Proteomanalyse menschlichen Kardia Adenokarzinom durch Laser Capture microdissection

Proteomanalyse menschlichen Kardia Adenokarzinom durch Laser-Mikrodissektion
Zusammenfassung
Hintergrund
Die Inzidenz von Magen-Herz-Adenokarzinom (GCA) hat in den vergangenen zwei Jahrzehnten zugenommen in China, aber die molekularen Veränderungen an der Karzinogenese im Zusammenhang nicht gut charakterisiert.
Methoden in dieser Studie
verwendeten wir einen vergleichenden Proteomanalyse die malignen und nicht-malignen Kardia Epithelzellen durch navigiert Laser Mikrodissektion isoliert zu analysieren ( LCM) aus gepaart chirurgischen Proben von menschlichen GCA.
Ergebnisse | Siebenundzwanzig-Spots bis 23 Proteinen entsprechen durchweg wurden unterschiedlich reguliert. Fünfzehn Proteine ​​wurden hochreguliert gezeigt werden, während acht Proteine ​​herunterreguliert zu sein gezeigt sind, wurden in malignen Zellen im Vergleich zu nicht-malignen säulen Epithelzellen. Die identifizierten Proteine ​​erschienen in den Stoffwechsel, Chaperon, Antioxidation, Signaltransduktion, Apoptose, Zellproliferation und -differenzierung beteiligt sind. Darüber hinaus Ausdrücke von HSP27, 60 und PRX-2 in GCA Proben wurden weiter bestätigt durch immunhistochemischen und Western-Blot-Analysen.
Fazit
eine wirksame Strategie Diese Daten zeigen, dass die Kombination aus navigiert LCM mit 2-DE bietet für die Entdeckung der Proteine, die in GCA unterschiedlich exprimiert werden. Solche Proteine ​​bei der Aufklärung der molekularen Mechanismen der GCA Karzinogenese beitragen. Darüber hinaus bietet die Kombination potenzielle klinische Biomarker, die Hilfe bei der Früherkennung und potentielle therapeutische Targets bieten.
Hintergrund
Verschiedene Analysen der Krebsinzidenz Daten aus westlichen Ländern gekeult haben ergeben, schnell Raten des Adenokarzinoms der Speiseröhre und Magen-Cardia steigt in in den letzten Jahrzehnten im Vergleich zu den stabilen und sinkende Preise für Plattenepithelkarzinomen des Ösophagus (SCC) und distale Adenokarzinom des Magens (DGA) [1-3]. Dieses Phänomen zeigt sich auch in China, mit der Ausnahme, dass die zunehmende Häufigkeit von Kardia Adenokarzinom (GCA) erscheint deutlich höher als die Häufigkeit von Speiseröhrenkrebs. Es gibt Hinweise darauf, dass GCA ist eine deutliche klinische Einheit als seine Pathogenese und Risikofaktoren von DGA ganz unterschiedlich sind. Daher GCA ist weit verbreitet, mit einer höheren Inzidenz von Lymphknotenmetastasen und eine schlechtere Prognose als DGA [4]. Die jährliche Inzidenz von GCA ist 50 /100.000 und kann sogar so hoch wie 190 /100.000 in mehreren Regionen von China [5] sein. Die relativ asymptomatischen Natur in den frühen Stadien der Krankheit und dem Mangel an geeigneten Screening-Tests wurden in einer Mehrheit von GCA Patienten führte zu einem bereits fortgeschrittenen Stadium der Erkrankung diagnostiziert werden. Somit ist es notwendig, den molekularen Mechanismus der Karzinogenese zu verstehen und die Biomarker für die frühe Diagnose und effektive Behandlung des menschlichen GCA zu identifizieren.
Vor kurzem hat die Proteom als Komplement-Komponente des Genoms entstanden. Die Vermutung ist, dass es drastisch in der Entschlüsselung der biochemischen und physiologischen Mechanismen der komplexen multivariaten Erkrankungen bei der funktionalen molekularen Ebene helfen könnte. Obwohl genetische Mutation und /oder verirrten Genexpression einer Erkrankung zugrunde liegen können, die biochemischen Grundlagen für die meisten Krankheiten werden durch Protein Defekte verursacht werden. Daher ist eine Analyse der globalen Proteinmenge in menschlichen Tumoren, Krebs Proteomics genannt, könnten viele Chancen und Herausforderungen bieten bei der Identifizierung neuer Tumormarker und therapeutische Targets sowie in Tumor Pathogenese zu verstehen. Derzeit zweidimensionale Gelelektrophorese (2-DE) und Massenspektrometrie (MS) sind die am häufigsten verwendeten Werkzeuge zum Trennen und Identifizieren von Proteinen. Allerdings Heterogenität ist immer ein Problem in den Studien von menschlichem Tumorgewebe. Obwohl Zellkultur Ein Ansatz ist es, dieses Problem zu überwinden, könnte es nicht genau die molekularen Ereignisse repräsentieren Stelle im tatsächlichen Gewebe nehmen, aus denen sie abgeleitet wurden, [6]. Ein Vergleich zwischen den humanen Prostatazelllinien und Tumorzellen aus den gleichen Patienten zeigte, dass 20% der Proteinprofile verändert wurden [7]. Laser Mikrodissektion (LCM) ist eine neuere Entwicklung, die verwendet werden können, sehr repräsentativ Subpopulation von Zellen, die aus komplexen heterogenen Gewebeproben zu beschaffen [8]. Diese Technologie wurde in einer vielfältigen Reihe von Studien unter Verwendung von Downstream-Analyse auf DNA und RNA-Ebene, einschließlich der globalen Genexpressionsprofilierung [9] und Analysen des Proteoms der Prostata [7], Kolon [10], hepatozellulären sehr erfolgreich eingesetzt [11 ], Brust [12] und Pankreastumoren [13]. Allerdings hat sich die Kombination von 2-DE und MS nie auf die Untersuchung der menschlichen GCA angewendet.
