Analiza Proteome človeške želodčne Cardia adenokarcinom z laserskim zajem mikrodisekcijo

Analiza Proteome človeške želodčne Cardia adenokarcinom z laserjem zajem mikrodisekcijo
Abstract
Ozadje
Incidenca želodčne srčne adenokarcinom (GCA) se je povečala v zadnjih dveh desetletjih na Kitajskem, vendar molekularne spremembe, ki se nanašajo na rakotvornost imajo ni bila dobro označena.
Metode
V tej študiji smo uporabili primerjalno proteomskimi pristop za analizo malignega in nemaligna želodca Cardia epitelijskih celic ločeni z navigacijo laser zajem mikrodisekcijo (LCM) od seznanjenih kirurških primerkov človeške GCA.
Rezultati
Sedemindvajset lise, ki ustrezajo 23 beljakovine so bile dosledno različno urejeno. Petnajst proteine ​​smo pokazali, da se navzgor regulirana, medtem ko smo osem proteini pokazalo, da navzdol regulirano v malignih celic v primerjavi s nemaligna kolumnarnin epitelnih celic. Ugotovljene proteini zdelo, da sodeluje pri presnovi, spremljevalca, antioxidation, signalov, apoptoza, celično proliferacijo in diferenciacijo. Poleg tega so bili izrazi HSP27, 60, in PRX-2 v GCA osebkov dodatno potrjuje imunohistokemičnim in zahodni blot analiz.
Zaključek
Ti podatki kažejo, da je kombinacija navigacija ob LCM z 2-DE zagotavlja učinkovito strategijo za odkrivanje proteine, ki so različno izražene v GCA. Takšni proteini lahko prispeva pri pojasnjevanju molekularne mehanizme GCA rakotvornost. Poleg tega kombinacija zagotavlja možne klinične biomarkerjev, ki pomagajo pri zgodnjem odkrivanju in zagotavljajo potencialne terapevtske cilje.
Ozadje
različne analize podatkov o incidenci raka izločenih iz zahodnih držav so razkrili hitro rastoče stopnje adenokarcinom požiralnika in želodca Kardije v v zadnjih nekaj desetletjih, v primerjavi s stabilnimi in upadala za požiralnika celic skvamozno (SCC) in distalni adenokarcinomom želodca (GDK) [1-3]. Ta pojav se kaže tudi na Kitajskem, le da se zdi, da narašča pojavnost želodca Cardia adenokarcinoma (GCA) precej višja od incidence raka na požiralniku. Dokazi kažejo, da je GCA ločen klinična entiteta, kot so njeni patogeneza in dejavniki tveganja precej razlikujejo od DGA. Zato GCA je veliko bolj razširjena, z višjo pojavnostjo bezgavk metastaz in slabšo prognozo kot DGA [4]. Letna incidenca GCA 50 /100.000 in je lahko celo večja kot 190 /100.000 v več regijah Kitajske [5]. Relativno asimptomatsko narava v zgodnjih fazah bolezni in pomanjkanja ustreznih presejalnih testov so povzročile večini bolnikov GCA diagnozo, da je na že tako napredni fazi bolezni. Tako je treba razumeti molekulsko mehanizem karcinogeneze in identifikacijo biomarkerjev za zgodnje diagnosticiranje in učinkovito zdravljenje človeškega GCA.
Nedavno je proteoma pojavila kot komponento komplementnega genoma. Predpostavka je, da bi lahko občutno pomaga pri razkrivanju biološkim in fiziološkim mehanizmov kompleksnih multivariatnih bolezni na funkcijski molekularnem nivoju. Čeprav se lahko genetske mutacije in /ali Potepuški izražanje genov osnova za bolezen, so biokemične podlage za večino bolezni, ki jih povzročajo okvare beljakovin. Zato bi analiza globalnega beljakovin številčnosti v človeških tumorjev, ki se imenuje rak proteomika, ponujajo veliko priložnosti in izzivov, pri prepoznavanju novih tumorskih označevalcev in terapevtskih ciljev, kot tudi pri razumevanju tumorja patogenezo. Trenutno dvodimenzionalna gelska elektroforeza (2-DE) in masne spektrometrije (MS) so najpogosteje zaposleni orodja za ločevanje in identifikacijo proteinov. Vendar heterogenost je vedno problem v študijah človeškega tkiva tumorja. Čeprav je celična kultura je en pristop, da bi rešili ta problem, morda ne bo natančno predstavljajo molekularnih dogodkov, ki se odvijajo v samem tkivu, iz katerega so bili oblikovani [6]. Primerjava med celičnih linij človeških prostate in tumorskih celic iz istih bolnikov je pokazala, da je bilo 20% profilov proteinskih spremenila [7]. zajem Laser mikrodisekcijo (LCM) je nedavni razvoj, ki se lahko uporabijo za nabavo zelo reprezentativen subpopulacijo celic iz kompleksnih vzorcev heterogenih tkiva [8]. Ta tehnologija je bila zelo uspešno uporabljena v raznoliko paleto študij z uporabo prodajnega analizo na DNA in RNA, vključno z globalno genske ekspresije profiliranje [9] in analize proteoma prostate [7], debelega črevesa [10], hepatocelularnih [11 ], prsi [12], in tumorjev trebušne slinavke [13]. Vendar pa je kombinacija 2-DE in MS še nikoli ni bil uporabljen za preučevanje človeškega GCA.
