × 6 pregled Slabo diferencirani pregled 9
63 pregled, M
roku od 2 cm od GEJ
3 × 2,5 pregled, slabo diferencirani pregled a) Lokacija: epicentar tumorskog tkiva pregled priprema uzorka za LCM
odjeljcima (8 um debljine) se izreže na slajdove (prethodno očišćena koristite deterdžent, ispere s deioniziranom vodom, te uronjen u etanolu) pomoću Leica CM 1900 kriostatu (temperatura komore -28 ° C). Sekcije su ili pohranjeni na -80 ° C ili se čuva u kriostatu komori prije LCM. Hematoksilin bojanje je provedeno samo za monitoring tkivnim a ne koristiti u kombinaciji s LCM. Sekcije su fiksirane (70% -tni etanol kroz 1 min), hematoksilin obojena i dehidrirani (70% -tni etanol kroz 45 s, 95% -tni etanol kroz 45s, 2 × 100% etanol 30 sekundi, a zatim 2 × ksilen za 5 min). U međuvremenu, neoznačeni dijelovi su korišteni za LCM. Oni su fiksirane (70% -tni etanol kroz 30 s), ispere u deioniziranoj vodi 10 s, te dehidriran (70% etanol na 15 s 95% etanol na 15 s, 2 × 100% etanol na 15 s, a zatim ksilen 2 × 1 minute ). Kompletan koktel inhibitora proteaza tableta pregled navigaciju LCM pregled Nakon popravljajući i dehidracija, neoznačeni dijelovi su osušene na zraku i microdissected pomoću Arkturus PixCellα sustav (Arkturusa, Mountain View, CA, USA). LCM mikroskop snimio je hematoksilin umrljani dio graniči sa jednom od interesa. Ova slika je prikazana na ekranu računala LCM pomoću LCM za analizu slike (Arkturusa, SAD), a korišten je kao karta ograničavaju područje za seciranje na susjednom neuprljanom dijelu. Sekcije su zatim snimljene 15 um promjer laserske zrake obično na 50-80 mV snage s trajanjem pulsa od 3-10 ms u načinu strojnica i laserskim plamena frekvenciji od 1 pucao po 500 ms. U prosjeku, između 10,000-12,000 metak uzeti su po kapu, a oko 25,000-30,000 stanice su dobivene po kapu. Svaka kapa je zarobljen unutar jednog sata. Osnovi pažljivog preispitivanja histoloških sekcija svakog seciranje procijenjena da sadrži ≥ 95% od željene stanice.
Mikrodisekcijom kape ubačeni su u 0,5 ml epruvete za mikrocentrifugiranje sadrži 50 ul od pufera za lizu (7 M urea, 2M tiouree, 4% w /v CHAPS, 65 mM DTT, 0,5% v /VTX-100, 40 mM TRIS-Base i potpuno proteaze inhibitor cocktail). Potom se stanice solubiliziran inverzijom cijevi, nakon čega slijedi vrtloga miješanjem tijekom 1 minute i kratak pulsnog-centrifugiranja na 12 000 x g. Nakon toga, tkiva iz više čepova (oko 800.000 ~ 1000000 stanica) su ekstrahirani u istom puferu za lizu sve dok nije sakupljeno dovoljno materijala. Uzorci su centrifugirani na 40.000 × g tijekom 1 sata na 4 ° C. Gdje je to potrebno, supernatanti su pohranjeni na -80 ° C sve do upotrebe. Koncentracija proteina određena je Bradford metodom. pregled, 2-DE
prvi prostorni izoelektrično fokusiranje (IEF) se izvodi na Pharmacia Immobiline IPG DryStrip sustava (Uppsala, Švedska). Prvi dimenziju elektroforeze, uzorci koji su sadržavali 60 ug proteina za analizu gelovi su razrijeđene do 250 ul otopinom rehidracije (7 M urea, 2% masa /volumen CHAPS, 50 mM DTT, 0,5% v /v IPG pufer (pH 3-10 nelinearni), te u tragovima bromtenolom plava) prije stavljanja na 13 cm IPG trakama (pH 3-10 nelinearnih). IEF je zatim izvedena pomoću elektroforeze IPGphor jedinice u skladu s uputama proizvođača. Nakon toga, trake