Ziel dieser Studie ist die Karzinogenese von GCA zu umreißen und GCA-spezifische krankheitsassoziierter Proteine ​​als potenzielle klinische Biomarker für die Früherkennung zu identifizieren und neue therapeutische Ziele. Wir führten navigierten LCM zu bereichern sowohl die malignen und nicht-malignen Magen-Herz Epithelien Zellen aus gepaart chirurgischen Proben von menschlichen GCA. Die Proteine ​​aus diesen Zellen extrahiert wurden durch 2-DE aufgetrennt. Differential Proteinspots wurden durch Peptidmassenfingerprint (PMF), basierend auf Matrix-unterstützte Laser-Desorption /Ionisation Time-of-flight Massenspektrometrie (MALDI-TOF MS) und Datenbanksuche identifiziert. Die Gültigkeit dieser Befunde von immunhistochemischen und Western-Blot bestätigt wurde analysiert.
Methoden
Material
IPG-Streifen (pH 3-10 nicht-linearen) und IPG-Pufferlösungen (pH 3-10 nicht-lineare) von Amersham gekauft wurden, Pharmacia Biotech (APB, Schweden). DTT, Harnstoff, Thioharnstoff, Tris-Base, TX-100, CHAPS, Glycin, Acrylamid, Methylenbisacrylamid, SDS, TEMED, Ammoniumpersulfat, Silbernitrat, Trypsin (sequencing grade), ACN und TFA wurden von Sigma (St. Louis gekauft, MO, USA). Schließlich war die vollständige Protease-Inhibitor-Cocktail von Roche (Lewes, UK). Milli-Q-Wasser wurde für alle Lösungen eingesetzt. GCA Proben
Neun Paare von menschlichen Kardia Adenokarzinom und ihren benachbarten nontumourous Cardia Gewebe
wurden bei der zweiten verbundenen Krankenhaus von Xi nach einer chirurgischen Resektion innerhalb von 30 Minuten erhalten ' ein Jiaotong University im Jahr 2005 (Tabelle 1). Um offensichtliche Bereiche von Geschwüren oder Nekrose zu vermeiden, wurden die Proben von den Rändern der Tumoren beschafft. Sie wurden sofort in flüssigem Stickstoff eingefroren und bei -80 ° C bis zur Verwendung gelagert. Informierte Einwilligung wurden von allen Patienten erhalten. Inzwischen ausgewertet zwei erfahrene Pathologen die Tumorgrading durch eine mikroskopische Untersuchung der samples.Table 1 Klinische und histologische Daten von Patiententumorproben
Case

Age

Gender

Locationa)

Size(cm)

Grade

1
58
M
Within 2 cm von GEJ
1,5 × 2
Mäßig differenziert 2
63
M
Innerhalb von 2 cm von GEJ
5 × 6
Mäßig differenziert
3
46
M
Innerhalb von 2 cm von GEJ
4 × 5
Mäßig
4 60
M
Innerhalb von 2 cm von GEJ
differenziert 2 × 2,5
gut differenziert
5
73
M
Innerhalb von 2 cm von GEJ
3 × 1 | ausdifferenziert
6 70
M
Innerhalb von 2 cm von GEJ
2 × 1 | ausdifferenziert
7
55
M
Innerhalb von 2 cm von GEJ
2 × 3
Poorly differenzierte
8 51
M
Innerhalb von 2 cm von GEJ
4 × 6
Wenig differenziertes
9
63
M
Innerhalb von 2 cm von GEJ
3 × 2.5
Wenig differenziertes
a) Ort: Epizentrum des Tumorgewebes
für LCM
Abschnitte Probenvorbereitung (8 &mgr; m dick) wurden auf Objektträger geschnitten (Vorreinigung mit Waschmittel, mit VE-Wasser gewaschen und in Ethanol) mit einem Leica CM 1900 Kryostaten (Kammertemperatur -28 ° C eingetaucht). Die Schnitte wurden entweder bei -80 ° C oder gehalten in der Kryostatkammer vor LCM gespeichert. Hämatoxylin-Färbung wurde nur zur Überwachung von Gewebeschnitten durchgeführt und wurde in Verbindung mit LCM nicht verwendet. Die Schnitte wurden fixiert (70% Ethanol für 1 min), Hämatoxylin gefärbt und getrocknet (70% Ethanol für 45 s, 95% Ethanol für 45 Sekunden, 2 × 100% Ethanol für 30, und durch Xylol 2 × 5 min) gefolgt. Inzwischen wurden ungefärbte Abschnitte für LCM verwendet. Sie wurden fixiert (70% Ethanol für 30 s), in deionisiertem Wasser für 10 s gewaschen und getrocknet (70% Ethanol für 15 Sekunden, 95% Ethanol für 15 s, 2 × 100% Ethanol für 15 Sekunden, gefolgt von Xylol 2 × 1 min ). Komplette Protease-Inhibitor-Cocktail-Tabletten wurden
LCM Navigierte
