el análisis del proteoma de adenocarcinoma de cardias gástrico humano mediante análisis de captura por láser microdissection

proteoma de adenocarcinoma de cardias gástrico humano por captura láser microdisección
Resumen Antecedentes

La incidencia de adenocarcinoma gástrico cardiaco (GCA) se ha incrementado en las últimas dos décadas en china, pero los cambios moleculares relacionados con la carcinogénesis no han sido bien caracterizado.
Métodos
en este estudio, hemos utilizado un enfoque proteómico comparativo para analizar las cardias gástrico malignas y no malignas células epiteliales aisladas por navegado microdisección de captura por láser ( LCM) a partir de muestras quirúrgicas pareadas de GCA humano.
resultados
Veintisiete manchas correspondientes a 23 proteínas fueron consistentemente regulados diferencialmente. Quince proteínas se demostrado ser regulada up-, mientras que ocho proteínas, se mostró a ser reguladas por las células malignas en comparación con las células epiteliales columnares no malignas. Las proteínas identificadas parecen estar implicados en el metabolismo, chaperona, antioxidación, la transducción de señales, la apoptosis, la proliferación celular y la diferenciación. Además, las expresiones de HSP27, 60, y PRX-2 en muestras de ACG se confirmaron posteriormente mediante transferencia de inmunohistoquímica y análisis Western.
Conclusión
Estos datos indican que la combinación de LCM navegado con 2-DE proporciona una estrategia eficaz para el descubrimiento de proteínas que se expresan diferencialmente en GCA. Tales proteínas pueden contribuir en la elucidación de los mecanismos moleculares de la carcinogénesis GCA. Por otra parte, la combinación proporciona potenciales biomarcadores clínicos que ayudan en la detección temprana y proporcionar a los posibles dianas terapéuticas.
Antecedentes
Diversos análisis de los datos de incidencia de cáncer seleccionados de los países occidentales han revelado tasas de rápido aumento de adenocarcinoma de esófago y cardias gástrico en las últimas décadas, en comparación con las tasas estables y decrecientes para el carcinoma esofágico de células escamosas (SCC) y adenocarcinoma gástrico distal (DGA) [1-3]. Este fenómeno también es evidente en China, con la excepción de que el aumento de la incidencia de adenocarcinoma de cardias gástrico (ACG) aparece notablemente mayor que la incidencia de cáncer de esófago. La evidencia indica que la ACG es una entidad clínica distinta como su patogénesis y factores de riesgo son muy diferentes de la DGA. Por lo tanto, la ACG es mucho más frecuente, con una mayor incidencia de metástasis en los ganglios linfáticos y peor pronóstico que la DGA [4]. La incidencia anual de GCA es 50 /100.000, e incluso puede ser tan alta como 190 /100.000 en varias regiones de China [5]. La naturaleza relativamente asintomática en las primeras etapas de la enfermedad y la falta de pruebas de detección adecuados han resultado en la mayoría de los pacientes diagnosticados de ACG ser en una etapa ya avanzada de la enfermedad. Por lo tanto, es necesario comprender el mecanismo molecular de la carcinogénesis y para identificar los biomarcadores para el diagnóstico precoz y el tratamiento eficaz de GCA humano.
Recientemente, el proteoma se ha convertido en un componente del complemento del genoma. La suposición es que podría ayudar a desentrañar drásticamente en los mecanismos bioquímicos y fisiológicos de enfermedades multivariables complejos a nivel molecular funcional. Aunque mutación genética y /o la expresión del gen errante puede ser la base de una enfermedad, las bases bioquímicas para la mayoría de las enfermedades son causadas por defectos de proteínas. Por lo tanto, un análisis de la abundancia global de proteína en los tumores humanos, llamada proteómica cáncer, podría ofrecer muchas oportunidades y desafíos en la identificación de nuevos marcadores tumorales y dianas terapéuticas, así como en la comprensión de la patogénesis del tumor. Actualmente, la electroforesis bidimensional en gel (2-DE) y espectrometría de masas (MS) son las herramientas más ampliamente empleado para la separación e identificación de proteínas. Sin embargo, la heterogeneidad es siempre una preocupación en los estudios de tejido tumoral humano. Aunque el cultivo de células es un enfoque para superar este problema, podría no representa con precisión los eventos moleculares que tienen lugar en el tejido real de la que se derivaron [6]. Una comparación entre las líneas celulares de próstata humano y células tumorales de los mismos pacientes mostró que 20% de los perfiles de proteína se [7] alterado. de captura láser microdissection (LCM) es un desarrollo reciente que puede ser utilizado para adquirir subpoblación altamente representativa de las células de muestras de tejidos heterogéneos complejos [8]. Esta tecnología se ha utilizado con mucho éxito en una amplia gama de estudios que utilizan análisis de aguas abajo en el ADN y los niveles de ARN, incluyendo la expresión génica global de perfiles de [9] y análisis del proteoma de próstata [7], colon [10], hepatocelular [11 ], de mama [12], y los tumores de páncreas [13]. Sin embargo, la combinación de 2-DE y EM nunca se ha aplicado al estudio de la ACG humano.
Este estudio tiene como objetivo describir la carcinogénesis de la ACG y para identificar las proteínas GCA-específicas asociadas a la enfermedad como potenciales biomarcadores clínicos para la detección precoz y nuevas dianas terapéuticas. Se realizó navegado LCM para enriquecer tanto las células epiteliales gástricas cardíacas malignas y no malignas de las piezas quirúrgicas pareadas de GCA humano. Las proteínas extraídas de estas células se separaron por 2-DE. manchas de proteínas diferenciales se identificaron mediante huella dactilar de masa peptídica (PMF) sobre la base de desorción por láser asistida por matriz /ionización de espectrometría de masas de tiempo de vuelo (MALDI-TOF MS) y la búsqueda de base de datos. La validez de estos resultados fue confirmada por inmunohistoquímica y Western-blot análisis.
Métodos Materiales