se uravnoteži s otopinom (6 M urea, 30% v /v glicerol, 2% w /v SDS i 50 mM Tris-HCl, pH 8,8), reducira se s 1% w /v DTT tijekom 15 minuta i alkilira s 2,5% m /v jodacetamidom 15 min. Trake su isprane u puferu za elektroforezu (25 mM Tris baze, 192 mM glicina i 0.1% w /v SDS), koji se primjenjuje u 11% akrilamidnim gelovima, i zapečaćene rastopljenim agaroze (0,5% w /v agaroze u elektroforeza puferu koja sadrži trag bromfenol plavo). SDS-PAGE se izvodi korištenjem Hoefer SE 600 vertikalne komore i Tris-glicin-puferu (25 mM Tris i 192 mM glicina), koji sadrži 0,1% t /v SDS, s početnom odvajanjem pri stalnom 10 mA /gel 30 minuta nakon čega slijedi 20 mA /gel. Drugi-dimenzionalni SDS-PAGE je razvijen do bromofenol marker plava boja je dosegao dno gela. Ukupno vrijeme trajanja je obično 4 do 4,5 sati. Gelovi su fiksirani u 10% v /v octene kiseline, 40% v /v etanola prije senzibilizacije 30 minuta u puferu koji sadrži 30% v /v etanol, 0.2% w /v otopina natrij tiosulfata i 0,83 M natrij-acetata. Nakon toga je uslijedila tri 15 min ispiranja u deioniziranoj vodi. Proteini su zatim obojeni s 0,1% w /v srebrnim nitratom, tijekom 20 minuta, ispere se dva puta u deioniziranoj vodi 1 minutu, i razvijen u 2.5% w /v natrijeva karbonata koja sadrži 0,04% v /v formaldehida (37% otopina). Razvoj je bila zaustavljena s 1% v /v octene kiseline i gelovi su triput isprani vodom. Pregled analize slike i statistička analiza pregled UMAX ImageScanner (Amersham Biosciences) korišten je za skeniranje gela, a slike Master ™ 2D Platinum verzija 5.0 softvera (Amersham Biosciences) se koristi za točkasto otkrivanje, kvantifikacije i podudaranja. Intenzitet svakom mjestu je kvantificirana volumno%. Podaci su zatim analizirani pomoću SPSS for Windows 11.5 i Excel. Studentov t-test pregled se koristi za analizu razlike u razinama proteina između OKS i ne-tumorske uzoraka, s razinom pouzdanosti od 95%. Pregled MALDI-TOF-MS i pretraživanje baze podataka pregled, dosljedno i značajno različiti mrlja odabrana za analizu od strane MALDI-TOF MS. Proteinski točke interesa su izdvojeni i mljevena u male komadiće i zatim destaining i ispiranje sa deioniziranom vodom nekoliko puta, sve dok se žuta boja nestane. Gel komadići zatim su isprane s 25 mM amonijevog bikarbonata, dehidrirane s ACN i osuši u vakuum centrifugi. Nakon toga, proteini u gelu digerirani su s 0.02 ug /ul tripsina preko noći na 37 ° C. Triptinski peptidi su zatim ponovno otopi u otopini koja sadržava 50% v /v ACN i 0,2% v /v TFA. A2 uL alikvota je uočena na ploču za uzorke s 4 ul matrica otopine CHCA (a-cijano-4-hydroxcinnamic kiseline, 10 mg /mL u 50% v /v ACN, 0,2% v /v TFA) i ostavljena da se zrak suha. Osušene mrlje su zatim analizirani u Voyager DE MALDI-TOF MS (Framingham, MA, USA). Nakon toga je uslijedila trčanje spektrometra u pozitivnog iona, a na reflektora modu sa sljedećim postavkama: Napon akceleracije, 20 kV; škripati napona, 94%; vodič žice napon, 0,01%; a kašnjenje 200 ns. Spektri su dobiveni ručnim laserskim intenzitetom postavljena na 3200 s 80 sličica u spektru. Tada je raspon masa bila postavljena između m
/z
500 i m
/z pregled 5000. Interna kalibracija se nanosi pomoću angiotenzin II i inzulina B vrhova lanca na 912.08 Da i 3495.95 Da, respektivno.