Nach der Fixierung und Dehydrierung, ungefärbten Schnitte wurden luftgetrocknet und microdissected mit dem Arcturus PixCellα System (Arcturus, Mountain View, CA, USA). LCM Mikroskop eine Hämatoxylin gefärbt Abschnitt benachbart zu dem einen von Interesse abgebildet. Dieses Bild wurde auf dem LCM Computerbildschirm unter Verwendung von LCM Bildanalysesoftware (Arcturus, USA) und wurde als eine Karte verwendet, um den Bereich für die Präparation auf einem benachbarten ungefärbten Abschnitt begrenzen. Die Schnitte wurden dann 15 &mgr; m Durchmesser Laserstrahl erfasst typischerweise bei 50 bis 80 mV Leistung mit Impulsdauer von 3-10 ms in Maschinengewehr-Modus und mit einem Laserschussfrequenz von 1 Schuss pro 500 ms. Im Durchschnitt zwischen 10.000-12.000 Schüsse pro Kappe genommen, und etwa 25.000-30.000 Zellen wurden pro Kappe erhalten. Jede Kappe wurde innerhalb einer Stunde eingefangen. Basierend auf einer sorgfältigen Überprüfung der histologischen Schnitten wurde jede Präparation geschätzt ≥ 95% der gewünschten Zellen zu enthalten.
Mikrodissektion Kappen in 0,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen eingesetzt wurden, die 50 &mgr; l eines Lysepuffers (7 M Harnstoff, 2 M Thioharnstoff, 4% w /v CHAPS, 65 mM DTT, 0,5% v /VTX-100, 40 mM Tris-Base und vollständiger Protease-Inhibitor-Cocktail). Dann wurden die Zellen durch Inversion von Rohren, gefolgt von Vortexmischen für 1 min und kurzen Puls Zentrifugation bei 12 000 × g solubilisiert. Danach Gewebe aus mehreren Kappen (etwa 800.000 ~ 1.000.000 Zellen) wurden in die gleiche Lysepuffer extrahiert, bis genügend Material gesammelt worden waren. Die Proben wurden bei 4 ° C bei 40.000 × g für 1 Stunde zentrifugiert. Erforderlichenfalls Überstände wurden bei -80 ° C bis zur weiteren Verwendung gelagert. Die Proteinkonzentration wurde durch das Bradford-Verfahren bestimmt.
2-DE
das erste dreidimensionale isoelektrische Fokussierung (IEF) wurde durchgeführt auf Pharmacia Immobiline IPG DryStrip System (Uppsala, Schweden). Für die erste Dimension der Elektrophorese wurden die Proben, die 60 ug Protein für die Analyse wurden die Gele mit einer Rehydratationslösung (7 M Harnstoff, 2% w /v CHAPS, 50 mM DTT, 0,5% v /v IPG-Puffer (pH-Wert auf 250 uL verdünnt, 3-10 nicht-linearen) und Spuren Bromphenolblau), bevor sie auf 13 cm IPG-Streifen laden (pH3-10 nichtlinearen). IEF wurde durchgeführt, dann nach IPGphor Elektrophorese-Einheit mit den Anweisungen des Herstellers. Danach wurden die Streifen mit einer Lösung äquilibriert (6 M Harnstoff, 30% v /v Glycerol, 2% w /v SDS und 50 mM Tris-HCl, pH 8,8) reduziert und mit 1% w /v DTT für 15 min und alkyliert mit 2,5% w /v Jodacetamid für 15 min. Streifen wurden dann in Elektrophorese-Puffer (25 mM Tris-Base, 192 mM Glycin und 0,1% w /v SDS) gespült, aufgetragen auf 11% Acrylamidgelen und versiegelt mit geschmolzener Agarose (0,5% w /v Agarose in Elektrophorese-Puffer, enthaltend ein Spur von Bromphenolblau). SDS-PAGE wurde unter Verwendung von vertikalen Kammern Hoefer SE 600 durchgeführt und ein Tris-Glycin-Puffer (25 mM Tris und 192 mM Glycin), enthaltend 0,1% w /v SDS, mit Anfangstrennung bei einer konstanten 10 mA /Gel für 30 min, gefolgt von 20 mA /Gel. Die zweite dreidimensionale SDS-PAGE entwickelt, bis der Bromphenolblau-Farbstoffmarker den Boden des Gels erreicht hatte. Die Gesamtlaufzeit betrug der Regel 4 bis 4,5 Stunden. Die Gele wurden in 10% v /v Essigsäure, 40% v /v Ethanol vor der Sensibilisierung für 30 min in einem Puffer, enthaltend 30% v /v Ethanol, 0,2% w /v Natriumthiosulfat und 0,83 M Natriumacetat fixiert. Dies wurde durch drei 15 min Waschen in demineralisiertem Wasser. Die Proteine ​​wurden dann für 20 min mit 0,1% w /v Silbernitrat gefärbt, zweimal in deionisiertem Wasser für 1 min gewaschen und in 2,5% w /v Natriumcarbonat, enthaltend 0,04% v /v Formaldehyd (37% ige Lösung) entwickelt. Die Entwicklung wurde mit 1% v /v Essigsäure gestoppt und die Gele wurden dreimal in Wasser.
