Proteoomanalyse van menselijke maag cardia adenocarcinoom door laser capture microdissectie

Proteoomanalyse van menselijke maag cardia adenocarcinoom door laser capture microdissectie
Abstracte achtergrond
De incidentie van cardiale maag adenocarcinoom (GCA) is toegenomen in de afgelopen twee decennia in China, maar de moleculaire veranderingen in verband met het ontstaan van kanker hebben niet goed gekarakteriseerd.
Methods
In deze studie gebruikten we een vergelijkende proteomics benadering van de kwaadaardige en niet-kwaadaardige maag cardia analyseren epitheelcellen geïsoleerd door genavigeerd laser capture microdissectie (LCM) van gepaarde chirurgische specimens van de menselijke GCA.
Resultaten
Zevenentwintig plekken die overeenkomt met 23 eiwitten werden consequent verschillend geregeld. Vijftien eiwitten gebleken dat ze up-gereguleerd, terwijl acht eiwitten vertoonden een neerwaarts gereguleerd in maligne cellen tegen nonmalignant zuilvormige epitheelcellen. De geïdentificeerde eiwitten bleek betrokken te zijn bij het metabolisme, chaperone, antioxidatie, signaaltransductie, apoptose, celproliferatie en differentiatie. Daarnaast werden uitingen van HSP27, 60 en Prx-2 in monsters GCA bevestigd door immunohistochemische en Western blot analyses.
Conclusie
Deze gegevens geven aan dat de combinatie van genavigeerd LCM met 2-DE een effectieve strategie voor het ontdekken van eiwitten die differentieel uitgedrukt in GCA. Dergelijke eiwitten kunnen bijdragen aan het ophelderen van de moleculaire mechanismen van GCA carcinogenese. Bovendien is de combinatie zorgt voor potentiële klinische biomarkers die helpen bij de vroege opsporing en potentiële therapeutische doelen aan te geven. Achtergrond
Diverse analyses van de incidentie van kanker gegevens geruimd uit westerse landen hebben onthuld snel stijgende prijzen van adenocarcinoom van de slokdarm en de maag cardia in de laatste decennia, in vergelijking met de stabiele en dalende tarieven voor oesofageale plaveiselcelcarcinoom (SCC) en distale adenocarcinoom van de maag (DGA) [1-3]. Dit verschijnsel is ook uit China, behalve dat het meer voorkomen van gastrische cardia adenocarcinoom (GCA) blijkt aanzienlijk hoger dan de incidentie van slokdarmkanker. Aanwijzingen dat GCA een goede klinische entiteit de pathogenese en risicofactoren zijn nogal verschillend van DGA. Daarom GCA veel vaker, met hogere incidentie van lymfeknoop metastase en een slechtere prognose dan DGA [4]. De jaarlijkse incidentie van GCA is 50 /100.000 en kunnen zelfs tot 190 /100.000 in verschillende gebieden van China [5]. De relatief asymptomatische natuur in de vroege stadia van de ziekte en het gebrek aan adequate screening tests hebben geresulteerd in een meerderheid van GCA patiënten worden op een reeds vergevorderd stadium van de ziekte. Derhalve is het noodzakelijk om het moleculaire mechanisme van carcinogenese begrijpen en de biomarkers voor de vroege diagnose en effectieve behandeling van menselijke GCA.