Namen te študije je predstaviti karcinogenosti GCA in opredeliti GCA-specifične proteine ​​povezano bolezni kot potencialne klinične bioloških označevalcev za zgodnje odkrivanje in nove terapevtske cilje. Izvedli smo prikrmarili LCM obogatiti tako maligne in nemaligna želodčne srčne epitelijskih celic iz seznanjenih kirurških primerkov človeške GCA. Proteini pridobljeni iz teh celic ločimo z 2-DE. Diferencialne proteinske lise so označene z peptid množično prstnih odtisov (PMF), ki temelji na matrični pomaga lasersko desorpcijo /ionizacijo časa z letom masne spektrometrije (MALDI-TOF MS) in iskanje po zbirkah podatkov. Veljavnost teh ugotovitev je potrdil imunohistokemijske in zahodno-blot analiz.
Metod
Materiali
so IPG trakov (pH 3-10 nelinearno) in IPG pufrske raztopine (pH 3-10 nelinearno), kupljene od Amersham Pharmacia Biotech (APB, Švedska). DTT, urea, thiourea, Tris baze, TX-100, kavbojke, glicin, akrilamid, metilenbisakrilamid, SDS, TEMED, amonijev persulfat, srebrov nitrat, tripsin (sekvenciranje razred), ACN in TFA smo nabavili pri Sigma (St. Louis, MO, ZDA). Nazadnje je bila popolna inhibitor proteaze koktajl iz Roche (Lewes, UK). razred Milli-Q voda je bila uporabljena za vse rešitve.
GCA vzorcev
Devet parov človeške želodčne Cardia adenokarcinom in njihovih bližnjih nontumourous Cardia tkiva so bili pridobljeni v 30 minutah po kirurški odstranitvi na drugem povezana bolnišnici Xi " Jiaotong Univerza v letu 2005 (tabela 1). Da bi se izognili očitne področja razjede ali nekroze, so bili vzorci nabavljeno od robov tumorjev. So bili takoj zamrznili v tekočem dušiku in shranili pri -80 ° C do uporabe. Obveščeni soglasja so bili pridobljeni iz vseh bolnikih. Medtem, dve izkušeni patologi ocenili ocenjevanje tumorja z mikroskopskim pregledom samples.Table 1 kliničnih in histoloških podatkov vzorcev tumorjev bolnikov
Case

Age

Gender

Locationa)

Size(cm)

Grade

1
58
M
Within 2 cm gej
1,5 × 2
Zmerno razlikujejo
2
63
M
V 2 cm gej
5 x 6
zmerno razlikuje
3
46
M
v 2 cm gej
4 x 5
zmerno razlikuje
4
60
M
v 2 cm gej
2 x 2,5
dobro diferenciran
5
73
M
v 2 cm gej
3 × 1
dobro diferenciran
6
70
M
v 2 cm gej
2 × 1
dobro diferenciran
7
55
M
v 2 cm gej
2 x 3
Slabo diferencirano
8
51
M
v 2 cm gej
4 x 6
Slabo različen
9
63
M
v 2 cm od gej
3 x 2,5
Slabo različen
a) Lokacija: epicenter tumorskega tkiva
so priprava vzorcev za LCM
oddelkih (8 um debela) zmanjšati na diapozitive (predočiščene uporabo detergenta, izperemo z deionizirano vodo in namočeno v etanolu) pri uporabi Leica CM 1900 kriostat (temperatura komora -28 ° C). Oddelki so bili bodisi shranjena pri -80 ° C ali hranijo v kriostat komori pred LCM. Hematoksilinom obarvanje je bila izvedena zgolj za spremljanje odsekov tkiv in ni bila uporabljena v povezavi z LCM. Oddelki so bile določene (70% etanol za 1 min), hematoksilinom obarvajo in dehidrirani (70% etanol za 45 s, 95% etanol za 45 let, 2 x 100% etanola pri 30-ih, in sledi ksilenove 2 × za 5 min). Medtem so bili uporabljeni neobarvano sekcije za LCM. So bile določene (70% etanola v 30-ih), sprali z deionizirano vodo za 10s in dehidriran (70% etanola za 15s, 95% etanola za 15 let, 2 x 100% etanola za 15 let, čemur sledi ksilenove 2-kratni povečavi 1 minuto ). Popolne zaviralci proteaz koktajl tablete so
navigacija ob LCM