Bildanalyse und statistische Analyse
Umax ImageScanner (Amersham Biosciences) wurde gewaschen verwendet, um die Gele zu scannen, während Image Master ™ 2D Platinum Version 5.0 Software (Amersham Biosciences) wurde für Spot-Erkennung, Quantifizierung und Anpassung verwendet. Die Intensität jedes Spots durch% Volumen quantifiziert. Die Daten wurden dann 11,5 und Excel mit SPSS für Windows analysiert. Student t
-Test verwendet wurde, um die Unterschiede in der Proteinniveaus zwischen GCA und Nicht-Tumorproben, mit einem Konfidenzniveau von 95% zu analysieren.
MALDI-TOF-MS und Datenbankstellensuche Konsequent und signifikant unterschiedlich spots zur Analyse durch MALDI-TOF MS ausgewählt. Protein-Spots von Interesse wurden in kleine Stücke von Entfärbung und Waschen mit VE-Wasser mehrmals gefolgt ausgeschnitten und fein zerkleinert, bis die gelbe Farbe verschwand. Gelstücke wurden dann mit 25 mM Ammoniumbicarbonat, dehydriert mit ACN gespült und in einer Vakuumzentrifuge getrocknet. Danach Proteine ​​im Gel wurden über Nacht bei 37 ° C mit 0,02 ug /ul Trypsin verdaut. Tryptischen Peptide wurden dann in einer Lösung, enthaltend 50% v /v ACN und 0,2% v /v TFA wieder gelöst. A 2 uL Aliquot wurde mit 4 &mgr; L der Matrix-Lösung CHCA (a-cyano-4-hydroxcinnamic Säure, 10 mg /ml in 50% v /v ACN, 0,2% v /v TFA) auf eine Probenplatte getupft und an der Luft erlaubt trocken. Die getrockneten Flecken wurden dann in einem Voyager DE MALDI-TOF MS (Framingham, MA, USA) analysiert. Anschließend wurde das Spektrometer in einem positiven Ionenmodus läuft und im Reflektormodus mit den folgenden Einstellungen: Beschleunigungsspannung 20 KV; gride Spannung, 94%; Führungsdrahtspannung, 0,01%; und eine Verzögerung von 200 ns. Die Spektren wurden bei 3200 eingestellt pro Spektrum mit 80 Aufnahmen manuell mit der Laserintensität erfasst. Dann wurde die Massenbereich zwischen m
/z
500 und m
/z eingestellt
5000. Interne Kalibrierung angewendet wurde unter Verwendung von Angiotensin II und Insulin-B-Kette Peaks bei 912,08 Da und 3495,95 Da sind.
die Proteine ​​wurden durch Peptid-Massenfingerprinting mit dem Suchprogramm Aldente [14] mit den folgenden Suchparameter angewendet identifiziert: SWISS-PROT und TrEMBL wurden als die Proteinsequenz-Datenbanken verwendet werden; eine Massentoleranz von 100 ppm und einer unvollständigen Spaltung durften; Carboxyamidomethylierung, oxidiertem Methionin, und die Phosphorylierung wurden als mögliche Modifikationen betrachtet; die minimale Anzahl von Matched-Peptide wurde 4; und das Peptid-Ionen war [M + H] +.