tiras IPG (pH 3-10) y no lineal soluciones tampón de pH 3-10 (IPG no lineal) se adquirieron de Amersham Pharmacia Biotech (APB, Suecia). TDT, urea, tiourea, base de Tris, TX-100, CHAPS, glicina, acrilamida, metilenbisacrilamida, SDS, TEMED, persulfato de amonio, nitrato de plata, tripsina (grado de secuenciación), ACN, y TFA se adquirieron de Sigma (St. Louis, MO, EE.UU.). Por último, la completa cóctel inhibidor de proteasa era de Roche (Lewes, Reino Unido). Se utilizó agua de calidad Milli-Q para todas las soluciones.
muestras GCA
Nueve pares de adenocarcinoma de cardias gástrico humano y sus tejidos adyacentes cardias nontumourous fueron obtenidos dentro de los 30 minutos después de una resección quirúrgica en el segundo hospital afiliado de Xi ' un Jiaotong University en 2005 (Tabla 1). Con el fin de evitar las zonas evidentes de úlcera o necrosis, las muestras se obtienen de los bordes de los tumores. Ellos se congelaron inmediatamente en nitrógeno líquido y se almacenaron a -80 ° C hasta su uso. consentimientos informados se obtuvieron de todos los pacientes. Mientras tanto, dos patólogos experimentados evaluaron el grado tumoral mediante un examen microscópico de las samples.Table 1 Los datos clínicos e histológicos de muestras de tumores de pacientes
Case

Age

Gender

Locationa)

Size(cm)