Po določitvi in ​​dehidracija, so neobarvano sekcije posušimo na zraku in microdissected pomočjo sistema Arcturus PixCellα (Arcturus, Mountain View, CA, ZDA). LCM mikroskop posnel v hematoksilina Obarvani del, ki mejijo na eno od obresti. Ta slika je bila prikazana na LCM računalniškem zaslonu z uporabo LCM programsko opremo za analizo slike (Arcturus, ZDA) in je bila uporabljena kot zemljevid razmejiti območje za seciranje na sosednji neobarvano oddelku. Oddelki so bili nato posnete z 15 um Premer laserskega žarka tipično pri 50-80 mV moči z impulzom, ki traja 3-10 ms v načinu pištolo stroj in z lasersko strelni frekvenco 1 strel na 500 ms. V povprečju so bili sprejeti med 10,000-12,000 posnetkov na kapo, in približno 25,000-30,000 celice so bili pridobljeni na kapo. Vsak pokrov je bil posnet v eni uri. Na podlagi skrbnega pregleda histološke sekcije, je bila vsaka seciranju ocenjuje, da vsebuje ≥ 95% želenih celic.
Mikrodisekcijo kape so bili vstavljeni v 0,5 ml mikrocentrifugirkah vsebujejo 50 uL iz liznega pufra (7 M urea, 2 M thiourea, 4% m /v CHAPS, 65 mM DTT, 0,5% v /VTX-100, 40 mMTris baza, in popolno proteaze koktajl inhibitor). Nato smo celice raztapljali z obračanjem cevi sledi vortex-mešalne za 1 minuto in kratko pulzno-centrifugiranjem pri 12, 000 × g. Potem so tkiva iz več pokrove (približno 800.000 ~ 1.000.000 celic), pridobljeni v istem lize pufrom, dokler je bilo zbranih dovolj snovi. Vzorce smo centrifugirali pri 40000 x g 1 uro pri 4 ° C. Kadar je to potrebno, smo supernatante shranjena pri -80 ° C do nadaljnje uporabe. koncentracija proteinov smo določili z metodo Bradford.
2-DE
prvi dimenzionalni izoelektričnem fokusiranju (IEF) je bila izvedena na Pharmacia Immobiline IPG DryStrip sistema (Uppsala, Švedska). Za prvo razsežnosti elektroforeza, so bili vzorci, ki vsebujejo 60 ug protein za analitične geli razredčili do 250 ul z raztopino rehidracije (7 M uree, 2% w /v CHAPS, 50 mM DTT, 0,5% v /v IPG pufra (pH 3-10 nelinearno) in sledi Bromophenol modra) pred nakladanjem na 13 cm IPG trakov (pH3-10 nelinearnih). IEF je bila nato izvedena z uporabo IPGphor elektroforezo enoto v skladu z navodili proizvajalca. Zatem so trakovi uravnotežili z raztopino (6 M uree, 30% v /v glicerol, 2% m /v SDS, in 50 mM Tris-HCl, pH 8,8), zmanjšan z 1% w /v DTT 15 min in alkilirana z 2,5% m /v jodacetamid 15 min. Trakove smo nato splaknemo v elektroforeznem pufru (25 mM Tris baze, 192 mM glicin in 0,1% m /v SDS), ki se uporabljajo za 11% akrilamida geli in zatesnjena s stopljenim agaroze (0,5% m /v agaroze v elektroforeza pufer, ki vsebuje sled Bromophenol modro). SDS-PAGE smo izvedli ob uporabi Hoefer SE 600 vertikalne komore in Tris-glicin pufra (25 mM Tris in 192 mM glicin), ki vsebuje 0,1% m /v SDS, z začetnim ločevanja pri konstantni 10 mA /gel za 30 minut, čemur sledi 20 mA /gel. Drugi-dimenzionalni SDS-PAGE smo razvili dokler je Bromophenol dvojno podajo modro barvilo doseže dno gela. Skupni čas delovanja je običajno 4 do 4,5 ure. Geli so bile določene v 10% v /v ocetne kisline, 40% v /v etanol pred senzibilizacijo za 30 min v pufru, ki vsebuje 30% v /v etanol, 0,2% m /v natrijevega tiosulfata in 0,83 M natrijev acetat. Temu je sledila tri 15 min opere v deionizirani vodi. Proteine ​​smo nato obarvamo z 0,1% m /v srebrovega nitrata za 20 minut, dvakrat izperemo z deionizirano vodo za 1 minuto, in razvili pri 2,5% m /v natrijevega karbonata, ki vsebuje 0,04% v /v formaldehid (37% -na raztopina). Razvoj smo ustavili z 1% v /v ocetne kisline in geli izperemo trikrat z vodo.