immunhistochemischen und Western-Blot-Analyse
Um die Expressionsmuster von drei Proteine ​​in GCA Gewebe zu validieren, Immunhistochemie wurde unter Verwendung von Formalin-fixierten und in Paraffin eingebetteten Gewebe Proben, die mit 2-DE-Proben abgeglichen wurden. Entwachst 5 um dicke Schnitte wurden für 3 min mit einer 0,3% Wasserstoffperoxidase behandelt und mit einer blockierenden Antikörper für 30 min. Nach der Wärme vermittelten Antigen-Retrieval wurden die Schnitte über Nacht bei 4 ° C mit dem primären Antikörper inkubiert, wie folgt: HSP27 (Sigma, St. Louis, MO, USA), 1: 500; HSP60 (Santa Cruz, Amerika), 1: 300; und PRX-2 (Santa Cruz, Amerika), 1: 150. Die Schnitte wurden dann mit einem Peroxidase-markierten Antikörper inkubiert (1: 500)., Mit diaminobenzine entwickelt und mit Hämatoxylin gegengefärbt
Für Western-Blot-Analyse Die Proteinproben (30 ug), die in 2-DE wurden auf 12% laufen SDS-PAGE, auf PVDF-Membranen übertragen und dann mit PBS /5% Magermilch /0,01% Tween für 2-4 Stunden bei Raumtemperatur blockiert. Primäre Antikörper wurde in Blockierungspuffer verdünnt und wurde wie folgt hinzugefügt: HSP27, 1: 200; HSP60, 1: 300; und Prx-2, 1: 200. Danach wurde mit Meerrettich-Peroxidase (HRP) -konjugiertem sekundärem Antikörper inkubiert und ein HRP-konjugiertem anti-GAPDH /β-Actin-Antikörper gleiche Proteinbeladung für 1-2 Stunden bei 37 ° C oder bei Raumtemperatur in jeder Bahn zu bestätigen. Die Proben wurden für 30-60 s mit verstärkter Chemilumineszenz gewaschen und detektiert (Minipore).
Ergebnisse
Profil Unterschiede zwischen navigierten LCM-Proben und ganze unzer Kryostaten Gewebe
die Auswirkungen der navigierten LCM auf die Profile zu bewerten Gewebeprotein, führten wir 2-DE Proteinprofile von ganzen unzer Kryostaten Gewebe und LCM-Proben von GCA. Figur 1 zeigt ein Beispiel des navigierten LCM-Prozess. Mehrheit der erfaßten Flecken in den sezierten Nicht-Tumor und Tumorgewebe konnten in den gesamten unzer Kryostaten Geweben beobachtet werden, mit Ausnahme von mehreren Stellen. Allerdings gibt es noch einige Punkte in der gesamten unzer Kryostaten Gewebe gefunden, die nicht in beiden LCM Proben beobachtet werden konnten. Somit könnte diese Technologie nicht nur bereichern Nicht-Tumor und Tumor Epithelzellen, sondern könnte auch die Verunreinigung in Geweben wie Hämoglobin [10, 11] zu verringern. Darüber hinaus könnte die navigierte LCM Verfahren die Auswirkungen von Flecken auf Proteintrennung von 2-DE [15] zu beseitigen. So unterstützen unsere Daten die Notwendigkeit navigierten LCM in den Proteom-Studien von GCA Gewebe durchzuführen. Abbildung 1 navigierte Laser Mikrodissektion von Tumorgewebe. (A) Hämatoxylin-gefärbten Kardia Adenokarzinom; (B) Unstained GCA Gewebe; (C) Tumorgewebe nach der Mikrodissektion; (D) Erfasste Tumorzellen auf LCM-Film.
Profil Unterschiede in der Proteinexpression zwischen GCA Geweben und umgebenden Nicht-Tumorgewebe
Wir führten eine navigierte LCM und 2-DE für passende Paare von Tumorgewebe und der umgebenden Nicht- Tumorgewebe von GCA Patienten. Etwa 800-1000 Proteinspots wurden durch Silberfärbung nachgewiesen. Zur Messung der Reproduzierbarkeit, unterzog sich jede Probe das Experiment dreimal. Es waren 905 ± 74 und 867 ± 51 Proteinspots in der Karte von GCA und Nicht-Tumor-Magen-Herzgewebe sind. Die angepaßten Flecken waren 799 ± 29 und 727 ± 34 getrennt, und die jeweiligen Durchschnittsanpassungsrate betrug 88,2% und 83,8%. Zusätzlich war die durchschnittliche Positionsabweichung von angepaßten spots 1,031 ± 0,205 mm und 1,44 ± 0,11 mm in der IEF und SDS-PAGE Richtung. Obwohl die Bildanalyse zeigte, dass diese 2-DE Karten reproduzierbar waren, gab es geringe Unterschiede in der Intensität und der Anzahl der Punkte. Dennoch ergab eine Analyse der Gele 27 Proteinspots, deren Intensitäten variiert erheblich und konsistent zwischen Nicht-Tumor und Tumorgeweben (Abb. 2). Die Verhältnisse der normalisierten Punktintensitäten von Krebs paraneoplasis Gewebe für jede der interessierenden Proteine ​​wurden berechnet. Spots zeigt eine zweifache Differenz und mit statistischer Signifikanz (p < 0,05), wurden ausgewählt. Drei der 2-DE Ergebnisse wurden durch immunhistochemische und Western-Blot-Analysen bestätigt. 2 2-DE Karte von malignen und nicht-malignen Kardia Gewebe. Alle Karten dargestellt werden aus dem gleichen Patienten vorbereitet. (A) 2-DE Karte ganzer unzer Kryostaten Gewebe; (B) 2-DE Karte von Nicht-Tumorgewebe nach LCM; (C) 2-DE Karte von GCA Gewebe nach LCM.