Proteini su identificirane peptida masovno otisaka pomoću programa za pretraživanje Aldente [14] sa primjenjuju se sljedeći parametri za pretraživanje: SWISS-Prot i TrEMBL korišteni su kao baza za sekvenciranje proteina; masa odstupanje od 100 ppm i jedne nepotpune cijepanjem bilo dopušteno; carboxyamidomethylation, oksidirani metionin, te fosforilacija smatra se kao mogući izmjenama; minimalni broj podudarnih-peptida bio 4; i peptid ion je bio [M + H] +. pregled Imunohistokemijska i Western blot analiza pregled, kako bi se potvrdilo izraz uzoraka triju proteina u OKS tkiva, imunohistokemijski provedena je pomoću formalina-fiksna i parafin-ugrađen tkiva uzorci koji su bili podudarni s uzorcima 2-DE. Odvoštiti 5 um debele sekcije su tretirane s 0,3% vodikovim peroksidaze u 3 min i sa blokirajuće antitijelom tijekom 30 min. Nakon pronalaženja antigen topline posredovano, sekcije su inkubirane s primarnim antitijelom na 4 ° C preko noći kako slijedi: HSP27 (Sigma, St. Louis, MO, USA), 1: 500; Hsp 60 (Santa Cruz, Amerika), 1: 300; i PRX-2 (Santa Cruz, Amerika), 1: 150. Uzorci su potom inkubirani s protutijelom obilježenim peroksidazom (1: 500)., Razvijena s diaminobenzine te negativno hematoksilinom
za Western blot analizu, uzorci proteina (30 ug), koji se koriste u 2-DE se provodi na 12% SDS-PAGE, preneseni na PVDF membrane, i zatim su blokirane s PBS /5% obranog mlijeka /0,01% Tween tijekom 2-4 sata na sobnoj temperaturi. Primarna antitijela se razrijedi u puferu za blokiranje i dodan je kako slijedi: Hsp27, 1: 200; Hsp 60, 1: 300; i PRX-2, 1: 200. Poslije toga, se inkubira s peroksidazom hrena (HRP), koje je konjugirano sekundarnog protutijela konjugiranog s HRP-anti-GAPDH /p-aktin antitijelo za potvrdu jednak punjenje proteina u svaku traku tijekom 1-2 sata na 37 ° C i sobne temperature. Uzorci su oprane i detektirane su pojačane kemiluminiscencije 30-60 s (Minipore). Pregled Rezultati
profil razlike između plovili uzoraka LCM i cijela undissected kriostatskim tkiva
Za procjenu učinaka za upravljanje LCM na profilima tkivnih proteina, proveli smo 2-de proteinske profile cijelih undissected kriostatskim tkiva i LCM-uzorcima OKS. Slika 1 prikazuje primjer za upravljanje procesom LCM. Većina točaka otkrivenih u izrezanim bez tumora i tumorskih tkiva može se vidjeti u cijelom undissected kriostatskim tkiva, osim više mjesta. Međutim, još uvijek postoje neke točke koje se nalaze u cijelom undissected zamrznuti tkiva koje se ne može promatrati u oba uzorka LCM. Tako, ova tehnologija ne samo da može obogatiti bez tumora i epitelnim stanicama, ali također može smanjiti onečišćenje u tkivima kao što je hemoglobina [10, 11]. Osim toga, upravljao proces LCM mogao eliminirati efekte mrlja na odvajanje proteina od 2-DE [15]. Dakle, naši podaci podržavaju potrebu za obavljanje navigaciju LCM u proteomskom studijama OKS tkiva. Slika 1 upravljao lasersko snimanje Mikrodisek tumorskog tkiva. (A) hematoksilin umrljan želučane cardia adenokarcinom; (B) neobojene OKS tkiva; (C) tumora tkiva nakon mikrodisekcijom; (D) Snimljeno tumorskih stanica na LCM filmu.