Analize slike in statistične analize
Umax ImageScanner (Amersham Biosciences) je bila uporabljena za skeniranje gela, medtem ko Image Master ™ 5.0 software 2D Platinum Version (Amersham Biosciences) je bil uporabljen za detekcijo kraju samem, količinsko in usklajenost. Intenzivnost vsake točke je količinsko volumskih%. Podatke smo nato analizirali s pomočjo SPSS za Windows 11.5 in Excel. Študent je t
-test je bila uporabljena za analizo razlike v stopnjah beljakovin med GCA in ne-tumorskih vzorcev, s stopnjo zaupanja 95%.
MALDI-TOF-MS in iskanje baze podatkov
dosledno in bistveno drugačen vložki izbrani za analizo MALDI-TOF MS. Proteinske lise obresti so izrezali in sesekljamo na majhne koščke, nato pa za razbarvanje in speremo z deionizirano vodo večkrat, dokler se rumena barva izginila. Gel kosov smo nato speremo z 25 mM amonijevega bikarbonata, dehidrirani z ACN in sušimo v vakuumski centrifugi. Zatem so beljakovine v-gelu razgradili z 0,02 ug /ul tripsinom čez noč pri 37 ° C. Triptičnih peptidov smo nato ponovno raztopimo v raztopini, ki vsebuje 50% v /v ACN in 0,2% v /v TFA. A 2 jul Alikvot smo opazili na vzorčno ploščo s 4 ul matrični raztopini CHCA (a-ciano-4-hydroxcinnamic kisline, 10 mg /ml v 50% v /v ACN, 0,2% v /v TFA) in pustimo, da se zrak suha. Posušene lise smo nato analizirali v Voyager DE MALDI-TOF MS (Framingham, MA, ZDA). Temu je sledilo tekmovanje v teku spektrometer na pozitiven način ion in v načinu reflektor z naslednjimi nastavitvami: pospeševalna napetost 20 kV; Gride napetosti, 94%; vodnik žice napetost, 0,01%; in zamuda 200 ns. Spektre smo ročno pridobili z intenzivnostjo lasersko nastavljeno na 3200 s 80 posnetki na spektra. Nato se je masa območje določi med m
/z
500 in m
/z
je 5000. Notranji kalibracija uporabi z angiotenzina II in insulin B verige vrhove pri 912.08 Da in 3495.95 Da, v tem zaporedju.
beljakovine so označene z peptidov množično prstnih odtisov s programom za iskanje Aldente [14], z uporabo naslednje moznosti iskanja: SWISS-PROT in TrEMBL so bili uporabljeni kot zbirk protein zaporedja; so dovoljena masa toleranca 100 ppm in eno nepopolne cepitev; carboxyamidomethylation, oksidirani metionin in fosforilacija je štelo, da morebitne spremembe; minimalno število ujema peptidov je 4; in peptid ion je [M + H] +.