Protein Identifizierung
sowohl ganze unzer Kryostaten Proben und LCM-Proben wurden zur Proteinidentifizierung verwendet. Siebenundzwanzig verschiedene Proteinspots zwischen GCA Geweben und nicht-Tumor umgebenden Gewebe wurden herausgeschnitten. Jedoch nur 23 Proteine ​​wurden durch MALDI-TOF-MS (Tabelle 2) identifiziert. Dieses Phänomen ist wahrscheinlich auf post-translationale Modifikationen wie peroxiredoxin 1 (PRX-1), die in zwei benachbarten Punkten vorhanden war (Abb. 2, Spot 11). Diese Proteine ​​wurden klassifiziert in einer der folgenden Eigenschaften: Zellproliferation und Differenzierung (ANXA2, ANXA4, hnRNPA2 /B1), Apoptose (PRX-1, PRX-2, GSTP, VDAC, ETFB), Stoffwechsel (ADH1C, AKR1C3, CA2, GATM ), Protease bezogen (CTSD, PACSIN1), cystoskeleton (Actin 1, Keratin 8), Chaperone (HSP27, 60, 70, PDIA3) und RNA binden und die Transkription (hnRNPH3, PCBP1, ENO1). Abbildung 3 zeigt die PMF Karten von HSP60.Table 2 Proteine ​​mit unterschiedlichen Expression zwischen GCA Tumorgewebe und angrenzenden gepaart Nicht-Tumorgewebe durch MALDI-TOF MS
Up-Regulierung Proteine ​​
Spot-Nr
Protein
Accession No.A) Herr /PIB
)
Spiel Cov
(%) c)
T-Test
Ration (Tumor /nicht-Tumor) Mittel ± SD
1 Hitzeschock-Protein beta-1 (HSP27) *
P04792
23 /6,0
9
54
0,0040
3,4279 ± 2,0727
2 Hitzeschock 70 kDa Protein 5 (HSP70)
P11021
70 /5.0
42 22
0,0030
3,2597 ± 1,5314
3
60 kDa Hitzeschockprotein (HSP60) *
P10809
58 /5.2
12
37
0,0001
2,8308 ± 1,1426
4 Proteindisulfidisomerase A3 (PDIA3) *
P30101
54 /5.6
13
41
0,0280 4,2105
± 2,7294
5
Annexin A4 (ANXA4)
P09525
36 /5.8 10
34
0,0140
4,7153 ± 7,3434
6 Annexin A2 (ANXA2)
P07335
38 /7.5
7
26
0,0150
6,0722 ± 5,5431
7
Heterogene Kern Ribonukleoproteine ​​A2 /B1 (hnRNP A2 /B1 ) *
P22626
37 /9.0
16
43
0,0050
10,7775 ± 9,5547
8 Cathepsin D schweren Kette (CTSD)
P07339
27 /5.6 12

61
0,0012
4,3552 ± 3,7703
9
Proteinkinase C und Casein-Kinase-Substrat in Neuronen protein 1 (PACSIN1)
Q9BY11
51 /5.1
5
24
0,0028
2,6026 ± 1,2147 10
Glutathion-S-Transferase P (GSTP) *
P09211
23 /5.4
5
44
0,0026
3,8757 ± 2,2198
11
Peroxiredoxin-1 (PRX-1) *
Q06830
22 /8.3
8 59
0,0140
4,2744 ± 4,1568
12
Poly (rC) -Bindung protein1 (PCBP1) *
Q15360
37 /6.7
12
63
0,0070
2,7401 ± 0,5321
13
Aldo-Keto-Reduktase-Familie 1member C3 (AKR1C3)
P42330
37 /8,1
7
25
0,0040
2,7762 ± 1,1820
14
Glycineamidinotransferase (GATM)
P50440
44 /6,4
8 23
0,0390
2,7839 ± 0,4680
15
Keratin, Typ II Zytoskelett-8 (Keratin 8) *
P05787
54 /5.5
9
25
0,0020
3,5063 ± 0,6423
Herunterregulierung Proteine ​​
16
Actin cytoplasmatische 1 (Actin 1) *
P60709
42 /5.3
6 30
0,0160
0,2603 ± 0,1539
17
Heterogene Kern Ribonukleoproteine ​​H3 (hnRNPH3)
P31942
37 /6.4
5
28
0,0015
0,6028 ± 0,6229
18
Peroxiredoxin-2 (PRX-2) *
P32119
22 /5.7
6 24
0,0250
0,2376 ± 0,1202
19
Kohlensäurebad anhydrase2 (CA2) *
P00918
29 /6.8
6
33
0,0130
0,3675 ± 0,1270
20
Alpha-Enolase * (ENO1)
P06733
47 /7.0
16
42
0,0030
0,2898 ± 0,1340
21
Alkoholdehydrogenase 1C (ADH1C)
P00326
40 /8.6
7
49
0,0280
0,2287 ± 0,1680
22
Elektronentransfer-Flavoprotein-Untereinheit b (ETFB)
P38117
28 /8.3
6 26
0,0240
0,2655 ± 0,1415
23
Spannungsabhängige abhängige~~POS=HEADCOMP Anion -selektive (VDAC) *
P21796
31 /8.6
7
39
0,0120
0,4474 ± ​​0,0297
a) Swiss-Prot Accession Nr.