Grade

1
58
M
Within 2 cm de la UGE
1,5 × 2
moderadamente diferenciado
2 63 M

un plazo de 2 cm de la UGE página 5 × 6
moderadamente diferenciado página 3
46
M
un plazo de 2 cm de la UGE
4 × 5
moderadamente diferenciado
4 de 60
M
un plazo de 2 cm de la UGE
2 × 2.5
bien diferenciado página 5
73
M
un plazo de 2 cm de la UGE Estrellas: 3 × 1 | Bien diferenciado página 6
70
M Bienvenidos en los 2 cm de la UGE página 2 × 1 | Bien diferenciado página 7
55
M
un plazo de 2 cm de la UGE página 2 × 3
mal diferenciada página 8
51
M
un plazo de 2 cm de la UGE
4 × 6
pobremente diferenciado página 9
63
M
un plazo de 2 cm de la UGE Estrellas: 3 × 2,5
pobremente diferenciado
a) Lugar: epicentro de tejido tumoral
preparación de muestras para LCM
Secciones (8 um de espesor) se cortaron en láminas (ya lavadas con detergente, se lavó con agua desionizada, y se sumerge en etanol) utilizando un Leica CM 1900 criostato (temperatura de la cámara -28 ° C). Las secciones se almacenaron a -80 ° C o se mantiene en la cámara del criostato antes de LCM. Hematoxilina tinción se llevó a cabo sólo para el seguimiento de las secciones de tejido y no se utilizó en conjunción con LCM. Las secciones fueron fijadas (70% de etanol durante 1 min), hematoxilina manchado y deshidratada (70% de etanol durante 45 s, 95% de etanol durante 45s, 2 × 100% de etanol durante 30 años, y seguidas por xileno 2 × para 5 min). Mientras tanto, se utilizaron secciones no teñidas para LCM. Ellos se fijaron (70% de etanol durante 30 s), se lavó en agua desionizada durante 10 s, y deshidratada (70% de etanol durante 15 segundos, 95% de etanol durante 15 s, 2 × 100% de etanol durante 15 s, y seguido de xileno 2 × durante 1 min ). Completos comprimidos de cóctel inhibidor de la proteasa fueron navegado
LCM
Después de la fijación y la deshidratación, las secciones no teñidas se secaron al aire y microdissected usando el sistema de Arcturus PixCellα (Arcturus, Mountain View, CA, EE.UU.). LCM microscopio fotografiada una sección teñida con hematoxilina adyacente a la de interés. Esta imagen se visualiza en la pantalla del ordenador LCM LCM utilizando el software de análisis de imágenes (Arcturus, EE.UU.) y fue utilizado como un mapa para delimitar la región para la disección de una sección sin teñir adyacente. Las secciones fueron capturados utilizando un haz de 15 um de diámetro con láser normalmente a 50-80 mV de energía con duración de pulso de 3-10 ms en modo de ametralladora y con una frecuencia de disparo de láser de disparo 1 por cada 500 ms. En promedio, se tomaron entre 10.000-12.000 disparos por gorra, y se obtuvieron aproximadamente 25.000-30.000 células por tapa. Cada tapa fue capturado dentro de una hora. Sobre la base de una revisión cuidadosa de las secciones histológicas, se estimó que cada disección para contener ≥ 95% de las células deseadas.
Tapas de microdisección se insertaron en tubos de microcentrífuga de 0,5 ml que contenían 50 ul de un tampón de lisis (7 M urea, 2 M tiourea, 4% w /v de CHAPS, DTT 65 mM, 0,5% v /VTX-100, 40 mMTris-base, y completa de cóctel inhibidor de la proteasa). Luego, las células se solubilizaron mediante la inversión de los tubos, seguido de vórtice de mezcla de 1 min y breve pulso-centrifugación a 12, 000 × g. Posteriormente, los tejidos de múltiples tapas (alrededor de 800.000 ~ 1.000.000 células) se extraen en el mismo tampón de lisis hasta que se haya recogido suficiente material. Las muestras se centrifugaron a 40.000 x g durante 1 hora a 4 ° C. Cuando sea necesario, los sobrenadantes se almacenaron a -80 ° C hasta su uso posterior. La concentración de proteína se determinó por el método de Bradford.
2-DE comentario El primero dimensiones de enfoque isoeléctrico (IEF) se llevó a cabo en el sistema de Pharmacia Immobiline DryStrip IPG (Uppsala, Suecia). Para la primera dimensión de la electroforesis, las muestras que contenían 60 ug de proteína para los geles de análisis se diluyeron a 250 uL con una solución de rehidratación (7 M urea, 2% w /v de CHAPS, DTT 50 mM, 0,5% v /v tampón IPG (pH 3-10 no lineal), y trazas de azul de bromofenol) antes de cargar en 13 cm tiras IPG (pH3-10 no lineales). entonces IEF se realizó utilizando unidad de electroforesis IPGphor de acuerdo con las instrucciones del fabricante. A continuación, las tiras se equilibraron con una solución de (6 M urea, 30% v /v de glicerol, 2% w /v de SDS, y mM Tris-HCl 50, pH 8,8), reducen con 1% w /v de DTT durante 15 min y alquila con 2,5% w /v yodoacetamida durante 15 min. Las tiras se enjuagan en tampón de electroforesis (base Tris 25 mM, glicina 192 mM, y 0,1% w /v de SDS), aplicado a 11% en geles de acrilamida, y se sellan con agarosa fundida (0,5% w /v de agarosa en tampón de electroforesis que contiene una traza de azul de bromofenol). SDS-PAGE se llevó a cabo usando Hoefer SE 600 cámaras verticales y un tampón de Tris-glicina (Tris 25 mM y glicina 192 mM) que contiene 0,1% w /v de SDS, con una separación inicial en una constante de 10 mA /gel durante 30 min seguido de 20 mA /gel. La segunda dimensión SDS-PAGE fue desarrollado hasta que el colorante azul de bromofenol marcador había llegado a la parte inferior del gel. El tiempo de ejecución total fue típicamente de 4 a 4,5 horas. Los geles se fijaron en 10% v /v de ácido acético, 40% v /v de etanol antes de la sensibilización durante 30 min en un tampón que contiene 30% de tiosulfato de sodio v de acetato de sodio 0,83 M v /v de etanol, 0,2% w /y. Esto fue seguido por tres lavados de 15 min en agua desionizada. Las proteínas fueron teñidas con 0,1% w /v de nitrato de plata durante 20 min, se lavaron dos veces en agua desionizada durante 1 min, y se desarrollaron en 2,5% w /v de carbonato de sodio que contiene 0,04% v formaldehído (solución 37%) v /. El desarrollo se detuvo con 1% v v /ácido acético, y los geles se lavaron tres veces en agua. El análisis de imágenes y el análisis estadístico