Imunohistokemično in western blot analizo
Za potrditev ekspresijskih vzorcev treh proteinov v GCA tkivih, smo imunohistokemija izvedemo z uporabo formalinu fiksne in parafin vgrajeni tkiva osebki, ujema z 2-DE vzorcev. Razvoskanega 5 um debele odseki smo obdelovali z 0,3% vodikovega peroksidaze 3 minute in protitelesa zaporni 30 minut. Po toplotno posredovano pridobivanje antigenov so odseki inkubirali s primarnim protitelesom pri 4 ° C čez noč, kot sledi: HSP27 (Sigma, St. Louis, MO, ZDA), 1: 500; Hsp60 (Santa Cruz, Amerika), 1: 300; in PRX-2 (Santa Cruz, Amerika), 1: 150. Odseki smo nato inkubirali s-peroksidaze označenega protitelesa (1: 500). Razvijemo z diaminobenzine in jih nasprotno s hematoksilinom
Za zahodni blot analizo so bili vzorci proteinske (30 ug), uporabljene v 2-DE teči 12% SDS-PAGE, prenese na PVDF membrano in nato blokirali s PBS /5% posnetega mleka /0,01% Tween 2-4 ur pri sobni temperaturi. Primarna protitelesa smo razredčili v blokirnem pufru ter dodamo takole: HSP27, 1: 200; Hsp60, 1: 300; in PRX-2, 1: 200. Nato se je inkubiran s hrenovo peroksidazo (HRP) označenih s sekundarno protitelo in HRP-konjugiranimi anti-GAPDH /beta-aktina protitelesa za potrditev enako beljakovin nalagajo v vsakem pasu za 1-2 ur pri 37 ° C ali na sobno temperaturo. Vzorci so bili sprani in odkrite okrepljenega kemiluminescence za 30-60 s (Minipore).
Rezultati
profila razlike med navigacija LCM vzorcev in celih undissected kriostat tkiv
Za oceno učinkov navigacija ob LCM o profilih tkiva beljakovine, smo izvedli 2-DE proteinskih profilov celih undissected kriostat tkiv in LCM-vzorcev GCA. Slika 1 prikazuje primer navigacija ob procesu LCM. Večina lis odkritih v razkosanih ne-tumorskih in tumorskih tkivih, je mogoče opaziti v celih undissected kriostat tkiv, razen različnih mestih. Vendar pa še vedno najdemo v celotnem undissected kriostat tkiva, ki jih ni bilo mogoče opaziti v obeh LCM vzorcev nekatere lise. Tako lahko ta tehnologija obogati ne samo zunaj in tumor epitelne celice, vendar lahko tudi zmanjša onesnaženje v tkivih, kot so hemoglobin [10, 11]. Poleg tega bi lahko pluje proces LCM odpravljajo učinke obarvanje za ločevanje proteinov z 2-DE [15]. Tako so naši podatki potrjujejo, da je treba za opravljanje katerih se navigacija LCM v proteomskimi študij GCA tkiv. Slika 1 navigacija ob laser zajem mikrodisekcijo tumorskega tkiva. (A) hematoksilina obarvanih želodčne Cardia adenokarcinom; (B) neobarvano GCA tkiva; (C) tumorja tkiva po mikrodisekcijo; (D) Zajeto tumorske celice na LCM filmu.
Profila razlike v izražanju proteinov med GCA tkiv in okoliških non-tumorskih tkivih
smo izvedli navigacija LCM in 2-DE za izravnanih parov tumorskih tkiv in okolici ne- tumor tkiva iz bolnikov GCA. Približno 800-1,000 proteinske lise so odkrili barvanje s srebrom. Za merjenje ponovljivosti, vsak vzorec doživela poskusa trikrat. Bilo je 905 ± 74 in 867 ± 51 proteinske lise na zemljevidu GCA in ne tumorjev želodca srčnega tkiva oz. Izravnana lise so 799 ± 29 in 727 ± 34 ločeno in pripadajoča povprečna stopnja ujemanja je bila 88,2% in 83,8%. Poleg tega je bila povprečna deviacija položaj izravnanih madežev 1,031 ± 0,205 mm in 1,44 ± 0,11 mm pri IEF in SDS-PAGE smeri oz. Čeprav je slikovna analiza je pokazala, da so bili ti 2-DE zemljevidov ponovljiv, so bile majhne razlike v intenzivnosti in števila lis. Kljub temu, analiza gelov pokazala 27 proteinske lise, katerih intenzivnost znatno in dosledno razlikovala med dolgoročnimi tumorja in tumorskih tkivih (sl. 2). so bile izračunane razmerja normiranih kraju samem intenzivnosti raka na paraneoplasis tkiv za vsako od proteinov interesa. so bili izbrani, lise, ki kažejo razliko dvojni in s statistično značilno (0,05 p <). Tri rezultatov 2-DE smo potrdili z analizami imunohistokemični in western blot. Slika 2 2-DE zemljevid malignega in nemaligna želodca Cardia tkiva. Vsi zemljevidi prikazani pripravimo iz istega pacienta. (A) 2-DE karta celih undissected kriostat tkivih; (B) 2-DE karta ni tumorsko tkivo po LCM; (C) 2-DE zemljevid GCA tkiva po LCM. Identifikacija