Recent is het proteoom ontwikkeld tot een complement component van het genoom. De veronderstelling is dat het drastisch kan helpen bij het ontrafelen van de biochemische en fysiologische mechanismen van complexe multivariate ziekten aan de functionele moleculaire niveau. Hoewel genetische mutatie en /of dolende genexpressie een ziekte ten grondslag kunnen liggen, worden de biochemische basis voor de meeste ziekten worden veroorzaakt door eiwit gebreken. Daarom kan een analyse van globale eiwitgehalte in humane tumoren, genaamd kanker proteomics, vele mogelijkheden en uitdagingen bieden bij de vaststelling van tumormarkers en therapeutische doelwitten en begrijpen tumor pathogenese. Momenteel, tweedimensionale gelelektroforese (2-DE) en massaspectrometrie (MS) is de meest toegepaste instrumenten voor het scheiden en identificeren van eiwitten. Echter heterogeniteit is altijd een zorg in studies van humaan tumorweefsel. Hoewel celkweek is een benadering van dit probleem op te lossen, is het misschien niet nauwkeurig de moleculaire gebeurtenissen die plaatsvinden in de eigenlijke weefsel waaruit ze werden afgeleid [6]. Een vergelijking tussen menselijke prostaat cellijnen en tumorcellen van dezelfde patiënten toonde aan dat 20% van de eiwitprofielen werden gewijzigd [7]. Laser capture microdissectie (LCM) is een recente ontwikkeling die kan worden gebruikt om zeer representatief subpopulatie van cellen bevoorraden bij complexe heterogene weefselmonsters [8]. Deze technologie is zeer succesvol gebruikt in een uiteenlopende reeks onderzoeken met stroomafwaarts analyse op het DNA en RNA niveau, waaronder wereldwijde genexpressieprofielen [9] en analyse van het proteoom van prostaat [7], colon [10], hepatocellulaire [11 ], borst [12] en pancreas tumoren [13]. Echter, de combinatie van de 2-DE en MS nooit toegepast op de studie van de menselijke GCA.
Dit onderzoek heeft tot doel de carcinogenese van GCA overzicht en GCA-specifieke ziekte-geassocieerde eiwitten te identificeren als potentiële klinische biomarkers voor vroege detectie en nieuwe therapeutische doelwitten. We voerden genavigeerde LCM om zowel de kwaadaardige en niet-kwaadaardige maag cardiale epitheel cellen van gepaarde chirurgische specimens van de menselijke GCA verrijken. De eiwitten geëxtraheerd uit deze cellen werden gescheiden door 2-DE. Differentiële eiwit spots werden geïdentificeerd door peptide mass fingerprint (PMF) gebaseerd op matrix-geassisteerde laserdesorptie /ionisatie time-of-flight massaspectrometrie (MALDI-TOF MS) en zoeken in gegevensbanken. De geldigheid van deze bevindingen werd bevestigd door immunohistochemische en western-blot analyses.
Methods
Materials
IPG strips (pH 3-10-lineaire) en IPG bufferoplossingen (pH 3-10 niet-lineaire) werden aangekocht van Amersham Pharmacia Biotech (APB, Zweden). DTT, ureum, thioureum, Tris base, TX-100, CHAPS, glycine, acrylamide, methyleen-, SDS, TEMED, ammoniumpersulfaat, zilvernitraat, trypsine (sequencing graad), ACN en TFA werden gekocht bij Sigma (St. Louis, MO, USA). Tenslotte de volledige proteaseremmer cocktail was van Roche (Lewes, UK). Milli-Q-kwaliteit water werd gebruikt voor alle oplossingen.
GCA monsters
negen paren van humane gastrische cardia adenocarcinoom en de aangrenzende cardia nontumourous weefsels werden binnen 30 minuten verkregen na een chirurgische resectie van de tweede verbonden ziekenhuis Xi ' een Jiaotong University in 2005 (tabel 1). Om duidelijke gebieden zweer of necrose te voorkomen, werden de monsters verkregen van de randen van de tumoren. Ze werden onmiddellijk ingevroren in vloeibare stikstof en bewaard bij -80 ° C tot gebruik. Geïnformeerde toestemming werd verkregen van alle patiënten. Ondertussen, twee ervaren pathologen evalueerde de tumor indeling door een microscopisch onderzoek van de samples.Table 1 Klinische en histologische gegevens van de patiënt tumormonsters
Case

Age

Gender

Locationa)

Size(cm)