Profil razlike u ekspresiji proteina između OKS tkiva i okolnih ne-tumorskih tkiva pregled smo proveli upravljao LCM i 2-DE za podudarne parova tumorskih tkiva i okolnih ne- tumorskih tkiva iz OKS pacijenata. Oko 800-1,000 proteinske mrlje su otkrivene bojanje srebrom. Za mjerenje ponovljivosti, svaki uzorak prošao eksperiment tri puta. Bilo je 905 ± 74 i 867 ± 51 proteina mjesta u mapi OKS i ne-tumorske želučane srčanog tkiva, respektivno. Podudarne točke bile su 799 ± 29 i 727 ± 34 odvojeno, a dotična prosječna stopa podudaranja bio 88,2%, a 83,8%. Osim toga, prosječno odstupanje položaj podudarnih mrlja nije bio 1,031 ± 0,205 mm i 1,44 ± 0,11 mm u IEF i SDS-PAGE smjeru, respektivno. Iako je analiza slike pokazala je da su ti 2-DE karte bile reproducirati, bilo je malih razlika u intenzitetu i broju mjesta. Ipak, analiza gelova otkrila 27 proteinske mrlje čiji intenziteti bitno i dosljedno varirala između ne-tumorske i tumorske tkiva (Sl. 2). izračunati su omjeri normalizirala licu intenziteta raka do paraneoplasis tkiva za svaku od proteina od interesa. izabrani su; Mjesta pokazuju razliku od dva puta, a statistički značajno (0,05 p <). Tri od rezultata 2-DE potvrđeni su analize imunohistokemijski i Western blot. Slika 2 2-DE karta malignih i nemalignih želuca cardia tkiva. Sve karte prikazani pripravljeni su iz istog pacijenta. (A) karta 2-DE cijelih undissected kriostatskim tkiva; (B) karta 2-DE non-tumorskog tkiva nakon LCM; (C) 2-DE karta OKS tkiva nakon LCM. Identifikacija pregled Protein pregled oba cijelih undissected kriostatskim uzoraka i LCM-primjerci su korišteni za identifikaciju proteina. Dvadeset i sedam različitih proteina točke između OKS tkiva i okolnih ne-tumorskih tkiva su bili odstranjeni. Međutim, samo 23 proteini su identificirani pomoću MALDI-TOF-MS (Tablica 2). Ova pojava je vjerojatno zbog post-translacijske modifikacije poput peroxiredoxin 1 (PRX-1), koji je bio prisutan na dva susjedna mjestima (sl. 2, spot 11). Ovi proteini su razvrstani u bilo što od sljedećeg: proliferaciji i diferencijaciji stanica (ANXA2, ANXA4, hnRNPA2 /B1), apoptoze (PRX-1, PRX-2, GSTP, VDAC, ETFB), metabolizam (ADH1C, AKR1C3, Ca2, GATM ), proteaza vezane (CTSD, PACSIN1) cystoskeleton (Aktin 1 Keratin 8), šaperoni (Hsp27, 60, 70, PDIA3) i RNA vezanje i transkripcija (hnRNPH3, PCBP1, ENO1). Slika 3 prikazuje PMF karata HSP60.Table 2 proteina sa diferencijalne ekspresije između OKS tumorskih tkiva i susjednih uparenih ne-tumorskih tkiva su identificirani MALDI-TOF MS pregled Up-regulacije proteini
spot br pregled protein pregled Pristupanje No.a) pregled mR /PIB) pregled utakmica
pokrivalima (%) c) pregled, T-test pregled obroka (tumora /ne-tumor) Sredstva ± SD pregled 1 pregled Heat-shock protein beta-1 (HSP27) * pregled P04792 pregled 23 /6,0 pregled, 9
54 pregled 0,0040 pregled 3,4279 ± 2,0727 pregled 2 pregled Toplinski šok 70 kDa protein 5 (HSP70) pregled P11021 pregled 70 /5,0 pregled, 22 pregled, 42 pregled 0,0030 pregled 3,2597 ± 1,5314 pregled 3 pregled, 60 kDa protein toplinskog šoka (hsp 60) * pregled P10809 pregled 58 /5,2 pregled, 12 pregled 37