Protein
obeh celih undissected kriostat osebkov in LCM-osebkov so bili uporabljeni za identifikacijo proteinov. Sedemindvajset različna proteinska pike med GCA tkiv in okoliških non-tumorskih tkivih so izrezali. Vendar pa je bilo le 23 proteine ​​označene z MALDI-TOF-MS (tabela 2). Ta pojav je verjetno posledica post-translacijskih modifikacij kot peroxiredoxin 1 (PRX-1), ki je bila prisotna v dveh sosednjih vložkov (sl. 2, naključnem 11). Te beljakovine so bile razvrščene v kar koli od naslednjega: celično proliferacijo in diferenciacijo (ANXA2, ANXA4, hnRNPA2 /B1), apoptozo (PRX-1, PRX-2, GSTP, VDAC, ETFB), metabolizem (ADH1C, AKR1C3, CA2, GATM ), proteaza povezana (CTSD, PACSIN1), cystoskeleton (aktina 1, Keratin 8), chaperones (HSP27, 60, 70, PDIA3) in RNA zavezujoča in prepis (hnRNPH3, PCBP1, ENO1). Slika 3 prikazuje PMF zemljevide HSP60.Table 2 proteinov z različno ekspresijo med GCA tumorskih tkiv in sosednjih seznanjenih non-tumorskih tkivih, ki so bile ugotovljene s MALDI-TOF MS
Up-uredbo proteini
kraju samem št
Protein
pristop No.a)
g /PIB)
Match
cov (%) c)
T-Test
obrok (tumorja ne /tumorja) Pomeni ± SD
1
Toplotni šok protein beta-1 (HSP27) *
P04792
23 /6.0
9
54
0,0040
3,4279 ± 2,0727
2
Toplotni udar 70 kDa protein 5 (Hsp70)
P11021
70 /5.0
22
42
0,0030
3,2597 ± 1,5314
3
60 kDa protein toplotnega šoka (hsp60) *
P10809
58 /5.2
12
37
0,0001
2,8308 ± 1,1426
4
protein disulfid izomeraze A3 (PDIA3) *
P30101
54 /5.6
13
41
0,0280
4,2105 ± 2.7294
5
aneksin A4 (ANXA4)
P09525
36 /5.8
10
34
0,0140
4,7153 ± 7,3434
6
aneksin A2 (ANXA2)
P07335
38 /7.5
7
26
0,0150
6,0722 ± 5,5431
7
heterogena jedrske ribonucleoproteins A2 /B1 (hnRNP A2 /B1 ) *
P22626
37 /9.0
16
43
0,0050
10,7775 ± 9,5547
8
katepsina D težke verige (CTSD)
P07339
27 /5.6
12
61
0,0012
4,3552 ± 3,7703
9
protein kinazo C in kazein kinaze substrat v nevronih protein 1 (PACSIN1)
Q9BY11
51 /5.1
5
24
0,0028
2,6026 ± 1,2147
10
glutation S-transferaza P (GSTP) *
P09211
23 /5.4
5
44
0,0026
3,8757 ± 2,2198
11
Peroxiredoxin-1 (PRX-1) *
Q06830
22 /8.3
8
59
0,0140
4,2744 ± 4,1568
12
poli (rC) -binding protein1 (PCBP1) *
Q15360
37 /6,7
12
63
0.0070
2,7401 ± 0,5321
13
Aldo-keto reduktaze družine 1member C3 (AKR1C3)
P42330
37 /8.1
7
25
0,0040
2,7762 ± 1,1820
14
Glycineamidinotransferase (GATM)
P50440
44 /6.4
8
23
0,0390
2,7839 ± 0,4680
15
Keratin, tip II citoskeletnim 8 (Keratin 8) *
P05787
54 /5.5
9
25
0,0020
3,5063 ± 0,6423
Dol-regulacijski proteini
16
aktina , citoplazemska 1 (aktina 1) *
P60709
42 /5.3
6
30
0,0160
0,2603 ± 0,1539
17
Heterogeni jedrskih ribonucleoproteins H3 (hnRNPH3)
P31942
37 /6.4
5
28
0,0015
0,6028 ± 0,6229
18
Peroxiredoxin-2 (PRX-2) *
P32119
22 /5.7
6
24
0,0250
0,2376 ± 0,1202
19
ogljikove anhydrase2 (CA2) *
P00918
29 /6.8
6
33
0,0130
0,3675 ± 0,1270
20
Alpha-enolazni * (ENO1)
P06733
47 /7.0
16
42
0,0030
0,2898 ± 0,1340
21
alkohol dehidrogenaza 1C (ADH1C)
P00326
40 /8.6
7
49
0,0280
0,2287 ± 0,1680
22
Electron prenos flavoprotein podenote b (ETFB)
P38117
28 /8.3
6
26
0,0240
0,2655 ± 0,1415
23
napetost odvisna od anion selektiven kanal (VDAC) *
P21796
31 /8.6
7
39
0,0120
0,4474 ± ​​0,0297
a) Swiss-Prot pristopu ni.
b ) Teoretična vrednost
c) Zaporedje pokritost%
* proteini so ugotovili raka želodca prej.