Umax ImageScanner (Amersham Biosciences) se utilizó para escanear los geles, mientras que la imagen principal ™ software 2D Platinum Version 5.0 (Amersham Biosciences) se utilizó para la detección de puntos, la cuantificación, y la coincidencia. La intensidad de cada mancha se cuantificó por% en volumen. Los datos fueron analizados a continuación, utilizando SPSS para Windows 11.5 y Excel. de t
se utilizó para analizar las diferencias en los niveles de proteína entre las muestras de ACG y no tumorales, con un nivel de confianza del 95%: examen.
MALDI-TOF-MS y de búsqueda de base de datos de
consistente y significativamente diferente del Estudiante puntos seleccionados para el análisis por MALDI-TOF MS. manchas de proteína de interés se escindieron y se desmenuzaron en trozos pequeños, seguido de decoloración y el lavado con agua desionizada varias veces hasta que el color amarillo desapareció. los trozos de gel se enjuagaron después con bicarbonato de amonio 25 mM, se deshidrataron con ACN, y se secaron en una centrífuga de vacío. Después, las proteínas en el gel se digirieron con 0,02 ug /uL de tripsina durante la noche a 37 ° C. Los péptidos trípticos fueron luego volvió a disolver en una solución que contiene 50% v /v ACN y 0,2% v /v de TFA. A 2 uL alícuota fue vista sobre una placa de muestra con 4 l de CHCA solución de matriz (a-ciano-4-hydroxcinnamic ácido, 10 mg /ml en 50% v /v ACN, 0,2% v /v de TFA) y se dejó al aire seco. Las manchas secas se analizaron entonces en un Voyager DE MALDI-TOF MS (Framingham, MA, EE.UU.). Esto fue seguido por la ejecución del espectrómetro en un modo de ion positivo y en el modo reflector con los siguientes ajustes: voltaje de aceleración, 20 KV; tensión gride, 94%; Tensións alambre, 0,01%; y un retraso de 200 ns. Los espectros se adquirieron de forma manual con la intensidad del láser fijado en 3200 con 80 disparos por espectro. A continuación, el rango de masas se estableció entre
m /z 500 y m