0.0001 pregled 2,8308 ± 1,1426 pregled 4 pregled protein disulfid izomeraze A3 (PDIA3) * pregled P30101 pregled 54 /5,6 pregled, 13 pregled, 41 pregled 0,0280 4,2105 pregled ± 2.7294
5
Aneksin A4 (ANXA4) pregled P09525 pregled 36 /5,8 pregled, 10 pregled, 34 pregled 0,0140 pregled 4,7153 ± 7,3434 pregled 6
Aneksin A2 (ANXA2) pregled P07335 pregled 38 /7,5 pregled, 7
26 pregled 0.0150 pregled 6,0722 ± 5,5431 pregled 7 pregled heterogenih nuklearni ribonukloproteine ​​A2 /B1 (hnRNP A2 /B1 ) * pregled P22626 pregled 37 /9,0 pregled, 16 pregled, 43 pregled 0,0050 pregled 10,7775 ± 9,5547 pregled osam pregled Katepsin D teškog lanca (CTSD) pregled P07339
27 /5,6 pregled, 12 pregled, 61 pregled 0,0012 pregled 4,3552 ± 3,7703 pregled devet pregled proteinske kinaze C i kazein kinaze supstrat u neuronima protein 1 (PACSIN1) pregled Q9BY11 pregled 51 /5,1 pregled, 5
24 pregled 0.0028 pregled 2,6026 ± 1,2147 pregled 10 pregled, glutation S-transferaza P (GSTP) * pregled P09211 pregled 23 /5,4 pregled, 5. pregled 44 pregled 0,0026 pregled 3,8757 ± 2,2198 pregled 11 pregled Peroxiredoxin-1 (PRX-1) * pregled Q06830 pregled 22 /8,3 pregled, 8 pregled 59
0,0140 pregled 4,2744 ± 4,1568 pregled 12 pregled, poli (rC) -vezujući protein1 (PCBP1) *
Q15360
37 /6,7 pregled, 12 pregled, 63 pregled 0.0070
2,7401 ± 0,5321 pregled 13 pregled, Aldo-keto-reduktaze obitelji 1member C3 (AKR1C3)
P42330 Netlogu 37 /8,1 pregled, 7
25 pregled 0,0040 pregled 2,7762 ± 1,1820 pregled, 14 pregled Glycineamidinotransferase (GATM) pregled P50440 pregled 44 /6,4 pregled, 8
23 pregled 0,0390 pregled 2,7839 ± 0,4680 pregled 15 pregled keratinski, tip II staničnog skeleta 8 (keratinski 8) * pregled P05787 pregled 54 /5,5 pregled, 9
25 pregled 0,0020 pregled 3,5063 ± 0,6423 pregled Down-regulacija proteini
16 pregled aktin , citoplazmatske 1 (aktin 1) * pregled P60709 pregled 42 /5,3 pregled, 6
30 pregled 0,0160 pregled 0,2603 ± 0,1539 pregled 17
heterogenim nuklearni ribonukloproteine ​​H3 (hnRNPH3) pregled P31942 pregled 37 /6,4 pregled, 5
28 pregled 0.0015 pregled 0,6028 ± 0,6229 pregled 18 pregled Peroxiredoxin-2 (PRX-2) * pregled P32119
22 /5,7 pregled, 6
24 pregled 0,0250 pregled 0,2376 ± 0,1202 pregled 19 pregled ugljične anhydrase2 (CA2) * pregled P00918 pregled 29 /6,8 pregled, 6
33 pregled 0,0130 pregled 0,3675 ± 0,1270 pregled 20 pregled alfa-enolaza * (ENO1) pregled P06733 pregled 47 /7,0 pregled, 16 pregled, 42 pregled 0.0030
0,2898 ± 0,1340 pregled 21 pregled alkohol dehidrogenaze 1C (ADH1C) pregled P00326 pregled 40 /8,6 pregled, 7
49 pregled 0,0280 pregled 0,2287 ± 0,1680 pregled 22 pregled Electron transfer flavoproteina podjedinica b (ETFB) pregled P38117 pregled 28 /8,3 pregled, 6
26 pregled 0,0240 pregled 0,2655 ± 0,1415 pregled 23 pregled napon ovisan anion selektivnih kanal (VDAC) * pregled P21796 pregled 31 /8,6 pregled, 7
39 pregled 0,0120 pregled 0,4474 ± ​​0,0297 pregled a) pristupni Swiss-Prot br. pregled, b ) Teorijska vrijednost pregled, c) Slijed pokrivenost% pregled * proteini su pronađeni u rak želuca ranije.