Grade

1
58
M
Within 2 cm van GEJ
1,5 × 2
Matig gedifferentieerd 2
63
M
Binnen 2 cm van GEJ
5 × 6
Matig gedifferentieerd
3
46
M
Binnen 2 cm van GEJ
4 × 5
Matig gedifferentieerd verhuur 4
60
M
Binnen 2 cm van GEJ
2 × 2,5
goed gedifferentieerd
5
73
M
Binnen 2 cm van GEJ
3 × 1
goed gedifferentieerd
6
70
M
Binnen 2 cm van GEJ
2 × 1
goed gedifferentieerd
7
55
M
Binnen 2 cm van GEJ
2 × 3
Slecht gedifferentieerde
8
51
M
Binnen 2 cm van GEJ
4 × 6
slecht gedifferentieerde
9
63
M
Binnen 2 cm van GEJ
3 x 2.5
slecht gedifferentieerde
) Locatie: epicentrum van tumorweefsel
Monstervoorbereiding voor LCM
secties (8 um dik) op dia's (vooraf gereinigd met behulp van een detergent werden gesneden, gewassen met gedeïoniseerd water, en gedompeld in ethanol) met een Leica CM 1900 cryostat (kamer temperatuur -28 ° C). De secties werden hetzij bewaard bij -80 ° C en bewaard in de cryostaatkamer voorafgaand aan LCM. Hematoxyline kleuring werd alleen voor het bewaken van weefselsecties werd uitgevoerd en niet in combinatie met LCM. Secties werden gefixeerd (70% ethanol gedurende 1 minuut), hematoxyline gekleurd en gedehydrateerd (70% ethanol gedurende 45 s, 95% ethanol gedurende 45s, 2 x 100% ethanol gedurende 30 s, gevolgd door xyleen 2 x 5 min). Ondertussen werden ongekleurde gedeelten voor LCM. Zij werden gefixeerd (70% ethanol gedurende 30 s), gewassen in gedeïoniseerd water voor 10s en gedehydrateerd (70% ethanol gedurende 15s, 95% ethanol gedurende 15s, 2 x 100% ethanol gedurende 15s, gevolgd door xyleen 2 x 1 min ). Compleet proteaseremmer cocktail tabletten werden
genavigeerd LCM
Na vaststelling en uitdroging, werden ongekleurde secties lucht gedroogd en gemicrodissecteerde gebruik van het Arcturus PixCellα systeem (Arcturus, Mountain View, CA, USA). LCM microscoop afgebeeld een hematoxyline gekleurde coupe naast dat van belang. Dit beeld werd weergegeven op het computerscherm LCM middels LCM beeldanalysesoftware (Arcturus, USA) en werd gebruikt als een kaart om de regio dissectie begrenzen op een aangrenzend ongekleurd gedeelte. De secties werden vervolgens opgenomen met een 15 um diameter laserbundel kenmerkend bij 50-80 mV vermogen met pulsduur van 3-10 ms machinegeweer modus en met een laser spuitfrequentie 1 schot per 500 ms. Op het gemiddelde, werden tussen 10,000-12,000 opnamen per cap, en ongeveer 25.000-30.000 cellen werden verkregen per cap. Elke cap werd gevangen binnen een uur. Gebaseerd op een zorgvuldige evaluatie van de histologische secties werd elke dissectie schatting ≥ 95% van de gewenste cellen bevat.
Microdissection doppen werden in 0,5 ml microcentrifuge buisjes die 50 pl van een lysisbuffer (7 M ureum, 2 M ingevoegd thioureum, 4% w /v CHAPS, 65 mM DTT, 0,5% v /VTX-100, 40 mM Tris-Base en volledige proteaseremmer cocktail). Daarna werden de cellen gesolubiliseerd door inversie buizen gevolgd door vortex-mengen gedurende 1 min en korte puls-centrifugeren bij 12 000 xg. Daarna weefsel van meerdere kappen (ongeveer 800.000 ~ 1.000.000 cellen) werden geëxtraheerd in dezelfde lysisbuffer totdat voldoende materiaal was verzameld. De monsters werden gecentrifugeerd bij 40.000 x g gedurende 1 uur bij 4 ° C. Indien nodig werden supernatantia opgeslagen bij -80 ° C tot verder gebruik. De eiwitconcentratie werd bepaald met de Bradford methode.