/z
5000. La calibración interna se aplicó usando picos de la cadena de la angiotensina II y la insulina B en 912,08 Da y 3495,95 Da, respectivamente.
proteínas se identificaron por huellas másicas de péptidos utilizando el programa de búsqueda Aldente [14] con los siguientes parámetros de búsqueda aplicados: SWISS-PROT y TrEMBL se utilizaron como las bases de datos de secuencias de proteínas; una tolerancia de masa de 100 ppm y una escisión incompleta si no estuviera permitido; carboxiamidometilación, metionina oxidados, y la fosforilación se consideraron como posibles modificaciones; el número mínimo de péptidos coincidentes era 4; y el ion péptido fue [M + H] +.
usando tejido fijado en formol e incluido en parafina inmunohistoquímica y Western blot
Para validar los patrones de expresión de tres proteínas en los tejidos GCA, se realizó inmunohistoquímica especímenes que coincidieron con las muestras 2-dE. Desparafinado 5 um de espesor secciones se trataron con una peroxidasa de hidrógeno 0,3% durante 3 min y con un anticuerpo de bloqueo para 30 min. Después de la recuperación de antígeno mediada por calor, las secciones se incubaron con anticuerpo primario a 4 ° C durante la noche de la siguiente manera: HSP27 (Sigma, St. Louis, MO, EE.UU.), 1: 500; Hsp60 (Santa Cruz, América), 1: 300; y PRX-2 (Santa Cruz, América), 1: 150. Las secciones fueron incubadas con un anticuerpo marcado con peroxidasa (1: 500)., Desarrollado con diaminobenzine, y de contraste con hematoxilina
Para el análisis de transferencia Western, las muestras de proteína (30 ug) utilizados en 2-DE se realizaron en 12% SDS-PAGE, se transfirieron a membranas de PVDF, y después se bloqueó con PBS /5% de leche desnatada /0,01% de Tween durante 2-4 horas a temperatura ambiente. El anticuerpo primario se diluyó en tampón de bloqueo y se añadió el siguiente: HSP27, 1: 200; Hsp60, 1: 300; y PRX-2, 1: 200. Después, se incubó con una peroxidasa de rábano picante (HRP) conjugado con anticuerpo secundario y un anticuerpo conjugado con HRP anti-GAPDH /β-actina para confirmar la igualdad de carga de proteína en cada carril durante 1-2 horas a 37 ° C o temperatura ambiente. Las muestras se lavaron y se detectaron con quimioluminiscencia potenciada por 30-60 s (Minipore).
: Resultados de la diferencias entre las muestras del perfil LCM navegadas y tejidos de criostato no seccionada enteros
Para evaluar los efectos de LCM navegado en los perfiles de proteínas de los tejidos, se realizó 2-dE perfiles de proteínas de los tejidos de criostato no seccionada enteros y LCM-muestras de GCA. La figura 1 muestra un ejemplo del proceso de LCM navegado. La mayoría de las manchas detectadas en los tejidos no tumorales y tumores disecados se pudo observar en todo los tejidos de criostato no seccionada, a excepción de varios puntos. Sin embargo, todavía hay algunos puntos que se encuentran en todo el tejido criostato no seccionada que no se pudo observar en ambas muestras LCM. Por lo tanto, esta tecnología no sólo podría enriquecer células epiteliales no tumorales y tumorales, pero también podría disminuir la contaminación en los tejidos tales como la hemoglobina [10, 11]. Por otra parte, el proceso de LCM navegado podría eliminar los efectos de tinción en la separación de proteínas por 2-DE [15]. Por lo tanto, nuestros datos apoyan la necesidad de realizar navegado LCM en los estudios proteómicos de tejidos GCA. Figura 1 Navigated láser microdisección de captura de tejido tumoral. (A) Hematoxilina-manchado adenocarcinoma de cardias gástrico; tejido (B) no teñida GCA; (C) Tejido tumoral después de microdisección; (D) Capturado células tumorales en la película LCM.
Diferencias del perfil de expresión de proteínas entre los tejidos GCA y tejidos no tumorales circundantes
Se realizó un LCM y navegado 2-DE para parejas de tejidos tumorales y no la rodea tejidos tumorales de pacientes con ACG. Aproximadamente 800-1.000 manchas de proteínas se detectaron por tinción con plata. Para medir la reproducibilidad, cada muestra se sometió el experimento tres veces. Había 905 ± 74 y 867 ± 51 manchas de proteínas en el mapa de GCA y tejido cardíaco gástrico no tumoral, respectivamente. Los puntos coincidentes fueron 799 ± 29 y 727 ± 34 por separado, y la tasa media de juego respectiva fue del 88,2% y 83,8%. Además, la desviación de posición promedio de puntos emparejados fue 1,031 ± 0,205 mm y 1,44 ± 0,11 mm en la dirección IEF y SDS-PAGE, respectivamente. Aunque el análisis de la imagen demostró que estos mapas 2-DE fueron reproducibles, hubo ligeras diferencias en la intensidad y el número de manchas. Sin embargo, un análisis de los geles reveló 27 manchas de proteínas cuyas intensidades variado sustancialmente y consistente entre no tumoral y tejidos tumorales (Fig. 2). Se calcularon las relaciones de las intensidades de terreno normalizadas de cáncer a tejidos paraneoplasis para cada una de las proteínas de interés. Se seleccionaron; manchas que muestran una diferencia de dos veces y con significación estadística (p <0,05). Tres de los resultados 2-DE fueron confirmados por análisis de transferencia de inmunohistoquímica y occidental. Figura 2 2-DE mapa de tejido cardias gástrico malignas y no malignas. Todos los mapas mostrados se preparan a partir del mismo paciente. (A) 2-DE mapa de tejidos de criostato no seccionada enteros; (B) 2-DE mapa de tejido no tumoral después de LCM; (C) 2-DE mapa de tejido GCA después de LCM.
Identificación de proteínas
Ambos especímenes de criostato no seccionada enteros y LCM-especímenes fueron utilizados para la identificación de proteínas. Se escindieron veinte y siete puntos de proteínas diferentes entre los tejidos GCA y tejidos no tumorales circundantes. Sin embargo, sólo 23 se identificaron las proteínas por MALDI-TOF-MS (Tabla 2). Este fenómeno se debe probablemente a modificaciones postraduccionales como peroxirredoxina 1 (PRX-1), que estaba presente en dos puntos adyacentes (Fig. 2, punto 11). Estas proteínas se clasifican en ninguna de las siguientes: la proliferación celular y la diferenciación (ANXA2, ANXA4, hnRNPA2 /B1), la apoptosis (PRX-1, PRX-2, SGPC, VDAC, ETFB), el metabolismo (ADH1C, AKR1C3, CA2, GATM ), proteasa relacionada (CTSD, PACSIN1), cystoskeleton (actina 1, la queratina 8), chaperones (HSP27, 60, 70, PDIA3), y el ARN vinculante y transcripción (hnRNPH3, PCBP1, ENO1). La Figura 3 muestra los mapas de PMF HSP60.Table 2 Las proteínas con expresión diferencial entre los tejidos tumorales GCA y tejidos no tumorales emparejados adyacentes fueron identificados por MALDI-TOF MS
Sobre regulación proteínas
puesto número
proteína
adhesión NO.A) sobre Mr /PIB)
Partido
Cov (%) c)
T-test
Ración (/no tumoral del tumor) medias ±
1 | proteína de choque térmico beta-1 (HSP27) *
P04792
23 /6.0 página 9
54
0,0040 3,4279 ± 2,0727