Slika 3 MALDI-TOF MS identifikaciju točke 3 u OKS. pregled Imunohistokemijska i western blot analiza za HSP 27, 60 i PRX-2 u OKS
da se dalje ispita da li Hsp27, 60 i PRX-2 su izraženi u tkivima te odrediti koje eksprimiraju ove proteine, imunohistokemijska analiza je izvedena pomoću formalinom fiksno i parafin- ugrađeni uzorci tkiva koje su podudarne s uzorcima 2-DE. Izraz Hsp27 i 60 može se vidjeti u svim cytoplasms stanica karcinoma, a to se može vidjeti u nekim od cytoplasms iz kolone epitela (Sl. 4A-D) u ne-tumorskih tkiva. Nasuprot tome, PRX-2 gotovo nije nađeno da ima ekspresiju na stanicama karcinoma nego u nekim cytoplasms stupčaste epitelnim stanicama (sl. 4E, F). Da ispita ove razine ekspresije proteina, western blot analiza provedena je pomoću istih tkiva (Sl. 5). Kao što se očekivalo, HSP27 i 60 nađeno je da se stalno visoko izražen u tumorskom tkivu, dok PRX-2 bio potisnut. Slika 4 Imunohistokemijska analiza za Hsp27, 60 i PRX-2 u ljudskom normalnom želuca kardija i OKS. Izrazi HSP27 (A), 60 (C), a PRX-2 (e) su bili u citoplazmi stanica tumora; Iskazi Hsp27 (B), 60 (D) i PRX-2 (F) pronađeni su u citoplazmi normalnim stupčastih epitelnih stanica; Uvećanja: A-F × 40, negativno hematoksilinom
Slika 5 Western blot analizu za vrednovanje povećanu ekspresiju Hsp27, 60, i smanjena ekspresija PRX-2 u OKS tkiva.. . GAPDH i β-aktin kao reference su korištene pregled Rasprava pregled kardija je anatomski pogranična između jednjaka i želuca; dakle, postoji stalna kontroverze u vezi njihov odnos u smislu epidemiologije, kliničke slike, a klasifikacija među adenokarcinoma jednjaka (EA), OKS i DGA. Za usporedbu njihovih proteinskih profila, tražili smo literaturu naći tih proteina. Trinaest Od 23 proteini su pronađeni u DGA ranije (tablica 2). Među njima, Hsp27, 60, 70, PDIA3 i CA2 imaju isti oblik ekspresije u OKS i DGA. Nasuprot tome, ekspresija je niska razina u Hsp27 je pronađena u EE [16-20]. Dakle, tumourigenesis OKS se razlikuje od EA i DGA, a time i OKS mora biti različita patološka osoba. Pregled Cellular heterogenost je značajnu prepreku za molekularnu analizu normalnim i bolesnim tkivima. Prvo su opisali Emmert-Buck et al. 1996, laserski snimci Mikrodisek je snažan i precizan tehnika koja se koristi za proučavanje promjena proteina u određenom podskup stanica u sustavu low-održavanje koji je jednostavan za rukovanje [8]. Kao i obično, različite histokemijske mrlje iz tkivnog reza se koristi za usmjeravanje procesa disekcije. Međutim, nekoliko slučajeva su pokazali umjereno do dramatičnih efekata mrlja na odvajanje proteina od 2-DE [21, 22]. Da biste uklonili mrlje kao potencijalni štetnog utjecaja, upravljao LCM je nedavno razvijena. Ona koristi umrljani dio voditi seciranje od neobojene susjednih uzoraka [23]. Ova tehnika se uspješno primjenjuje u ispitivanju uzoraka mozga [15]. Osim toga, s obzirom na tipične morfološke karakteristike želučane srčanog površne kolone stanice i srčanog žlijezde, oni su lako prepoznati na dehidriranu sekciji bez mrlja. Dakle, upravljao LCM postao optički strategija u našoj proteomici pristupu. U ovom istraživanju, broj LCM-izvedeni nemalignih i malignih stanica varira značajno i često su bili mali u usporedbi s cijelim undissected kriostatskim tkiva, bez obzira na profilima koji su bili vrlo slični između uzoraka LCM i one undissected. To pokazuje da je upravljao LCM može biti izvedivo pristup za proučavanje želučane srčanog tkiva i da je kompatibilan sa 2-DE i MALDI-TOF MS. Pregled Dobili smo profil proteina OKS usporedbom promjene u proteinu profili okružuje non-tumorskih tkiva. Kako bi smanjili individualne razlike, uzorci tkiva dobiveni su iz istog pacijenta, što nam omogućuje da studij diferencijalne ekspresije proteina pod sličnim genomske pozadini. Koliko je nama poznato, izvijestili smo prvi proteomski analizu OKS. Od 27 odabranih proteina mjestima, 23 proteina u molekularnoj raspona mase od 15 do 75 kDa i izoelektričnu točku između 3 i 10 identificirani su 2-DE i MALDI-TOF MS. Većina tih proteina su prije opisani kao različitiom ekspresijom bilo na razini mRNA ili na razini proteina u drugim tipovima humanog karcinoma.