Slika 3 identifikacijo MALDI-TOF MS v mestu 3, v GCA.
Imunohistokemijsko in zahodni analiza blot za HSP 27, 60, in PRX-2 v GCA
za dodatno raziskati, ali HSP27, 60, in PRX-2 so izražene v tkivih in določi, katere celice izražajo te beljakovine, je imunohistokemični analiza je bila opravljena s pomočjo formalinu fiksno in paraffin- vgrajeni vzorci tkiva, ki so se ujema z 2-DE vzorcev. Izraz HSP27 in 60 je mogoče videti v vseh cytoplasms iz celic karcinoma, pri čemer ga je mogoče videti v nekaterih cytoplasms iz nosilnega epitelnih (sl. 4A-D) v ne-tumorskih tkiv. V nasprotju s tem, PRX-2 je bila skoraj nismo našli izraženi v celicah karcinoma, temveč v nekaj cytoplasms kolumnarnin epitelnih celic (sl. 4E, F). Preučiti te ravni izražanja beljakovin, je western blot analiza je bila opravljena tudi z uporabo enakih tkiva (sl. 5). Kot je bilo pričakovati, je bilo ugotovljeno, HSP27 in 60, ki se vedno zelo izražene v tumorskem tkivu, medtem ko je bila PRX-2 zatreti. Slika 4 Imunohistokemijsko analiza za HSP27, 60, in PRX-2 v humani normalni želodčne Kardije in GCA. Izrazi HSP27 (A), 60 (C), in PRX-2 (E) sta v citoplazmi tumorskih celic; Izrazi HSP27 (B), 60 (D) in PRX-2 (F) so bile ugotovljene v citoplazmi normalnih kolumnarnin epitelnih celic; Povečave: A-F × 40, jih nasprotno s hematoksilinom
Slika 5 Western blot analizo za potrditev povečano izražanje HSP27, 60, in zmanjšano izražanje PRX-2 v GCA tkivih.. . GAPDH in β-aktina so bili uporabljeni kot sklicevanja
Razprava
Kardije je anatomsko obmejni med požiralnika in želodca; s tem, da je konstantna polemiko v zvezi z njuno razmerje v smislu epidemiologije, kliničnih znakov in razvrščanje med požiralnika adenokarcinom (EA), GCA in DGA. Za primerjavo njihovih proteinskih profilov, smo iskali literaturo, da bi našli te beljakovine. Trinajst od 23 proteini so našli v DGA prej (tabela 2). Med njimi je HSP27, 60, 70, PDIA3 in CA2 imajo enak izraz vzorec v GCA in DGA. V nasprotju s tem pa je bila ekspresija nizko raven HSP27 dalo v EA [16-20]. Zato je tumourigenesis za GCA se razlikuje od EA in DGA, zato bi GCA biti ločen patološki subjekt.
Cellular heterogenost je bila velika ovira za molekularno analizo normalnih in obolelega tkiva. Prvi opisal Emmert-Buck et al. v letu 1996, laser zajemanje mikrodisekcijo je močan in natančen tehnika se uporablja za preučevanje beljakovin spremembe v določeni podskupini celic v sistemu malo vzdrževanja, ki je enostaven za upravljanje [8]. Kot ponavadi, so različni histokemijske madeži razdelka tkiva se uporablja za vodenje procesa razkosavanjem. Vendar pa je več primerov pokazale zmerno do dramatične učinke madeži na ločevanje beljakovin za 2-DE [21, 22]. Da bi odpravili madeže kot potencialno škodljiv učinek, na katerih se navigacija LCM je bil pred kratkim razvit. Uporablja Obarvani del za vodenje razrezom neobarvano sosednjih vzorcu [23]. Ta tehnika je bila uspešno uporabljena v študiji možganskih vzorcev [15]. Poleg tega zaradi tipične morfološke značilnosti želodca srčne površnega nosilnega celice in srčne žleze, so zlahka identificirati na dehidriranega odseku brez obarvanje. Zato pluje LCM postal optični strategija v naši proteomiki pristop. V tej raziskavi, je število-LCM pridobljeni nemaligna in malignih celic bistveno spreminjala in so bila pogosto majhen v primerjavi s celotno undissected kriostat tkiva, ne glede na profile, ki so zelo podobni med vzorci LCM in undissected narave. Ta je pokazala, da lahko pluje LCM izvedljiva pristop za preučevanje želodca srčnega tkiva in da je to v skladu z 2-DE in MALDI-TOF MS.