2 de choque térmico de 70 kDa proteína 5 (HSP70)
P11021
70 /5.0
22
42
0,0030 3,2597 ± 1,5314
página 3
60 kDa proteína de choque térmico (Hsp60) *
P10809
58 /5.2 página 12
37
0,0001 2,8308 ± 1,1426

4 de disulfuro isomerasa A3 (PDIA3) *
P30101
54 /5.6 página 13
41
0,0280 4,2105
± 2,7294 página 5
Anexina A4 (ANXA4)
P09525
36 /5,8
10
34
0,0140 4,7153 ± 7,3434
página 6
Anexina A2 (ANXA2)
P07335
38 /7.5 página 7
26
0,0150 6,0722 ± 5,5431
página 7
heterogéneo ribonucleoproteínas nucleares A2 /B1 (hnRNP A2 /B1 ) *
P22626
37 /9,0
16
43
0,0050 ± 9,5547 10,7775
página 8
catepsina D de la cadena pesada (CTSD)
P07339
27 /5.6 página 12
61
0,0012 4,3552 ± 3,7703
página 9
proteína quinasa C y la caseína quinasa sustrato en las neuronas proteína 1 (PACSIN1)
Q9BY11
51 /5.1 página 5
24
0,0028 2,6026 ± 1,2147

10
glutatión S-transferasa P (SGPC) *
P09211
23 /5.4
5
44
0,0026 3,8757 ± 2,2198
página 11
peroxiredoxina-1 (PRX-1) *
Q06830
22 /8.3 página 8
59
0,0140 4,2744 ± 4,1568
página 12
poli (rC) -vinculante protein1 (PCBP1) *
Q15360
37 /6.7 página 12
63
0,0070
2,7401 ± 0,5321 página 13
Aldo-ceto reductasa familia 1member C3 (AKR1C3)
P42330
37 /8.1 página 7
25
0,0040 2,7762 ± 1,1820
página 14
Glycineamidinotransferase (GATM)
P50440
44 /6.4 página 8
23
0,0390 2,7839 ± 0,4680

15
la queratina, tipo II citoesqueleto 8 (la queratina 8) *
P05787
54 /5.5 página 9
25
0,0020 3,5063 ± 0,6423

baja regulación proteínas actina
16
citoplásmicos, 1 (actina 1) *
P60709
42 /5.3 página 6
30
0,0160 0,2603 ± 0,1539

17
ribonucleoproteínas nucleares heterogéneos H3 (hnRNPH3)
P31942
37 /6.4 página 5
28
0,0015 0,6028 ± 0,6229