Vezani na su grupa proteina stresom inducirane različitim vrstama okoliša i patofiziološkim inzulta. U ovom istraživanju, pronađeni su ko-up-propisi Hsp27, 70, i 60 u želučanim srčanih tumorskih tkiva. Kao pratiocima, HSP27 i HSP70 može inhibirati apoptozu interakcijom s apoptosome i kaspaza aktivacijskog složenog [24], u podlozi njihove uloge u progresiji tumora i otpornosti na liječenje [25]. Brojne studije pokazuju da Hsp27 i Hsp70 overexpressions signalizirati lošu prognozu i predviđaju slab odgovor na kemoterapiju. Hsp 60 Čini se da je ključnu endogenih upalnih medijatora i vjerojatno izdana od strane oštećenih stanica. Osim toga, zajedno s HSP70, HSP60 ima ulogu u prezentaciji antigena u malignih bolesti [26]. Vezani na također povećana kod raka dojke, kolorektalni, želuca i karcinoma prostate [10, 25]. Stoga, pojačanom ekspresijom Hsp27, 70, i 60 mogu biti korisni za biomarkera karcinogeneze u OKS i mogu biti povezani s stupnju diferencijacije i prognozu OKS.
Među identificiranih proteina, dva proteina koji su uključeni u regulaciju transkripcije i ekspresija gena povezanih s tumorom. PCBP1, regulira prema gore u OKS, je RNA Chaperone post-transkripcijski regulator. Pokazano je da je PCBP1, uz PTB-1 i hnRNPK, kontrolira neke protoonkogen gena i apoptozu vezane gene ekspresiju, kao što su Bag-1, c-myc,
Apaf-1, XIAP i DAP5, kroz stimuliranje aktivnosti unutarnjeg prijama ribosome segmenta (IRES). PCBP1 je potreban za otvaranje RNA u regiji koja sadrži prozor za unos ribosome, a PTB-1 može biti potrebno za ribosoma zapošljavanje [27, 28]. Nedavno, Pickering, B.M. et al. opisao kako su Glikanske dijelovi PCBP1 može biti povezano s metastatskim sposobnosti i može igrati ulogu u hepatocelularnog karcinoma metastaza [27]. Tada je up-regulacija PCBP1 može regulirati kapu neovisan mehanizam inicijaciju translacije srčanih povezanih s tumorom gena u razvoju OKS. Kao tumor-supresor, alfa-enolaze može regulirati aktivnost c-myc promotorske u obliku veznog proteina c-myc (MBP-1). MBP-1 tada se može vezati na P2 element c-myc promotora i natječu s proteinom vezivanja TATA box (TBP) potisnuti transkripciju c-myc [29, 30]. S druge strane, down-regulaciju Alfa-enolaze u skladu s radom Chang YS sur.

• Klinički značaj palijativne gastrektomije na preživljavanje bolesnika s neizlječivom uznapredovalim rakom želuca: sustavni pregled i meta-analysis
• Mikrornk-645, regulira prema gore u ljudskom adencarcinoma želučanog jednjaka čvora, inhibira apoptozu ciljajući tumor supresor IFIT2