b )
c) Sequenzabdeckung%
Theoretischer Wert * Die Proteine ​​wurden zuvor bei Magenkrebs gefunden.
3 MALDI-TOF MS-Identifizierung von Fleck 3 in GCA Figur.
immunhistochemischen und Western-Blot-Analyse für 27 HSP, 60 und Prx-2 in GCA
weitere um zu untersuchen, ob HSP27, 60 und Prx-2 in Geweben exprimiert und zu bestimmen, welche Zellen exprimieren diese Proteine ​​wurde immunhistochemische Analyse durchgeführt unter Verwendung von Formalin-fixierten und Paraffin- eingebetteten Gewebeproben, die mit 2-DE-Proben abgeglichen wurden. Die Expression von HSP27 und 60 konnte in allen cytoplasms von Karzinomzellen gesehen werden, während sie in einigen der cytoplasms von Zylinderepithelzellen (Fig. 4A-D) in Nicht-Tumorgeweben zu sehen war. in die Karzinomzellen exprimiert werden, sondern in einigen der cytoplasms von säulen Epithelzellen (Fig. 4E, F) Im Gegensatz dazu wurde Prx-2 fast nicht gefunden. Um diese Proteinexpressionsniveaus, Western-Blot-Analyse untersucht wurde durchgeführt, auch die gleichen Gewebe (Abb. 5). Wie erwartet, HSP27 und 60 wurden gefunden konsequent zu stark in Tumorgewebe exprimiert, während PRX-2 unterdrückt wurde. Abbildung 4 Immunhistochemische Analyse für HSP27, 60 und PRX-2 in humanen normalen Kardia und GCA. Ausdrücke von HSP27 (A), 60 (C) und Prx-2 (E) wurden in das Zytoplasma der Tumorzellen; Ausdrücke von HSP27 (B), 60 (D) und Prx-2 (F) wurden in Zytoplasma von normalen säulen Epithelzellen gefunden; Vergrößerungen: A-F × 40, mit Hämatoxylin gegengefärbt
5 Western-Blot-Analyse Abbildung für die erhöhte Expression von HSP27 Validierung, 60 und verminderte Expression von PRX-2 in GCA Geweben.. . GAPDH und β-Aktin als Referenzen verwendet wurden
Diskussion
Cardia ist die anatomische Grenzbereich zwischen der Speiseröhre und des Magens; Daher gibt es ständige Kontroverse über ihre Beziehung in Bezug auf die Epidemiologie, klinische Merkmale und Klassifizierung unter Adenokarzinom des Ösophagus (EA), GCA und DGA. Um ihre Proteinprofile vergleichen zu können, suchten wir die Literatur, diese Proteine ​​zu finden. Dreizehn von 23-Proteine ​​wurden in DGA vorher (Tabelle 2). Unter ihnen HSP27, 60, 70, PDIA3 und CA2 den gleichen Expressionsmuster in GCA und DGA. Im Gegensatz dazu wurde von EA ein Low-Level-Expression von HSP27 [16-20]. Daher ist die Tumorigenese von GCA verschieden von EA und DGA und somit sollte GCA eine deutliche pathologischen Einheit sein.