18
peroxiredoxina-2 (PRX-2) *
P32119
22 /5.7 página 6
24
0,0250 0,2376 ± 0,1202
página 19
anhydrase2 carbónico (CA2) *
P00918
29 /6.8 página 6
33
0,0130 0,3675 ± 0,1270

20
alfa-enolasa * (ENO1)
P06733
47 /7.0
16
42
0,0030
0,2898 ± 0,1340
21
alcohol deshidrogenasa 1C (ADH1C)
P00326
40 /8.6 página 7
49
0,0280 0,2287 ± 0,1680

22
Electron transferencia flavoproteına subunidad B (ETFB)
P38117
28 /8.3 página 6
26
0,0240 0,2655 ± 0,1415

23
de aniones dependiente de voltaje canal selectivo (VDAC) *
P21796
31 /8.6 página 7
39
0,0120 0,4474 ± ​​0,0297

a) Swiss-Prot adhesión no.
b ) valor teórico
c) la cobertura de secuencia
% * Las proteínas se han encontrado en el cáncer gástrico anteriormente.
Figura 3 identificación de MALDI-TOF MS del punto 3 en la ACG.
inmunohistoquímica y Western blot para el análisis HSP 27, 60, y PRX-2 en GCA
para investigar más si HSP27, 60, y PRX-2 se expresa en los tejidos y para determinar qué células expresan estas proteínas, el análisis inmunohistoquímico se realizó utilizando fijado con formalina y parafina especímenes de tejido incluidas las que coincidió con las muestras 2-dE. La expresión de HSP27 y 60 podría ser visto en todos los citoplasmas de las células de carcinoma, mientras que podría ser visto en algunos de los citoplasmas de epitelio columnar (Fig. 4A-D) en los tejidos no tumorales. En contraste, se encontró casi no PRX-2 que se expresa en las células de carcinoma sino más bien en algunos de los citoplasmas de las células epiteliales columnares (Fig. 4E, F). Para examinar estos niveles de expresión de proteínas, análisis de Western blot también se llevó a cabo utilizando los mismos tejidos (Fig. 5). Como era de esperar, HSP27 y 60 se han encontrado para ser consistentemente altamente expresado en el tejido tumoral, mientras que se suprimió PRX-2. Figura 4 Análisis inmunohistoquímico para HSP27, 60, y PRX-2 en cardia gástrica normal humana y GCA. Expresiones de HSP27 (A), 60 (C), y PRX-2 (E) estaban en el citoplasma de las células tumorales; Expresiones de HSP27 (B), 60 (D) y PRX-2 (F) se han encontrado en el citoplasma de las células epiteliales columnares normales; Aumentos: A-F × 40, a contratinción con hematoxilina
Figura 5 Análisis de transferencia Western para la validación de la mayor expresión de HSP27, 60, y disminución de la expresión de PRX-2 en los tejidos GCA.. . GAPDH y β-actina se utilizaron como referencias
Discusión
Cardia es la frontera anatómica entre el esófago y el estómago; Por lo tanto, existe una controversia constante con respecto a su relación en términos de epidemiología, características clínicas, y la clasificación entre el adenocarcinoma esofágico (EA), ACG, y DGA. Para comparar sus perfiles de proteínas, se realizaron búsquedas en la literatura para encontrar estas proteínas. Trece de 23 proteínas se han encontrado en DGA previamente (Tabla 2). Entre ellos, HSP27, 60, 70, PDIA3, y CA2 tienen el mismo patrón de expresión en GCA y DGA. En contraste, un bajo nivel de expresión de HSP27 se encontró en EA [16-20]. Por lo tanto, la génesis tumoral de GCA es diferente de EA y DGA, y por lo tanto GCA debe ser una entidad patológica distinta.
Heterogeneidad celular ha sido una barrera significativa para el análisis molecular de los tejidos normales y enfermos. Descrita por primera vez por Emmert-Buck et al. en 1996, la captura láser microdissection es una técnica potente y preciso utilizado para estudiar los cambios de proteínas en un subconjunto particular de células en un sistema de bajo mantenimiento que es fácil de operar [8]. Como de costumbre, varias tinciones histoquímicas de la sección de tejido se utilizan para guiar el proceso de disección. Sin embargo, varios casos han demostrado moderada a efectos dramáticos de tinción en la separación de proteínas por 2-DE [21, 22]. Para eliminar las manchas como un potencial efecto perjudicial, navegado LCM se ha desarrollado recientemente. Se utiliza una sección teñida para guiar la disección de la muestra no teñidas adyacentes [23]. Esta técnica se ha aplicado con éxito en el estudio de muestras de cerebro [15]. Además, debido a las típicas características morfológicas de la célula superficial cardiaca