2-DE Ondernemingen De eerste-dimensionele isoelektrisch focusseren (IEF) werd uitgevoerd op Pharmacia Immobiline IPG DryStrip systeem (Uppsala, Zweden) uitgevoerd. Voor de eerste dimensie van de elektroforese werden de monsters met 60 ug eiwit voor analyse gels verdund tot 250 ul met rehydratatieoplossing (7 M ureum, 2% w /v CHAPS, 50 mM DTT, 0,5% v /v IPG-buffer (pH 10/03 niet-lineaire), en spoor broomfenolblauw) voordat u op 13 cm IPG strips (pH3-10 niet-lineair). IEF werd vervolgens uitgevoerd middels IPGphor elektroforese-eenheid volgens de instructies van de fabrikant. Daarna werden de stroken geëquilibreerd met een oplossing (6 M ureum, 30% v /v glycerol, 2% w /v SDS en 50 mM Tris-HCl, pH 8,8), verminderd met 1% w /v DTT gedurende 15 min en gealkyleerd met 2,5% w /v joodacetamide gedurende 15 minuten. Strips werden daarna gespoeld in elektroforese buffer (25 mM Tris base, 192 mM glycine en 0,1% w /v SDS), toegepast op 11% acrylamide gels en afgedicht met gesmolten agarose (0,5% w /v agarose in elektroforese buffer met een spoor van broomfenolblauw). SDS-PAGE werd bij een constante 10 mA /gel uitgevoerd met Hoefer SE 600 verticale kamers en een Tris-glycinebuffer (25 mM Tris en 192 mM glycine) bevattende 0,1% w /v SDS, met een initiële scheiding gedurende 30 minuten, gevolgd door 20 mA /gel. De tweede-dimensionale SDS-PAGE werd ontwikkeld tot de broomfenolblauw kleurstof marker de bodem van de gel had bereikt. De totale looptijd was typisch 4-4,5 uur. Gels werden gefixeerd in 10% v /v azijnzuur, 40% v /v ethanol voor sensibilisatie van 30 min in een buffer die 30% v /v ethanol, 0,2% w /v natrium thiosulfaat en 0,83 M natriumacetaat. Dit werd gevolgd door drie 15 min wassingen in gedeïoniseerd water. De eiwitten werden vervolgens gekleurd met 0,1% w /v zilvernitraat gedurende 20 minuten, tweemaal in gedemineraliseerd water gewassen gedurende 1 min, en ontwikkeld in 2,5% w /v natriumcarbonaat met 0,04% v /v formaldehyde (37% oplossing). De ontwikkeling werd gestopt met 1% v /v azijnzuur, en de gels werden driemaal gewassen in water.
Beeldanalyse en statistische analyse
Umax ImageScanner (Amersham Biosciences) werd gebruikt om de gelen te scannen, terwijl het moederbeeld ™ 2D Platinum Version 5.0 software (Amersham Biosciences) werd gebruikt voor spot detectie, kwantificering en matching. De intensiteit van elke vlek werd gekwantificeerd door% volume. De gegevens werden vervolgens geanalyseerd met behulp van SPSS 11.5 voor Windows en Excel. Student's t
-test werd gebruikt om de verschillen in eiwitgehalte tussen GCA en niet-tumor samples te analyseren, met een betrouwbaarheid van 95%.
MALDI-TOF-MS en database Zoeken

Proteoomanalyse van menselijke maag cardia adenocarcinoom door laser capture microdissectie

onderzoeken

onderzoeken

Other Languages