Zellulärer Heterogenität eine signifikante Barriere für die molekulare Analyse von normalen und erkrankten Geweben wurde. Zuerst von Emmert-Buck et al. im Jahr 1996, ist die Laser Mikrodissektion eine leistungsstarke und präzise Technik verwendet, um Proteinveränderungen in einer bestimmten Untergruppe von Zellen in einem wartungsarmen System untersuchen, die für den Betrieb ist einfach [8]. Wie üblich, werden verschiedene histochemische Flecken des Gewebeschnittes verwendet, um die Dissektion Prozess zu führen. Allerdings haben einige Fälle von 2-DE [21, 22] mäßige bis dramatische Effekte von Flecken auf Proteintrennung gezeigt. Zur Färbung als potenzielle negative Auswirkungen zu beseitigen, navigierten LCM wurde vor kurzem entwickelt. Es verwendet einen gefärbten Abschnitt wird die Präparation der ungefärbten benachbarten Probe zu führen [23]. Diese Technik wurde erfolgreich bei der Untersuchung von Gehirnproben [15] angewendet. Darüber hinaus aufgrund der typischen morphologischen Eigenschaften des Magenherz oberflächlichen säulen Zelle und der Herzdrüse, sind sie leicht auf einem dehydratisierten Abschnitt ohne Färbung zu identifizieren. Daher wurde navigiert LCM eine optische Strategie in unserem Proteomics Ansatz. In dieser Forschung, variiert die Zahl der LCM-abgeleitete nicht-maligne und maligne Zellen wesentlich und wurden oft klein im Vergleich zu den gesamten unzer Kryostaten Geweben, ungeachtet der Profile, die zwischen den LCM-Proben und die unzer diejenigen sehr ähnlich waren. Dies zeigte, dass die navigierte LCM ein gangbarer Ansatz für die Untersuchung von Magenherzgewebe sein kann, und daß es kompatibel mit 2-DE und MALDI-TOF MS. Kaufen Wir erhalten das Proteinprofil von GCA durch die Veränderungen in dem Protein zu vergleichen Profile von nicht-Tumorgewebe umgibt. Um individuelle Unterschiede zu verringern, wurden Gewebeproben aus dem gleichen Patienten erhalten, so dass wir Differential-Protein-Expression unter ähnlichen genomischen Hintergrund zu studieren. Nach bestem Wissen und Gewissen, berichteten wir über die Proteomanalyse von GCA. Von den 27 ausgewählten Proteinspots, 23 Proteine ​​im Molekularmassenbereich von 15 bis 75 kDa und einem isoelektrischen Punkt zwischen 3 und 10 wurden durch 2-DE und MALDI-TOF MS identifiziert. Die meisten dieser Proteine ​​wurden zuvor beschrieben als differentiell entweder auf mRNA-Ebene oder auf der Proteinebene in anderen Arten von Krebs beim Menschen exprimiert wird.
HSPs sind eine Gruppe von Stressproteinen von verschiedenen Arten von ökologischen und pathophysiologischen beleidigungen induziert. In dieser Studie co-up-Verordnungen von HSP27, 70 und 60 wurden in den Magen-Herz Tumorgeweben gefunden. Als Chaperone HSP27 und HSP70 konnte die Apoptose hemmen mit apoptosome und Caspase Aktivierung Komplex [24] durch die Interaktion, deren Rollen in der Tumorprogression und Resistenz gegen die Behandlung zugrundeliegende [25]. Zahlreiche Studien zeigen, dass HSP27 und HSP70 overexpressions eine schlechte Prognose signalisieren und eine schlechte Reaktion auf Chemotherapie vorhersagen. HSP60 scheint eine wichtige endogene Entzündungsmediator zu sein und vermutlich von beschädigten Zellen freigesetzt wird. Darüber hinaus zusammen mit HSP70, HSP60 hat eine Rolle bei der Antigenpräsentation in malignen Erkrankungen [26]. HSPs sind auch in Brust-, Darm-, Magen- und Prostatakarzinomen [10, 25] überexprimiert. Daher Überexpression von HSP27, 70 und 60 können nützliche Biomarker für Karzinogenese in GCA sein und kann mit dem Grad der Differenzierung und der Prognose von GCA zugeordnet werden.
Unter identifizierten Proteine, zwei Proteine, die in der Regulation der Transkription beteiligt sind und Expression von Tumor-assoziierten Genen. PCBP1, in GCA hochreguliert, ist ein RNA-Chaperon-post-Transkriptionsregulator. Es hat sich PCBP1 nachgewiesen wurde, zusammen mit PTB-1 und hnRNPK, steuert einige Proto-Onkogen-Gene und die Apoptose-verwandte Gene Expression, wie Bag-1, c-
myc, Apaf-1, XIAP und DAP5, durch die Aktivität der internen Ribosomen-Eintritts Segment Stimulierung (IRES). PCBP1 erforderlich, um die RNA in der Region zu öffnen, das Ribosom Eingabefenster enthält, während PTB-1 kann für Ribosomen-Rekrutierung [27, 28] erforderlich. Kürzlich, Pickering, B. M. et al. beschrieben, dass zu Metastasierungsfähigkeit der Glykan Teile PCBP1 in Zusammenhang stehen könnten und möglicherweise eine Rolle bei hepatozellulärem Karzinom Metastasen [27] spielen. Dann wird die Hochregulierung von PCBP1 kann die cap-unabhängigen Mechanismus der Translationsinitiation des Herztumorassoziierte Gene bei der Entwicklung von GCA regulieren. Als Tumorsuppressor, kann Alpha-Enolase die c-myc-Promotor-Aktivität in Form eines c-myc-Bindungsprotein (MBP-1) zu regulieren. MBP-1 kann dann binden an die P2-Element in der c-myc-Promotors und konkurrieren mit der TATA-Box-Bindungsprotein (TBP) die Transkription von c-myc zu unterdrücken [29, 30]. Auf der anderen Seite, Herabregulierung von Alpha-Enolase ist in Übereinstimmung mit der Arbeit von Chang YS et al.

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