gástrico columnar y la glándula cardiaca, que son fáciles de identificar en una sección de deshidratada sin tinción. Por lo tanto, LCM navegado convirtió en una estrategia óptica en nuestro enfoque de la proteómica. En esta investigación, el número de células no malignas y malignas LCM derivados variaron considerablemente y eran a menudo pequeñas en comparación con el conjunto de tejidos de criostato no seccionada, a pesar de los perfiles que eran muy similares entre las muestras de LCM y los que no seccionada. Esto indicó que el LCM navegado puede ser un enfoque viable para el estudio de tejido cardíaco gástrico y que es compatible con 2-DE y MALDI-TOF MS.
Se obtuvo el perfil de proteínas de GCA mediante la comparación de los cambios en la proteína los perfiles de los tejidos circundantes no tumorales. Para reducir las diferencias individuales, las muestras de tejido se obtuvieron de la misma paciente, lo que nos permite estudiar la expresión diferencial de proteínas bajo fondo de genómica similar. A lo mejor de nuestro conocimiento, se informó el primer análisis proteómico de la ACG. De los 27 puntos de proteínas seleccionadas, 23 proteínas en el intervalo de masa molecular de 15 a 75 kDa y con un punto isoeléctrico entre 3 y 10 fueron identificados por 2-DE y MALDI-TOF MS. La mayoría de estas proteínas se han descrito anteriormente como diferencialmente expresado ya sea en el nivel de ARNm o a nivel de proteína en otros tipos de cáncer humano.
HSPs son un grupo de proteínas de estrés inducidas por diversos tipos de agresiones ambientales y fisiopatológicos. En este estudio, no se encontraron co-up-reglamentos de HSP27, 70, y 60 en los tejidos tumorales cardíacos gástricos. Como chaperones, HSP27 y HSP70 podría inhibir la apoptosis mediante la interacción con apoptosome y la caspasa de la activación del complejo de [24], que subyace a su papel en la progresión tumoral y la resistencia al tratamiento [25]. Numerosos estudios indican que HSP27 y HSP70 sobreexpresiones indican un mal pronóstico y predecir una mala respuesta a la quimioterapia. Hsp60 parece ser un mediador inflamatorio endógeno clave y es de suponer que liberada por las células dañadas. Por otra parte, junto con HSP70, Hsp60 tiene un papel en la presentación de antígenos en enfermedades malignas [26]. HSPs también se sobreexpresa en cáncer de mama, colorrectal, gástrico, y carcinomas de próstata [10, 25]. Por lo tanto, la sobreexpresión de HSP27, 70, y 60 puede ser biomarcadores útiles para la carcinogénesis en GCA y puede ser asociada con el grado de diferenciación y el pronóstico de GCA.
Entre las proteínas identificadas, dos proteínas están implicadas en la regulación de la transcripción y expresión de genes asociados a tumores. PCBP1, hasta reguladas en la ACG, es un ARN chaperón regulador post-transcripcional. Se ha demostrado que PCBP1, junto con PTB-1 y hnRNPK, controla algunos genes proto-oncogén y la expresión de genes relacionados con la apoptosis, tales como Bag-1, c-myc
, Apaf-1, XIAP, y DAP5, a través de la estimulación de la actividad de segmento de entrada de ribosoma interno (IRES). PCBP1 se requiere para abrir el ARN en la región que contiene la ventana de entrada al ribosoma, mientras que PTB-1 puede ser requerida para el reclutamiento ribosoma [27, 28]. Recientemente, Pickering, B. M. et al. describen que las partes de glicano de PCBP1 podrían estar relacionados con la capacidad metastásica y pueden desempeñar un papel en la metástasis del carcinoma hepatocelular [27]. A continuación, la sobre regulación de PCBP1 puede regular el mecanismo de la tapa independiente de iniciación de la traducción de los genes asociados a tumores cardíacos en el desarrollo de la ACG. Como un supresor tumoral, alfa-enolasa puede regular la actividad del promotor de c-myc en forma de una proteína de unión de c-myc (MBP-1). MBP-1 a continuación, se puede unir al elemento de P2 en el promotor de c-myc y competir con la proteína de unión a caja TATA (TBP) para suprimir la transcripción de c-myc [29, 30]. Por otro lado, la baja regulación de alfa-enolasa está de acuerdo con el trabajo de Chang YS et al.

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