Smo pridobili prepoznavnost beljakovin GCA s primerjavo spremembe v proteinu profili obkroža niso tumorskih tkiv. Da bi zmanjšali individualne razlike, so bili vzorci tkiva pridobljeni iz istega bolnika, ki nam omogoča, da preuči diferencialno izražanje proteinov pod podobnim genomske ozadju. Kolikor nam je znano, smo poročali o prvi proteomskimi analizo GCA. Od 27 izbrane proteinske lise smo 23 beljakovine v molekularni masni razpon od 15 do 75 kDa ter z izoelektrično točko med 3 in 10 označene z 2-DE in MALDI-TOF MS. Večina teh proteinov smo že prej opisali kot različno izražena bodisi na nivoju mRNA ali na ravni proteina v drugih vrstah raka pri človeku.
HSPs skupina stresnih proteinov z različnimi vrstami okoljskih in patofiziološke žaljivk induciranih. V tej študiji so co-up-predpisi HSP27, 70 in 60 najdemo v želodcu srčnih tumorskih tkiv. Kot chaperones bi HSP27 in HSP70 zavirajo apoptozo, ki v stiku z apoptosome in na kaspaze aktivacije kompleksne [24], ki je podlaga njihove vloge pri napredovanja tumorja in odpornosti na zdravljenje [25]. Številne študije kažejo, da HSP27 in Hsp70 overexpressions signala slabo prognozo in napovedujejo slabo odziva na kemoterapijo. Zdi se hsp60, da je ključno endogenega vnetni mediator in je verjetno sprosti poškodovanih celic. Poleg tega, skupaj z HSP70, hsp60 ima vlogo pri predstavitvi antigena v malignih bolezni [26]. HSPs so prekomerno tudi v dojke, debelega črevesa, želodca in raka prostate [10, 25]. Zato lahko čezmernim HSP27, 70 in 60 bodo uporabne biomarkerjev za rakotvornost pri GCA in je lahko povezana s stopnjo diferenciacije in prognozo GCA.
Med identificiranih proteinov, dve proteine, vpletene v regulaciji transkripcije in izraz tumor povezan genov. PCBP1, up-urejena v GCA, je RNA chaperone post-transkripcijski regulator. Dokazano je bilo, da PCBP1, skupaj s PTB-1 in hnRNPK, nadzira nekatere proto-onkogena genov in v zvezi z apoptozo genov izraz, kot so Bag-1, C
myc aPAF-1, XIAP in DAP5, s spodbujanjem delovanje notranjega vstopne ribosomsko segmenta (IRES). PCBP1 je potrebna za odpiranje RNA v regiji, ki vsebuje okno vhodne ribosoma, medtem ko se PTB-1 lahko zahtevajo za ribosoma zaposlovanje [27, 28]. V zadnjem času, Pickering, B.M. et al. opisano, da bi se glikan deli PCBP1 povezane z metastatskim sposobnosti in lahko igrajo vlogo pri jetrnih celic karcinoma metastaz [27]. Nato lahko navzgor regulacija PCBP1 regulirati pokrova neodvisen mehanizem prevajalske začetku srčnih tumor povezan genov pri razvoju GCA. Kot zaviralnih lahko alfa-enolazni regulirati aktivnost promotor c-myc v obliki c-myc vezavnega proteina (MBP-1). MBP-1 lahko nato veže na P2 element promotor c-myc in tekmujejo z vezivnim TATA-box proteina (TBP) za zaviranje transkripcijo c-myc [29, 30]. Po drugi strani pa navzdol regulacijo Alpha-enolazo v skladu z delom Chang YS et al.

• Klinični pomen paliativne želodca o preživetju bolnikov z neozdravljivo napredovalim rakom želodca: sistematični pregled in meta-analysis
• MicroRNA-645, up-urejena v človeški adencarcinoma želodčne požiralnika križišča, zavira apoptozo z usmerjanjem zaviralnih IFIT2